绿色荧光蛋白标记亚细胞定位

这些问题能够通过以下实验揭示
(1) 蛋白荧光细胞定位 (2) 酵母双杂交，免疫共沉淀，荧光共振能量转移
荧光蛋白标记细胞定位
将目的基因与绿色荧光蛋白基因（EGFP）融合，通过绿色 荧光蛋白的荧光效应以对目的蛋白进行亚细胞定位
限制性内切酶位点
启动子
P
目的蛋白基因
Target
终止子
ห้องสมุดไป่ตู้
Linker (poly-G)
Debrin Mitochondria
Colocalization
Apoptosis 12 (7): 1155-1171, 2007
P EGFP Target
荧光亚细胞定位的设备: 激光共聚焦显微镜
激光共聚焦显微镜所发射的光能聚焦在样品的一个非常薄 的切面上。 激光共聚焦显微镜的优点是其能剔除非焦平面来源的任意 光线。
实验方法
1. 克隆目的基因的开发阅读框 2. 将目的基因与EGFP基因融合（在哺乳动物细胞中，一 般选用pEGFP系列质粒载体） 3. 将质粒转染细胞
荧光蛋白标记亚细胞定位
扬州大学 生物科学与技术学院
问题的提出
一直以来，人们已经掌握一些方法以评价蛋白的化学和物 理状态
但是存在一些基础的问题，如何直接理解蛋白在细胞内的 的生物活性，因此，我们需要在活细胞体内检测这些蛋白， 以利用了解以下信息
1. 目的蛋白定位在什么地方? 2. 目的蛋白与哪些其他蛋白相互作用
4. 在不同的时间点在激光共聚焦显微镜下观察EGFP在细 胞中的定位，如有必要需进行亚细胞组分的染色，例 如细胞核染色（一般可用PI, DAPI或Hochist);内质网染 色或线粒体染色。
荧光亚细胞定位的应用
荧光是最常用的工具用于蛋白的亚细胞定位
Actin endoG-YFP (apoptotic endonuclease)