酶的分离纯化层析技术PPT讲稿
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酶的分离纯化层析技术课件
第四章 层析技术
引言 层析法的基本原理 层析法的分类
引言
层析法的发现与进化历史
思想
层析法的基本原理
根据引言内容,是否可以总结 概括出层析法的基本原理？
层析法的分类
第一节 吸附层析技术 第二节 分配层析技术 第三节 凝胶过滤层析技术 第四节 离子交换层析法 第五节 亲和层析法 第六节 高压液相层析（HPLC）
常温
化工分析，环境 生物分子，蛋白核 利用混合物中各组分物物理理、、化化学学性性质质 （如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分 配系数等）的差异使各组分在两相（固定相和流 动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同 的速度移动而达到分离的目的。
层析法的分类
（1）按流动相状态分类：
探索与发现 5
气相色谱的产生(GC)
1952年，马丁同詹姆斯(James)，把 LLC技术原理应用在分离气体上。
各种气体或蒸汽的混合物利用氮或氦一 类情性载气的气流通过吸收性固体的表 面。混合的气体通过后,在另一端出现时 就分开了。
探索与发现 6
高效液相色谱(HPLC)的应用
20世纪60年代以来,气 相色谱作为分析方法已 经不能满足对生物成分 分析测试的要求。
吸附柱层析
一、常用术语
2.洗脱体积（Ve）： 是指某一成分从柱顶部到 底部的洗脱液中出现浓度 达到最大值时的流动相体 积。
第一节 吸附层析技术
吸附柱层析
√ 吸附薄层层析
聚酰胺薄膜层析 疏水层析
薄层层析(TLC)
薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载 体上的基质为固定相，以液体为流动相的一 种层析方法。
吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相， 以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱状的 一种层析方法。
常用的吸附剂有羟基磷灰石、硅胶、 氧化铝、人造沸石和活性炭等。
这种层析方法已成为科研、医学、化 工及发酵等部门常规使用的一种分离手段。
吸附柱层析
一、常用术语 1.层析：以基质为固 定相（柱状或薄层 状），以液体或气体 为流动相，有效成分 和杂质在这两个相中 连续多次地进行分配、 吸附、交换作用，最 终结果是使混合物得 到分离。
Why not Tswett?
相同时期发生在中国大地的事件
1894年：中日甲午战争,侵占台湾。 1897年：德国侵占胶州湾。 1900年：八国联军侵略中国。 1914年：占领青岛,夺取胶州湾。 1931年：九一八事变,占领东北,建立满州国。 1937年：卢沟桥事变。
探索与发现 4 羊毛中的氨基酸分离
提出色谱塔板理论;预测气相色谱;提出用细小颗 粒作填料,而两端可以加压(HPLC).
1952年：马丁，辛格对分配层析的研究和发现，诺贝尔化学奖
塔板理论
将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏 塔的塔板间移动，在每一个塔板内不同组分分 子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动 相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下 一个塔板，并不断形成新的平衡
薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，类 似纸层析。
层析技术
√ 第一节 吸附层析技术
第二节 分配层析技术 √ 第三节 凝胶过滤层析技术
第四节 离子交换层析法 第五节 亲和层析法 √ 第六节 高压液相层析（HPLC）
第一节 吸附层析技术
√ 吸附柱层析 √ 薄层层析
聚酰胺薄膜层析 疏水层析
吸附柱层析
引言
探索与发现 1
1850年德国科学家朗格首先发现了色 谱分离的现象，当他把一种有颜色的 物质滴到一张滤纸上，观察到它们扩 散成一圈圈的圆环。
探索与发现 2
1906年俄国植物学家茨维特（Michael Tswett）:
将碳酸钙细粉装入玻璃瓶， 石油醚抽提叶子的色素溶液倾入， 接着倒入石油醚洗涤， 柱上部出现了绿色的叶绿素，
高效液相色谱采用了压 力泵及填有很细的颗粒 高效色谱柱。High Performance Liquid Chromatography.
液相色谱与气相色谱法比较
对象 固定相 流动相 环境 应用
气相
液相
气体,沸点低
液相,沸点高
固体,固体涂层液 固体,固液
惰性气体,起运载 作用
高温
液体，与组分可产 生亲和力
1941年生物化学家Martin（马丁）和Synge （辛格）把色谱法应用于氨基酸的分离。
将淀粉作为色柱里的填料:淀粉色谱法 滤纸作为载体: 纸色谱法 覆盖了吸附剂表面的并与流动相不发生混溶的 固定液来代替以前的固体吸附剂:Liquidliquid(partition)Chromatography,LLC).
液相色谱 液-固层析 液-液层析
气相色谱 气-固层析 气-液层析
两种固定相：(固定相不一定是固体) *固体吸附剂作为固定相 *吸附在固体上的液体（硅胶吸附的水作固定相， 以氯仿作流动相，分离羊毛中的氨基酸 ）
（2）按层析原理分类：
吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能 的差异，达到分离鉴定的目的。
薄层层析可根据固定相的种类分为吸附 薄层层析（吸附剂为固定相）、分配薄层层 析（固定在支持剂上的水溶液或有机溶剂为 固定相）和离子交换薄层层析（离子交换剂 为固定相）等。
薄层层析
薄层层析的优点： 1.展层时间短，薄层层析分离混合物一般 仅 需15-60min； 2.设备简单，操作方便，既适用于分析，也 适用于制备； 3.灵敏度高。
中间是黄色的叶黄素， 而在下面则是胡萝卜素橙黄色
色带叫作“色谱”， 方法叫色谱法（Chromatography), 层析法 。
概念:
固定相, 流动相,色谱柱
Which is which?
图有误
现代色谱柱
探索与发现 3
1905-1930. Who cares! Why？
论文发表在不 知名的期刊上
1931年德国库恩(Kuhn)重复了茨维特实验, 用氧化铝和碳酸钙分离了α-,β-,和γ-胡萝卜 素，此后用这种方法分离了60多种这类色素， 1938年他从维生素 B 中分离出 B 6. 1938年的诺贝尔化学奖。
分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间 的分配系数（或溶解度）不同。
离子交换层析:利用不同组分对离子交换剂亲和 力的不同。
凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组 分阻滞作用的不同。
（3）按操作形式不同分类：
柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方 向移动而达到分离。
纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流 动相展开，以达到分离鉴定的目的。
第四章 层析技术
引言 层析法的基本原理 层析法的分类
引言
层析法的发现与进化历史
思想
层析法的基本原理
根据引言内容,是否可以总结 概括出层析法的基本原理？
层析法的分类
第一节 吸附层析技术 第二节 分配层析技术 第三节 凝胶过滤层析技术 第四节 离子交换层析法 第五节 亲和层析法 第六节 高压液相层析（HPLC）
常温
化工分析，环境 生物分子，蛋白核 利用混合物中各组分物物理理、、化化学学性性质质 （如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分 配系数等）的差异使各组分在两相（固定相和流 动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同 的速度移动而达到分离的目的。
层析法的分类
（1）按流动相状态分类：
探索与发现 5
气相色谱的产生(GC)
1952年，马丁同詹姆斯(James)，把 LLC技术原理应用在分离气体上。
各种气体或蒸汽的混合物利用氮或氦一 类情性载气的气流通过吸收性固体的表 面。混合的气体通过后,在另一端出现时 就分开了。
探索与发现 6
高效液相色谱(HPLC)的应用
20世纪60年代以来,气 相色谱作为分析方法已 经不能满足对生物成分 分析测试的要求。
吸附柱层析
一、常用术语
2.洗脱体积（Ve）： 是指某一成分从柱顶部到 底部的洗脱液中出现浓度 达到最大值时的流动相体 积。
第一节 吸附层析技术
吸附柱层析
√ 吸附薄层层析
聚酰胺薄膜层析 疏水层析
薄层层析(TLC)
薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载 体上的基质为固定相，以液体为流动相的一 种层析方法。
吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相， 以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱状的 一种层析方法。
常用的吸附剂有羟基磷灰石、硅胶、 氧化铝、人造沸石和活性炭等。
这种层析方法已成为科研、医学、化 工及发酵等部门常规使用的一种分离手段。
吸附柱层析
一、常用术语 1.层析：以基质为固 定相（柱状或薄层 状），以液体或气体 为流动相，有效成分 和杂质在这两个相中 连续多次地进行分配、 吸附、交换作用，最 终结果是使混合物得 到分离。
Why not Tswett?
相同时期发生在中国大地的事件
1894年：中日甲午战争,侵占台湾。 1897年：德国侵占胶州湾。 1900年：八国联军侵略中国。 1914年：占领青岛,夺取胶州湾。 1931年：九一八事变,占领东北,建立满州国。 1937年：卢沟桥事变。
探索与发现 4 羊毛中的氨基酸分离
提出色谱塔板理论;预测气相色谱;提出用细小颗 粒作填料,而两端可以加压(HPLC).
1952年：马丁，辛格对分配层析的研究和发现，诺贝尔化学奖
塔板理论
将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏 塔的塔板间移动，在每一个塔板内不同组分分 子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动 相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下 一个塔板，并不断形成新的平衡
薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，类 似纸层析。
层析技术
√ 第一节 吸附层析技术
第二节 分配层析技术 √ 第三节 凝胶过滤层析技术
第四节 离子交换层析法 第五节 亲和层析法 √ 第六节 高压液相层析（HPLC）
第一节 吸附层析技术
√ 吸附柱层析 √ 薄层层析
聚酰胺薄膜层析 疏水层析
吸附柱层析
引言
探索与发现 1
1850年德国科学家朗格首先发现了色 谱分离的现象，当他把一种有颜色的 物质滴到一张滤纸上，观察到它们扩 散成一圈圈的圆环。
探索与发现 2
1906年俄国植物学家茨维特（Michael Tswett）:
将碳酸钙细粉装入玻璃瓶， 石油醚抽提叶子的色素溶液倾入， 接着倒入石油醚洗涤， 柱上部出现了绿色的叶绿素，
高效液相色谱采用了压 力泵及填有很细的颗粒 高效色谱柱。High Performance Liquid Chromatography.
液相色谱与气相色谱法比较
对象 固定相 流动相 环境 应用
气相
液相
气体,沸点低
液相,沸点高
固体,固体涂层液 固体,固液
惰性气体,起运载 作用
高温
液体，与组分可产 生亲和力
1941年生物化学家Martin（马丁）和Synge （辛格）把色谱法应用于氨基酸的分离。
将淀粉作为色柱里的填料:淀粉色谱法 滤纸作为载体: 纸色谱法 覆盖了吸附剂表面的并与流动相不发生混溶的 固定液来代替以前的固体吸附剂:Liquidliquid(partition)Chromatography,LLC).
液相色谱 液-固层析 液-液层析
气相色谱 气-固层析 气-液层析
两种固定相：(固定相不一定是固体) *固体吸附剂作为固定相 *吸附在固体上的液体（硅胶吸附的水作固定相， 以氯仿作流动相，分离羊毛中的氨基酸 ）
（2）按层析原理分类：
吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能 的差异，达到分离鉴定的目的。
薄层层析可根据固定相的种类分为吸附 薄层层析（吸附剂为固定相）、分配薄层层 析（固定在支持剂上的水溶液或有机溶剂为 固定相）和离子交换薄层层析（离子交换剂 为固定相）等。
薄层层析
薄层层析的优点： 1.展层时间短，薄层层析分离混合物一般 仅 需15-60min； 2.设备简单，操作方便，既适用于分析，也 适用于制备； 3.灵敏度高。
中间是黄色的叶黄素， 而在下面则是胡萝卜素橙黄色
色带叫作“色谱”， 方法叫色谱法（Chromatography), 层析法 。
概念:
固定相, 流动相,色谱柱
Which is which?
图有误
现代色谱柱
探索与发现 3
1905-1930. Who cares! Why？
论文发表在不 知名的期刊上
1931年德国库恩(Kuhn)重复了茨维特实验, 用氧化铝和碳酸钙分离了α-,β-,和γ-胡萝卜 素，此后用这种方法分离了60多种这类色素， 1938年他从维生素 B 中分离出 B 6. 1938年的诺贝尔化学奖。
分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间 的分配系数（或溶解度）不同。
离子交换层析:利用不同组分对离子交换剂亲和 力的不同。
凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组 分阻滞作用的不同。
（3）按操作形式不同分类：
柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方 向移动而达到分离。
纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流 动相展开，以达到分离鉴定的目的。