《发酵工程实验》教案：米曲霉的培养及蛋白质分析

米曲霉固态发酵生产中性蛋白酶

1、实验目的及要求：

通过固态三角瓶培养曲霉，使学生掌握固态培养微生物原理和技术，并掌握蛋白酶活性的分析方法：

2、实验原理、过程和方法

2.1原理

固态培养微生物，是我国传统发酵工业的特色之一，具有悠久的历史。在黄酒、白酒、酱油、酱类等领域广泛应用。

固态培养方法：（Solid state cultivation）：主要有散曲法和块曲法。部分黄酒用曲，红曲及酱油米曲霉培养属散曲法；而黄酒用曲及白酒用曲一般采用块曲法。

固态制曲设备：实验室主要采用三角瓶或茄子瓶培养；种子扩大培养可将蒸熟的物料置于竹匾中，接种后在温度和湿度都有控制的培养室内进行培养；工业上目前主要是厚层通风池制曲，转式圆盘式固态培养装置正在试验推广之中；日本、台湾已大规模化，机械化。

固态培养微生物：主要用于霉菌的培养，但细菌和酵母菌也可采用此法。其主要优点是节能，无废水污染。单位体积的生产效率较高。我国广泛使用的厚层通风固态法培养法，空气一般不经过除菌处理，培养环境也无法做到严格无菌。故染菌问题未得到根本解决。

本实验所用的米曲霉的生长特性及菌落特征：

米曲霉（Aspergillus）属曲霉菌（Aspergillus）。菌落初为白色，

黄色，继而变为黄褐色至淡绿褐色，反面无色。

2.2过程

米曲霉菌种的纯化（单菌落分离），制成斜面，将斜面菌种接入250ml

三角瓶培养成种曲，再将种曲扩大培养（500ml）三角瓶。米曲霉培养物

经水溶液萃取，制得粗酶制剂，取粗酶制剂进行蛋白酶活力的测定。

2.3方法

米曲霉的培养

本实验分为斜面种子培养及三角瓶培养两个阶段。三角瓶培养物在工

厂常作为一级种子。

试管斜面培养基：豆饼浸出汁：100克豆饼粉，加水500ml，浸泡4

小时，煮沸3-4小时，纱布自然过滤，取液，调整至5波美度。每100 ml 豆汁中加入可溶性淀粉2克，磷酸二氢钾0.1克，硫酸镁0.05克，硫酸

铵0.05克，琼脂2克，自然pH。

或采用马铃薯培养基：马铃薯200g 葡萄糖20g 琼脂15-20g 加水至1000ml pH自然。

三角瓶培养基制备：

米曲霉的培养其1：麸皮80g，面粉（或小麦粉）20g，水80ml；

2、豆粕粉10g，麸皮90g，水110ml；

装料厚度：1cm左右；

灭菌：120℃，30-60min；

接种及米曲霉的培养条件：

米曲霉固态培养主要控制条件：温度、湿度，装料量，基质水分含量。

固态培养前，原料的蒸熟及灭菌是同时进行的。实验室一般是在高压灭菌锅中进行；但在工厂，则原料的煮熟和灭菌与发酵分别在不同的设备中进行。这点与液态发酵是不同的。28-30℃，培养20小时后，菌丝应布满培养基，第一次摇瓶，使培养基松散，每隔8小时检查一次，并摇瓶。培养时间一般为48-70小时。

3、实验仪器、设备和材料

恒温培养箱或固态培养室，负压式超净工作台，显微镜，计数器，水浴锅，分光光度计，试管，茄子瓶，平板及500ml三角瓶等。

米曲霉菌种（酱油生产用米曲霉）

4、实验分析项目和方法

米曲霉孢子计数（显微镜观察）；通常每克曲（干基）孢子数可达100亿以上；

米曲霉蛋白酶活力的测定方法简介：

（1）称取充分研细的成曲5g，加入100ml水，40℃水浴间断搅拌1hr，过滤，滤液用适当的缓冲液稀释一定的倍数。

（2）样品的测定：取试管3支，编号，每管加入样品稀释液1ml，

40℃水浴中预热2分钟，再加入同样预热的酪蛋白1ml，精确保温10分钟，立即加入0.4mol/L的三氯乙酸2ml，以终止反应，继续保温20分钟，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤。然后另取三支试管，编号，每管内加入滤液1ml，再加0.4mol/L的碳酸钠5ml,已稀释的福林试剂1ml，摇匀，40℃保温发色20分钟，用分光光度计测定OD值（波长660nm）。

（3）计算：

在40℃下，每分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸，定义为一个酶活力单位。

样品蛋白酶活力单位（干基）=

A：由样品测定OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数；

4：4ml反应液取出1ml测定；

n:稀释倍数；

10:反应十分钟；

W：样品水份含量（%）

5、实验报告内容和数据处理

两种培养基米曲霉培养过程中蛋白酶活性变化规律。

6、实验结果和讨论

实验时间：1周

组织形式：每班分为6组，每组学生5人，做3×2个三角瓶。每12小时取样一个，分析测定蛋白酶活性。

比较两种培养基的米曲霉培养物的蛋白酶的活性的高低。

附录1：

固态转轴发酵设备的结构与工作原理

重要说明：

在第一次操作本设备之前请仔细阅读本操作说明书；

设备必须可靠接地；

湿度仪最高使用温度不大于80℃，防水浸；

发酵开始前准备工作（设定为发酵条件，进行DO电极斜率标定、pH 电极零点标定）；

发酵结束数据存盘；

关闭总电源前，请将控制器返回主菜单，然后按Ctrl+F6关闭控制程序，然后关电源。

设备运行结束，勿忘关闭自来水阀、空气源、蒸汽发生器。

开始控温前，必须先打开注水开关，直至排水口无气泡为止。

最高工作压力不大于0.20Mp，进罐空气压力应不大于0.20Mp！最高消毒温度126 ℃；

公用工程要求：蒸汽：0.2~0.4Mpa; 水源：0.1~0.3Mpa

1 技术指标

1.1 概述

具有温度、转速、空气流量、湿度显示和控制功能。