《发酵工程实验》教案：米曲霉的培养及蛋白质分析
1.3发酵工程及其应用教学设计-2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3
设计小组讨论环节，让学生围绕发酵工程在食品、医药、环保等领域的应用展开讨论，培养学生的合作精神和沟通能力。
鼓励学生提出自己的观点和疑问，引导学生深入思考，拓展思维。
技能训练：
设计实践活动或实验，让学生在实践中体验发酵工程及其应用知识的应用，提高实践能力。
在发酵工程及其应用新课呈现结束后，对发酵工程的定义、基本原理和应用领域进行梳理和总结。
4.学生已经了解了生物工程在食品、医药等领域的应用，为本节课的发酵工程应用提供了现实背景。
学习者分析
1.学生已经掌握了哪些相关知识：
在之前的学习中，学生已经了解了微生物学的基本知识，包括微生物的形态、分类、生理特征等。此外，学生对基因工程、细胞工程等生物工程领域也有了一定的了解。这些知识为学生学习发酵工程打下了基础。
教学方法与策略
1.选择适合教学目标和学习者特点的教学方法：
本节课采用讲授法、讨论法、案例研究法和项目导向学习法等教学方法。讲授法用于介绍发酵工程的定义、基本原理和应用领域；讨论法用于探讨发酵工程在食品、医药、环保等领域的应用；案例研究法用于分析具体案例，加深学生对知识的理解；项目导向学习法用于培养学生的动手实践能力和团队协作能力。
教学评价与反馈
1.课堂表现：通过观察学生在课堂上的参与度、提问频率、回答问题的准确性等，评估学生对知识的掌握程度和课堂参与度。
2.小组讨论成果展示：通过学生小组讨论的成果展示，评估学生在小组合作中的表现，包括团队协作能力、沟通能力和解决问题的能力。
3.随堂测试：通过随堂测试，评估学生对知识的掌握程度和理解深度，包括对定义、原理、应用等知识点的理解和应用能力。
（六）课堂小结（预计用时：2分钟）
简要回顾本节课学习的发酵工程及其应用内容，强调重点和难点。
米曲霉
1.菌种特点：米曲霉( Asp.oryzae) 属于真菌菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。
背面无色。
分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。
分生孢子梗2mm左右。
近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。
顶囊近球形或烧瓶形，通常40~50μm。
上覆小梗，小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。
分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。
（半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种）。
菌落生长较快，质地疏松。
初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。
是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。
也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。
会引起粮食等工农业产品霉变。
米曲霉(Aspergillus oryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶,其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。
米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。
米曲霉米曲霉米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。
在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。
米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真核生物活性蛋白的载体。
米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵的条件，这将有助于提高食品酿造业的生产效率和产品质量。
《发酵工程实验》教案：米曲霉的培养及蛋白质分析
米曲霉固态发酵生产中性蛋白酶1、实验目的及要求：通过固态三角瓶培养曲霉，使学生掌握固态培养微生物原理和技术，并掌握蛋白酶活性的分析方法：2、实验原理、过程和方法2.1原理固态培养微生物，是我国传统发酵工业的特色之一，具有悠久的历史。
在黄酒、白酒、酱油、酱类等领域广泛应用。
固态培养方法：（Solid state cultivation）：主要有散曲法和块曲法。
部分黄酒用曲，红曲及酱油米曲霉培养属散曲法；而黄酒用曲及白酒用曲一般采用块曲法。
固态制曲设备：实验室主要采用三角瓶或茄子瓶培养；种子扩大培养可将蒸熟的物料置于竹匾中，接种后在温度和湿度都有控制的培养室内进行培养；工业上目前主要是厚层通风池制曲，转式圆盘式固态培养装置正在试验推广之中；日本、台湾已大规模化，机械化。
固态培养微生物：主要用于霉菌的培养，但细菌和酵母菌也可采用此法。
其主要优点是节能，无废水污染。
单位体积的生产效率较高。
我国广泛使用的厚层通风固态法培养法，空气一般不经过除菌处理，培养环境也无法做到严格无菌。
故染菌问题未得到根本解决。
本实验所用的米曲霉的生长特性及菌落特征：米曲霉（Aspergillus）属曲霉菌（Aspergillus）。
菌落初为白色，黄色，继而变为黄褐色至淡绿褐色，反面无色。
2.2过程米曲霉菌种的纯化（单菌落分离），制成斜面，将斜面菌种接入250ml三角瓶培养成种曲，再将种曲扩大培养（500ml）三角瓶。
米曲霉培养物经水溶液萃取，制得粗酶制剂，取粗酶制剂进行蛋白酶活力的测定。
2.3方法米曲霉的培养本实验分为斜面种子培养及三角瓶培养两个阶段。
三角瓶培养物在工厂常作为一级种子。
试管斜面培养基：豆饼浸出汁：100克豆饼粉，加水500ml，浸泡4小时，煮沸3-4小时，纱布自然过滤，取液，调整至5波美度。
每100 ml 豆汁中加入可溶性淀粉2克，磷酸二氢钾0.1克，硫酸镁0.05克，硫酸铵0.05克，琼脂2克，自然pH。
或采用马铃薯培养基：马铃薯200g 葡萄糖20g 琼脂15-20g 加水至1000ml pH自然。
固体发酵实验米曲霉的培养蛋白酶活性分析及中性蛋白酶的分离纯化
（表1）固体发酵实验—— 米曲霉的培养及蛋白酶活性分析
OD660
样品
1
2.79 9
3.01 0 2.76 7 1.63 7
2
2.91 3
2.76 7 2.79 9 1.62 5
空 白 ①
1.20 5
1.14 2 0.73 0 0.48 9
空 白 ②
1.13 2
1.16 1 0.77 7 0.43 7
实际OD595=测定样液的OD595平均值 — 空白对照OD595 平均值 蛋白质浓度（mg/ml）=标准蛋白量×稀释倍数/1000 样品中性蛋白酶活力（U/mL）=[(样液的平均OD275 — 空白对照的平均OD275）/0.01]×稀释倍数/10 样品中性蛋白酶总酶活（U）=样液蛋白酶活力（U/mL） ×样液体积（mL） 样液中性蛋白酶比活力（U/mg）=样液蛋白酶总酶活/样 液总蛋白
生物工程实验报告
第x组：xx Xxx xx
固体发酵实验—— 米曲霉的培养及蛋白酶活性分析
经查阅文献，本组最后确定的碳氮比是2：1 培养基设计方案：考察培养基中水分含量对米 曲蛋白酶的影响 灭菌条件：121℃ 30min 斜面接种时间：2014-10-22 16:18 下表为具体的固态培养基配方
1.61
3
0.72
2.63
985
-
375.56
11.4
1.63
4
1
5.18
1314
-
253。54
15.15
1.09
结果讨论
本小组以不同PEG浓度为变量研究其对酶萃取分离的影响。 以40%的(NH4)2SO4作为成相盐，考察了不同浓度的 PEG对中性蛋白酶萃取的影响，结果如表4所示。从表4 可以看出，随着PEG浓度的增加，相比总体看来呈上升 的趋势，上相酶活回收率和纯化倍数先增加后下降。原 因在于：一方面，随着PEG浓度上升，分子内亲水基团 增加，亲水性增强，疏水性减弱，表面张力减小，相比 增加，蛋白质(包括中性蛋白酶)趋
发酵工程及其应用+教学设计+2023—2024学年高二上学期生物人教版选择性必修3
第3节发酵工程及其应用目标与素养1．举例说明日常生活中的某些食品是运用传统发酵技术生产的。
2．阐明发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定功能，工业化生产人类所需产品。
3．简述发酵工程的一般流程。
4．举例说明发酵工程在农业、医药工业、食品工业及其他工业生产上有重要的应用价值。
5．联系实际通过问题引领提升分析问题、解决问题和表达交流能力。
情境与问题从《啤酒的工业酿造过程》的视频或青霉素生产工艺流程简图进入课堂，材料都是从生活中来的，激活学生对发酵工程的兴趣，引发学生对发酵工程的思考：发酵工程是通过哪些环节生产产品的？我们生活中哪些产品的生产与发酵工程有关？发酵工程的前景如何？过程与方法1．通过阅读教材、图片分析、课件和视频展示等手段引导学生分析并掌握发酵工程的基本环节，与第1节和第2节内容紧密结合，引导学生尝试用相关原理分析发酵工程的相关问题和现象。
2．通过资料分析和信息的搜集、处理，提高学生获取信息的能力。
3．引导学生通过多种途径，如观察、阅读、思考、分析、讨论、探究等来开展学生之间的协作学习和自主学习，形成以学生为主体的教学模式。
重点难点重点1．简述发酵工程的一般流程。
2．举例说明发酵工程在农业、医药工业、食品工业及其他工业生产上有重要的应用价值。
难点1．简述发酵工程的一般流程。
2．举例说明发酵工程在农业、医药工业、食品工业及其他工业生产上有重要的应用价值。
教学准备教师准备1．了解学生对相关知识点的理解情况，包括传统发酵技术及微生物的培养及其分离计数等。
2．制作PPT，包含课上学生需要完成的探讨问题和课堂反馈作业，内容上包括发酵工程的一般流程和发酵工程学生准备1．复习传统发酵技术及微生物的培养及其分离计数等相关知识。
2．预习。
3．通过可用资源，了解实际生产生活中与发酵工程有关的产品及我国发酵工程的现状。
教学设计教学环节教师活动学生活动初步了解发酵工程多媒体展示《啤酒的工业酿造过程》的视频，结合所学知识回答下列问题：1．人们进行啤酒的工业酿造的理论基础是什么？（酵母菌发酵产生酒精的原理、微生物纯培养技术和密闭式发酵罐的设计。
《发酵工程实验》教学大纲BB034315
《发酵工程实验》教学大纲Experiment of Fermentation Engineering总学时：36 总学分： 2理论学时：0 实验学时：36面向专业：生物工程课程代码：BB034015大纲执笔人：孙中涛大纲审定人：王秀娟一、实验课的性质、地位和任务《发酵工程实验》是生物工程专业学生的主要必修课与专业课，是《发酵工程》的配套实验课程，与《发酵工程》具有同等重要的地位。
本课程的任务是使学生将理论与实践结合起来，掌握常规发酵工程单元操作技术。
《发酵工程实验》课程教学跳出具体的产品，而是按发酵产品的典型流程编排教学内容，强调对发酵工程生物学与工程学基本原理的理解，强调对发酵过程的共性规律的掌握，同时也能了解生物过程研究的多样性。
通过《发酵工程实验》的学习，将技术基础课和专业课与发酵工业的操作实践结合起来，为今后从事生物工程的有关科研和生产打下良好的基础。
与原教学大纲相比，《发酵工程实验》从《发酵工程》中独立出来，设置成一门独立的课程，以强调其重要性。
二、实验目的与要求发酵工程实验课是一门综合性很强的课程，涉及到数学、化学、生物学、生物化学、微生物学、物理化学、有机化学、化工原理等多个学科，基础理论性和实践性均很强，同时要求基础理论和生产时间密切结合。
学生通过该课程的学习将会缩短理论与生产实践的距离，建立用理论知识分析和解决生产实际问题的概念和能力，动手能力也将有所提高。
三、实验项目及内容提要四．实验报告格式实验报告分为以下几部分：题目，实验目的、实验原理、材料与设备、实验方法、实验结果、讨论，作业。
五、本课程考核方式、方法实验课成绩单独按100分记录考试成绩。
凡实验成绩不及格者，该门课程必须重修。
学生的实验成绩应以平时考查为主，一般应占总分的70%，其平时成绩又要以实验实际操作的优劣作为主要考核依据。
在学期末或课程结束时，为复习和巩固实验教学内容，进一步对学生作补充了解，也可举行一定的实验操作考试，但无论采取何种方式进行考核，都必须按实验课的目的要求，以实际实验工作能力的强弱作为评定成绩的主要依据。
1.3发酵工程及其应用(教学课件)高二生物人教版选择性必修三
问题：在工业上，青霉素究竟是怎样生产的呢？
一、发酵工程
1、发酵工程：指利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用 的产品。
啤酒是以大麦为主要原料经酵母菌发酵制成的；发酵过程分为主发酵和后发酵两个 阶段。酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成都在主发酵阶段完成。主发酵结 束后，发酵液还不适合饮用，要在低温、密闭的环境下储存一段时间进行后发酵；发酵 的温度和发酵的时间随啤酒品种和口味要求的不同而有所差异。
大麦
水
糖化罐
1 发芽
二、发酵工程的基本环节 5、发酵罐内发酵 （1）地位：发酵罐内发酵是发酵工程的中心环节。 （2）要求：
①发酵过程中，要随时检测培养液中微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程； ②要及时添加必需的营养物质，要严格控制温度、pH和溶氧量等发酵条件。 （3）严格控制发酵条件的原因： ①环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且影响微生物代谢物的形成； ②严格控制发酵条件，有利于使发酵全过程处于最佳状态。 （4）不同发酵条件的影响（实例——谷氨酸发酵） ①在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸； ②在酸性条件下则容易生成谷氨酰胺和N-乙酰谷胺酰胺；
大麦种子发芽， 释放淀粉酶。
2 焙烤
加热杀死种子胚但 不使淀粉酶失活。
3 碾磨
将干燥的麦芽 碾磨成麦芽粉。
4 糖化
淀粉水解形 成糖浆。
糖浆 啤酒花
冷却
过滤
装瓶 装罐
储存罐
5 蒸煮
新人教版 选择性必修3 发酵工程及其应用 教案
发酵工程及其应用新课标核心素养1.概述发酵工程。
2.简述发酵工程的一般流程。
3.说明发酵工程在生产上有哪些重要的价值。
1.科学思维：发酵工程基本环节分析。
2.社会责任：认同发酵工程是在传统发酵技术的基础上发展起来的，它实现了发酵食品、药物等的工业化生产，极大地改善了人们的生活。
知识点(一)发酵工程的基本环节1．发酵工程发展的前提(1)微生物纯培养技术的建立；(2)密闭式发酵罐的设计成功；(3)人们能够在严格控制的环境条件下大规模生产发酵产品。
2．发酵工程的含义是指利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品。
3．发酵工程的基本环节(1)菌种的选育性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。
(2)扩大培养在发酵之前还需要对菌种进行扩大培养。
(3)培养基的配制在菌种确定之后，要选择原料制备培养基。
在生产实践中，培养基的配方要经过反复试验才能确定。
(4)灭菌培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。
(5)接种将菌种接种到发酵罐培养液中。
(6)发酵这是发酵工程的中心环节。
①在发酵过程中，要随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程。
②要及时添加必需的营养组分，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。
(7)产品的分离、提纯①如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥，即可得到产品。
②如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。
(1)在啤酒生产中，使用基因工程改造的啤酒酵母，可以加速发酵过程，缩短生产周期(√)(2)在青霉素生产过程中如果污染了杂菌，某些杂菌会分泌酶将发酵菌种分解掉(×)(3)谷氨酸的发酵生产：在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酰胺；在酸性条件下则容易形成谷氨酸和N-乙酰谷氨酰胺(×)(4)环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且会影响微生物代谢物的形成(√)1．(生命观念)微生物菌种资源丰富，选择发酵工程用的菌种时需要考虑哪些因素？提示：(1)能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且目的产物产量高、易于回收。
米曲霉的培养及蛋白质分析
米曲霉固态发酵生产中性蛋白酶1、实验目的及要求：通过固态三角瓶培养曲霉，使学生掌握固态培养微生物原理和技术，并掌握蛋白酶活性的分析方法：2、实验原理、过程和方法2.1原理固态培养微生物，是我国传统发酵工业的特色之一，具有悠久的历史。
在黄酒、白酒、酱油、酱类等领域广泛应用。
固态培养方法：（Solid state cultivation）：主要有散曲法和块曲法。
部分黄酒用曲，红曲及酱油米曲霉培养属散曲法；而黄酒用曲及白酒用曲一般采用块曲法。
固态制曲设备：实验室主要采用三角瓶或茄子瓶培养；种子扩大培养可将蒸熟的物料置于竹匾中，接种后在温度和湿度都有控制的培养室内进行培养；工业上目前主要是厚层通风池制曲，转式圆盘式固态培养装置正在试验推广之中；日本、台湾已大规模化，机械化。
固态培养微生物：主要用于霉菌的培养，但细菌和酵母菌也可采用此法。
其主要优点是节能，无废水污染。
单位体积的生产效率较高。
我国广泛使用的厚层通风固态法培养法，空气一般不经过除菌处理，培养环境也无法做到严格无菌。
故染菌问题未得到根本解决。
本实验所用的米曲霉的生长特性及菌落特征：米曲霉（Aspergillus）属曲霉菌（Aspergillus）。
菌落初为白色，黄色，继而变为黄褐色至淡绿褐色，反面无色。
2.2过程米曲霉菌种的纯化（单菌落分离），制成斜面，将斜面菌种接入250ml三角瓶培养成种曲，再将种曲扩大培养（500ml）三角瓶。
米曲霉培养物经水溶液萃取，制得粗酶制剂，取粗酶制剂进行蛋白酶活力的测定。
2.3方法米曲霉的培养本实验分为斜面种子培养及三角瓶培养两个阶段。
三角瓶培养物在工厂常作为一级种子。
试管斜面培养基：豆饼浸出汁：100克豆饼粉，加水500ml，浸泡4小时，煮沸3-4小时，纱布自然过滤，取液，调整至5波美度。
每100 ml 豆汁中加入可溶性淀粉2克，磷酸二氢钾0.1克，硫酸镁0.05克，硫酸铵0.05克，琼脂2克，自然pH。
或采用马铃薯培养基：马铃薯200g 葡萄糖20g 琼脂15-20g 加水至1000ml pH 自然。
【精品】米曲霉的制备
毕业论文课题名称米曲霉的制备姓名学号所在系制药与生物工程系专业年级P09生物制药指导教师职称讲师指导教师职称二O一二年六月八日摘要微生物在酱油生产制曲工艺和发酵过程中起着至关重要的作用，在高盐稀态发酵工艺过程中，培养良好的米曲霉菌种不仅可以提高酱油中总氮、氨基酸态氮含量和酱油风味,而且还可以提高原料利用率。
因此米曲霉种曲培养是生产优质酱油的有效保证。
本论文主要介绍米曲霉在不同阶段的扩大培养方法，包括试管菌种、锥形瓶菌种、种曲罐菌种、种曲等方面的培养方法及注意事项。
米曲霉培养温度为28～32℃,培养时间为72h,米曲霉生长最旺盛作用,此时,曲料的曲酶孢子数大于8×109个/g,蛋白酶活力可达1000mg/100g以上。
关键词米曲霉；温度；时间；试管菌种；三角瓶菌种；扩大培养目录引言............................................. 错误!未指定书签。
1菌种的种类..................................... 错误!未指定书签。
1.1米曲霉....................................... 错误!未指定书签。
1.2黑曲霉....................................... 错误!未指定书签。
2菌种的选择条件................................. 错误!未指定书签。
2.1不产生黄曲霉毒素及其他真菌毒素 ............... 错误!未指定书签。
2.2酶系全、酶活力高............................. 错误!未指定书签。
2.3对环境适应能力强，生长繁殖快 ................. 错误!未指定书签。
2.4酿制的酱油风味好............................. 错误!未指定书签。
3试管实验....................................... 错误!未指定书签。
【高二生物选修三】发酵工程及其应用--两课时教案
发酵工程及其应用两课时教案教学目标的确定与本节内容对应的课程标准的“内容要求”是:阐明发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定功能，工业化生产人类所需产品;举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值。
结合教材内容及学生的实际情况，确定本节的教学目标如下。
1.通过分析现代工业发酵的原理、它与传统发酵技术的区别及其用到的现代化的工程技术，建构发酵工程的概念。
2．基于研学考察活动,概述发酵工程的基本环节。
3.通过开展“高中生模拟创业答辩会”活动，进一步提升对发酵工程基本环节的认识，发展工程思维,认同发酵工程为人类提供了多样的生物产品。
教学设计思路本节课的教学从发酵工程的概念入手，组织学生深人学习发酵工程的基本环节，进而了解发酵工程的应用，认同发酵工程为人类提供了多样的生物产品，丰富了人类的饮食需求。
教学中需要突破的难点是“发酵工程的基本环节”。
教师组织学生在课前开展研学活动，课上让学生基于研学成果，归纳总结出发酵工程的基本流程，再通过“高中生模拟创业答辩会”活动，让学生将发酵工程的基本环节融入创业设计方案，深化他们对发酵工程基本环节的认识，促进工程思维的发展。
第一课时第二课时评析本案例结合学生的研学经历和“高中生模拟创业答辩会”活动，让学生全方位学习发酵工程的基本环节和应用,教学设计十分新颖，充分发挥了学生的主体作用。
1.充分利用本地课程资源，促进课本知识和生活经验的深度融合本节课所涉及的发酵工程对于绝大多数学生来说是陌生的，他们对如何运用发酵原理进行大规模生产并不了解。
因此，教师首先组织开展研学活动，带领学生实地参观本地醋厂，让他们看到了大型的发酵设备，听到了工厂技术人员的介绍，初步了解了生产食醋的工艺流程，从而对发酵工程的基本环节、传统发酵技术和现代发酵工程的异同等有了直观的了解。
研学活动还可以让学生深刻领悟生物科学、生物技术与生产实践的关系。
2.注重培养学生的工程思维本节课安排的“高中生模拟创业答辩会”活动，旨在让学生在学完发酵工程的基本环节之后，通过自己的理解设计具体的生产发酵产品的创业方案，并且通过答辩环节对生产流程、技术要求、预算和风险等进行多方论证;使学生初步理解工程以“建造”为核心，技术要通过设计等环节的转化才能应用在工程中，从而培养学生的工程思维。
米曲霉的定向发酵(1)
第25卷 第2期Vo.l 25 No .2重庆理工大学学报(自然科学)Journa l of Chongqing U niversity of T echno l ogy(N atural Science)2011年2月Feb .2011收稿日期:2010-08-20基金项目:福建省属高校项目(2007F 5075)作者简介:杨秋明(1977 ),男,实验师,主要从事食品微生物研究;通迅作者蔡慧农,教授,主要从事发酵工程研究。
米曲霉的定向发酵杨秋明1,2,肖安风1,2,杨远帆1,2,蔡慧农1,2(1.集美大学生物工程学院,福建厦门 361021;2.厦门市食品生物工程技术研究中心,福建厦门 361021)摘 要:用鱼蛋白(鱼粉)为氮源培养米曲霉,取样分析培养物的蛋白酶活力、氨基酸态氮含量、分子量及用培养物为酶源水解酪蛋白后的分子量变化。
通过对比,研究了米曲霉在分批和补糖2种发酵条件下分泌蛋白酶及菌体生长的特点。
结果表明:在用鱼蛋白为氮源培养米曲霉的过程中,米曲霉产生了多种不同的蛋白酶,蛋白酶的活力与种类随培养时间而变化,分批发酵的总酶活力比补糖发酵时的总酶活力强。
关 键 词:米曲霉;蛋白酶;发酵;酶活力中图分类号:Q55 文献标识码:A文章编号:1674-8425(2011)02-0053-06D irectional Fer m entation of A spergill us O ryzaeYANG Q iu m ing 1,2,X I A O An feng 1,2,YANG Y uan fan 1,2,CA IHu i nong1,2(1.Co lleg e of B ioeng i neering ,Ji m e iU n i versity ,X ia m en 361021,Ch i na .2.F ood B i o eng i neer i ng R esearch Center of X ia m en ,X i a m en 361021,Ch i na)Abst ract :A sper g ill u s oryzae is a co mmon used f u ngus f o r proteinase production .I n th is paper ,the m etabo lic k i n etics ofm u lti enzy m e i n A sperg illus oryzae fer m entati o n w as investi g ated w hen the strain w as cult u red w ith fi s h protein (fish m eal)as nitrogen source .To study the change of proteinase activ ity duri n g fer m entati o n ,Fo li n m ethod and n i n hydrin co l o r i m etr i c m ethod w ere adopted to m easure en zy m e acti v ity ,for m aldehyde titration m ethod w as adopted to deter m i n e the concentrati o n of a m ino n i trogen ,and SDS P AGE ge l electrophoresis w as adopted to m easure the mo lecular w eight of the pro ducti o n fro m hydro l y zi n g casein and li q u i d substrate .Co m pared w ith fed ba tch ,m ore k i n ds of protea ses and h i g her enzy m e acti v ity w ere obtai n ed in the batch fer m entation o fAsperg illus oryzae .Th is re su lt is useful f o r carry i n g out further st u dies on Asperg illus oryzae to pr oduce ne w characteristic pro teinase .K ey w ords :asperg ill u s oryzae ;pro tease ;fer m entation;enzy m e acti v ity近年来,用蛋白酶处理低值蛋白资源,产生具有新功能特性的肽,提高低值蛋白的附加值成为低值蛋白质开发利用的一个新热点[1-3]。
1.3 发酵工程及其应用 教学设计-2021-2022学年高二下学期生物人教版选择性必修3
第3节发酵工程及其应用(一)教学目标1.概述发酵工程及其基本环节。
2.举例说明发酵工程在生产上有重要的应用价值。
(二)教学重点和难点1.教学重点发酵工程的基本环节、发酵工程的应用。
2.教学难点发酵工程的基本环节。
(三)教学过程一、导入新课利用教材“从社会中来”中的素材，明确青霉素的生产成本和价格因为发酵工程的应用而大大降低，引发学生追问发酵工程的奥秘，进而引导学生分析现代工业青霉素究竟是怎样生产的。
由此逐步建构出发酵工程的概念。
二、分析发酵工程的基本环节结合学生的实践经验来分析发酵工程的基本环节，加深他们对发酵工程基本环节的理解。
让学生自主构建流程图，使他们对发酵工程的基本环节形成一个整体认识。
发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵,产品的分离、提纯等方面。
结合教材P22图1-9发酵工程的基本环节和发酵罐示意图了解发酵工程基本环节。
同时分析和讨论P23有关问题对发酵工程基本环节进行分析,总结归纳在发酵工程中对选择的菌种需要考虑的因素，利用教材设计的旁栏思考题，引导学生可从生物与环境相适应的观点理解菌种选育的思路。
为了满足微生物的生长需要，对发酵条件要如何进行调控。
发酵工程与传统发酵技术对比，在产物分离和提纯方有了很大改进之处。
在进行发酵生产时，微生物及其代谢物中都可能含有危害环境的物质。
为了减少或避免污染物的产生和排放，实现清洁生产，应该对排出的气体和废弃培养液进行二次清洁或灭菌处理。
引导学生绘制发酵工程的基本流程图。
在绘制流程图的过程中认识：发酵工程是多个技术环节的集成，任何一个环节出现问题，都可能导致无法获得产品。
在生产过程中除了要考虑技术、经济等因素，还应该考虑是否对环境友好，只有对环境友好才能实现可持续发展。
三、发酵工程的应用结合教材中的内容，归纳发酵工程在各个领域的应用情况。
发酵工程在食品工业、医药工业和农牧业等许多领域得到了广泛的应用，形成了规模庞大的发酵工业。
米曲霉的培养及蛋白酶的活性分析
6.0
100.0
6.5
87.0
7.0
76.4
8.0
59.2
9.0
52.2
• 由表知我们培养基起始pH范围为6-7，pH=6.0时酶活最高
• 综上所述，米曲霉产中性蛋白酶的适宜培 养条件为:
• m(麸皮):m(豆粕)=4:1 可用8g:2g • 水50%，即10ml • pH=6
我们小组的加样配方为：
• [3]邓倩，林亲录，赵谋明，周俊清.米曲霉M3产高蛋白酶 特性研究[J].中国调味品.2005,1:16-20
其他因素的影响
• 1、培养基的含水量
加水量 /ml 2.5 5 7.5 10.0 12.5
W(水) % 33.3 50 60 66.7 71.4
单位酶 活
680.5 1489.2 1414.2 1110.2 328.2
• 2、蛋白酶活力的测定
• (1)成曲水分含量的测定：准确称取1.0000g左右的研细的 成曲于称量瓶中(预先称好空瓶重量)，置于105℃干燥箱中 烘至恒重(大约2h)，取出在干燥器冷却后准确称量，计算 水分含量。
• (2)称取一定量(5g左右)充分研细的成曲，按加水比1:20(约 100ml)加入蒸馏水，40℃水浴内间断搅拌1h，滤纸过滤， 滤液即为粗酶液，用量筒准确测量粗酶液的体积V(ml)。取 少量用0.1mol/LpH7.2的磷酸缓冲液稀释一定的倍数后测酶 活力。
• 从另一文献中发现有加葡萄糖，活力也得到显著提升，考 虑到菌株的差异，以m(麸皮):m(豆粕)=9:1尝试加入。
参考文献:
• [1]赵飞龙，徐亚军.米曲霉的应用研究进展[J].中国酿 造.2006,3:8-10
• [2]杨世平，邱德全.米曲霉产中性蛋白酶的适宜条件[J].湛 江海洋大学学报.2005,25(3):47-51
2022-2023 学年 苏教版 选择性必修三 发酵工程及其应用 教案
第四节发酵工程及其应用课程内容标准核心素养对接(1)阐明发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定功能，工业化生产人类所需产品。
(2)举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值。
(1)科学探究——根据发酵产品和利用微生物的不同讨论发酵工程中的发酵条件及控制方法。
(2)社会责任——认可发酵工程在生产上的重要应用价值。
知识点1发酵工程利用了微生物的特定功能知识点2发酵工程的一般过程知识点3发酵工程应用广泛(1)微生物适应性强、易变异的特定功能为发酵工程产生大量代谢产物提供了保障。
(×)(2)酒精、啤酒等为厌氧发酵产品，味精、赤霉素、乳酸等的生产属于需氧发酵。
(×)(3)在生产上常选择稳定期的微生物作为“种子”。
(×)(4)氨基酸、核苷酸、蛋白质等属于初级代谢产物。
(√)(5)单细胞蛋白既可用于食品加工，也可用于微生物饲料。
(√)(6)发酵工程在纺织、皮革制造和污水处理等方面都发挥着重要作用。
(√)教材P38“图1－4－5”拓展1.如图为分批发酵中的细菌生长曲线，分析细菌生长曲线形成的原因。
提示细菌刚接种到一个新的环境之后，首先需要经历一个短暂的适应时期，该时期内细菌一般不增殖，称为延滞期。
度过适应期后，细菌分裂增殖旺盛，细菌数量呈几何级数增长，称为对数期。
随着营养物质的不断消耗，代谢产物的积累和pH等环境条件的变化，细菌的生长速率降低，死亡率逐步增加，细菌的数量趋向稳定(称为稳定期)，最后细菌数量逐步减少，进入衰亡期。
教材P39“问题与讨论”拓展2.什么是补料分批发酵？应该在分批发酵的哪个时期维持这种补料分批发酵方式？同时应该注意哪些问题？提示补料分批发酵是指在分批发酵中，间歇或连续补加新鲜培养基的发酵方法。
应该在分批发酵的中后期(稳定期和衰亡期)维持这种补料分批发酵方式。
补料过程中需注意补料的方式、补料时间、补料的多少以及补料速度等，微生物的理化参数和生物参数(如pH、泡沫、DO等)来反馈发酵情况进而调整补料速率，保证发酵过程的正常进行。
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米曲霉固态发酵生产中性蛋白酶1、实验目的及要求：通过固态三角瓶培养曲霉，使学生掌握固态培养微生物原理和技术，并掌握蛋白酶活性的分析方法：2、实验原理、过程和方法2.1原理固态培养微生物，是我国传统发酵工业的特色之一，具有悠久的历史。
在黄酒、白酒、酱油、酱类等领域广泛应用。
固态培养方法：（Solid state cultivation）：主要有散曲法和块曲法。
部分黄酒用曲，红曲及酱油米曲霉培养属散曲法；而黄酒用曲及白酒用曲一般采用块曲法。
固态制曲设备：实验室主要采用三角瓶或茄子瓶培养；种子扩大培养可将蒸熟的物料置于竹匾中，接种后在温度和湿度都有控制的培养室内进行培养；工业上目前主要是厚层通风池制曲，转式圆盘式固态培养装置正在试验推广之中；日本、台湾已大规模化，机械化。
固态培养微生物：主要用于霉菌的培养，但细菌和酵母菌也可采用此法。
其主要优点是节能，无废水污染。
单位体积的生产效率较高。
我国广泛使用的厚层通风固态法培养法，空气一般不经过除菌处理，培养环境也无法做到严格无菌。
故染菌问题未得到根本解决。
本实验所用的米曲霉的生长特性及菌落特征：米曲霉（Aspergillus）属曲霉菌（Aspergillus）。
菌落初为白色，黄色，继而变为黄褐色至淡绿褐色，反面无色。
2.2过程米曲霉菌种的纯化（单菌落分离），制成斜面，将斜面菌种接入250ml三角瓶培养成种曲，再将种曲扩大培养（500ml）三角瓶。
米曲霉培养物经水溶液萃取，制得粗酶制剂，取粗酶制剂进行蛋白酶活力的测定。
2.3方法米曲霉的培养本实验分为斜面种子培养及三角瓶培养两个阶段。
三角瓶培养物在工厂常作为一级种子。
试管斜面培养基：豆饼浸出汁：100克豆饼粉，加水500ml，浸泡4小时，煮沸3-4小时，纱布自然过滤，取液，调整至5波美度。
每100 ml 豆汁中加入可溶性淀粉2克，磷酸二氢钾0.1克，硫酸镁0.05克，硫酸铵0.05克，琼脂2克，自然pH。
或采用马铃薯培养基：马铃薯200g 葡萄糖20g 琼脂15-20g 加水至1000ml pH自然。
三角瓶培养基制备：米曲霉的培养其1：麸皮80g，面粉（或小麦粉）20g，水80ml；2、豆粕粉10g，麸皮90g，水110ml；装料厚度：1cm左右；灭菌：120℃，30-60min；接种及米曲霉的培养条件：米曲霉固态培养主要控制条件：温度、湿度，装料量，基质水分含量。
固态培养前，原料的蒸熟及灭菌是同时进行的。
实验室一般是在高压灭菌锅中进行；但在工厂，则原料的煮熟和灭菌与发酵分别在不同的设备中进行。
这点与液态发酵是不同的。
28-30℃，培养20小时后，菌丝应布满培养基，第一次摇瓶，使培养基松散，每隔8小时检查一次，并摇瓶。
培养时间一般为48-70小时。
3、实验仪器、设备和材料恒温培养箱或固态培养室，负压式超净工作台，显微镜，计数器，水浴锅，分光光度计，试管，茄子瓶，平板及500ml三角瓶等。
米曲霉菌种（酱油生产用米曲霉）4、实验分析项目和方法米曲霉孢子计数（显微镜观察）；通常每克曲（干基）孢子数可达100亿以上；米曲霉蛋白酶活力的测定方法简介：（1）称取充分研细的成曲5g，加入100ml水，40℃水浴间断搅拌1hr，过滤，滤液用适当的缓冲液稀释一定的倍数。
（2）样品的测定：取试管3支，编号，每管加入样品稀释液1ml，40℃水浴中预热2分钟，再加入同样预热的酪蛋白1ml，精确保温10分钟，立即加入0.4mol/L的三氯乙酸2ml，以终止反应，继续保温20分钟，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤。
然后另取三支试管，编号，每管内加入滤液1ml，再加0.4mol/L的碳酸钠5ml,已稀释的福林试剂1ml，摇匀，40℃保温发色20分钟，用分光光度计测定OD值（波长660nm）。
（3）计算：在40℃下，每分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸，定义为一个酶活力单位。
样品蛋白酶活力单位（干基）=A：由样品测定OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数；4：4ml反应液取出1ml测定；n:稀释倍数；10:反应十分钟；W：样品水份含量（%）5、实验报告内容和数据处理两种培养基米曲霉培养过程中蛋白酶活性变化规律。
6、实验结果和讨论实验时间：1周组织形式：每班分为6组，每组学生5人，做3×2个三角瓶。
每12小时取样一个，分析测定蛋白酶活性。
比较两种培养基的米曲霉培养物的蛋白酶的活性的高低。
附录1：固态转轴发酵设备的结构与工作原理重要说明：在第一次操作本设备之前请仔细阅读本操作说明书；设备必须可靠接地；湿度仪最高使用温度不大于80℃，防水浸；发酵开始前准备工作（设定为发酵条件，进行DO电极斜率标定、pH 电极零点标定）；发酵结束数据存盘；关闭总电源前，请将控制器返回主菜单，然后按Ctrl+F6关闭控制程序，然后关电源。
设备运行结束，勿忘关闭自来水阀、空气源、蒸汽发生器。
开始控温前，必须先打开注水开关，直至排水口无气泡为止。
最高工作压力不大于0.20Mp，进罐空气压力应不大于0.20Mp！最高消毒温度126 ℃；公用工程要求：蒸汽：0.2~0.4Mpa; 水源：0.1~0.3Mpa1 技术指标1.1 概述具有温度、转速、空气流量、湿度显示和控制功能。
1.2指标1.2.1 温度：自动控制范围：冷却水温+5~50 ℃（±0.2 ℃)；显示范围：0~150 ℃1.2.2 搅拌转速：变频调速范围0~30（±5)rpm，时间比例控制正反转1.2.3 空气流量：显示控制范围0—50L/min1.2.4 湿度控制：50~100%1.2.5 罐体总体积50L，设计压力3.0kg/c㎡，最高工作压力1.5kg/c ㎡，设计工作温度131 ℃1.2.6 灭菌方法：手动控制蒸汽消毒灭菌1.2.7 主机功率：3KW（最大），单相220 V1.28气源要求：2~4kg/c ㎡1.2.9蒸汽要求： 2~4kg/c ㎡2 管路说明该流程图中空气管路阀门标号为“AXX”，蒸汽管路阀门标号为“SXX”，冷却水管路阀门标号为“WXX”，冷凝水管路阀门标号为“VXX”，电磁阀标号为“CXX”，物料管路阀门标号为“PXX”，冷冻水管路标号为“CWX”，其它气体管路标号为“NXX”。
2.1 空气及其净化来自空压机的压缩空气经净化器（外接减压稳压器、除水、除尘、空气予过滤器）进入发酵罐空气总管，空气阀A01、空气流量计、阀A02、空气过滤器，阀A03到达加湿器内或经电磁阀C02进入发酵罐底部分布器，尾气经阀VT1排出，本管路具有计量、净化作用。
注：空气流量显示的流量是以过滤器前的压力下的流量，不是标准状态下的流量。
如须测量控制湿度则开VT11关VT1。
2.2 蒸汽2.2.1 蒸汽进夹套蒸汽经阀S01进夹套（上进），经阀V01排出冷凝水。
蒸汽对培养基预热。
（固体物料传热效率低，可以取消本步操作）2.2.2 蒸汽进反应器蒸汽经阀A02、空气过滤器、阀A03、电磁阀C02进入罐内，由排气口空气阀VT1排出。
蒸汽对过滤器及空气管线消毒2.3 自来水2.3.1 自来水进夹套当电磁阀大开时，自来水经多功能阀、阀W01进入反应器夹套（下进），由夹套上口、电磁阀C01排出；当电磁阀关闭时，夹套水经W02进入电热器、循环泵、单相阀进入夹套（下口），通过夹套水的循环，将加热器的热能带入夹套，通过夹套的换热加热发酵液。
特别提示：温度自动前必须对夹套注水。
2.3.2 自来水进排气冷凝器自来水经阀W03进入排气冷凝器，对发酵尾气进行冷却尽可能减少培养基的水分蒸发2.4 冷冻水（选配）（消毒后降温应优先采用自来水）冷冻水经切换阀T02（关T01）进入自来水管线、经切换阀T04（关T03）返回了冷冻水回路。
2.8 纯氧管线（选配）纯氧管线：纯氧进入流量计、电磁阀C03、切断阀A21进入空气过滤器。
纯氧流量调节：开C03、A21后调节流量计的调节手柄。
2.9空气流量检测与控制：空气热质量流量计：与空气玻璃转子流量计并联安装且在热质量流量计前后安装切断阀。
热质量流量计内通道必须保持干燥无尘，因此只有在发酵过程中才开质量流量计的前后切断阀A11、A12,发酵结束后应及时关闭A11、A12。
2.10 补氨水管线氨水经电磁阀C04、切断阀A31、补料针进入发酵罐，电磁阀由控制器控制3 实罐灭菌操作3.1 准备3.1.1盖紧罐盖上各种盖帽，旋紧罐盖上压紧螺栓。
3.2培养基预热3.2.1准备工作预先启动蒸汽发生器及空气压缩机将控制器中的温度控制设定为手动开排气阀VT1，关闭其它阀门湿度仪不耐高温和不可水浸，消毒后必须关闭排气旁通阀VT11。
3.2.2开排气阀VT1，开夹套冷凝水阀V01排夹套水，关闭其它阀门。
3.2.3启动反应器搅拌马达。
调转速20~30Rpm3.2.4 蒸汽进夹套（固体物料可以取消本操作）缓缓开夹套蒸汽阀S01蒸汽夹套（注意：此时有轻微爆炸声属正常，如声音过响，则开阀的速度应减慢）。
待排水总口排出蒸汽时调节冷凝水阀V01，控制蒸汽排出量以有少量蒸气冒出即可。
并控制夹套内压力不超过0.2Mpa。
当培养基预热至98 ℃时，进入实罐灭菌操作。
在培养基温度在80~90 ℃时可以适当的减慢升温速度，在本温度的区域内可以杀死大部分的微生物。
3.3实罐灭菌3.3.1蒸汽进过滤器：微开过滤器上排冷凝水阀V02，开过滤器前蒸汽阀S02，微加湿器底阀排冷凝水阀V03，缓缓开切断阀A03，蒸汽经过滤器进入反应器，同时在控制器F5“空气”子画面中设定控制方式为“手动”并按F3输入“-100”后按“ENTER”，电磁阀C02在消毒过程中始终是开着的，以保正空气管线消毒彻底。
当冷凝水阀V02、V03出口冷凝水很少时，调节冷凝水阀V02、V03以有少量蒸汽排出为宜。
当排气口有蒸汽排出或罐温达到100 ℃两分钟后，关闭排气阀VT1。
调节切断阀A03和蒸汽阀S02，维持过滤器前蒸汽压力为0.12~0.16Mpa，同时必须保证切断阀有一定开度，不得关死。
3.3.2 当达到预定温度或罐压，开排气阀VT1至有少量蒸气排出，关紧或微开夹套蒸汽阀S01，根据罐压或温度的变化趋势，及时调节蒸汽阀S02、S03。
阀门调节宜微调应避免大幅度开关。
当反应罐罐压或罐温维持在预定的范围内开始计时。
3.3.3 （略）3.3.4 保温阶段应旋松接种口盖至有少量蒸气冒出3.3.5 移种管线消毒（适用于多级发酵）在保温过程中开移种管线阀P03及受种阀前排水阀V04，保温结束前关闭V03。
3.4灭菌完成及降温（先开后关，后开先关）3.4.1 保温结束首先旋紧接种口盖。
3.4.2关紧冷凝水阀V03，关紧过滤器前蒸汽阀，全开空气阀A01、A02，用空气吹过滤器，当过滤器冷凝水阀V02排尽冷凝水后就可以关闭。