DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳银染方法的选择
一种快速DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染干胶技术
一种快速DNA 聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染干胶技术张玉魁,潘忠诚(中国医科大学基础医学院生物芯片研究中心,辽宁沈阳110001)=摘要>介绍快速、高效、高分辨率的DN A 聚丙烯酰胺电泳、银染及干胶技术,采用本文介绍的配比灌制胶,浓缩效果和分离效果十分理想,无横向扩散;染色温度提高,缩短了银染的时间;双层玻璃纸干胶法简便易行。
=关键词>聚丙烯酰胺凝胶电泳;DNA 分离,纯化=中图分类号>Q 503 =文献标识码>B =文章编号>0258-4646(2003)04-0308-02聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、鉴定、纯化及制备DN A 片段最常用的方法,也用于R NA 的纯化与分离。
近十年来,随着分子生物学的快速发展,对DNA 电泳、染色、分析的要求越来越高。
我们根据多年工作经验,总结了一套快速、高效、高分辨率的DNA 聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染及干胶技术。
1 材料与方法1.1 凝胶的配制1.1.1 材料:10@T BE 电泳缓冲液[1],30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺,N ,N ,N c ,N c -四甲基乙二胺(T EM ED ),40%过硫酸铵,3@加样缓冲液(40%蔗糖,3@T BE,0.01%溴酚蓝)。
BioRI D 电泳仪,微型槽。
凝胶配方见表1。
表1 分离胶、浓缩胶配方药品与试剂分离胶浓缩胶30%丙烯酰胺(ml) 2.680.510@T BE(ml)10.1去离子水(ml) 6.29 4.3740%过硫酸铵(L l)2020T EM ED(L l)1010总体积(ml)1051.1.2 灌胶:按表1的分离胶、浓缩胶配方配胶。
安装灌制凝胶的玻璃板,取分离胶各成分混匀,灌制至适宜高度,上部立即加满去离子水隔离空气,待分离胶聚合后(约15min),除去去离子水。
混匀浓缩胶各成分,加至分离胶上,插入齿梳,待10min 后浓缩胶即可聚合。
拔除齿梳,备用。
1.113 上样:以3B 1的比例混合样品与加样缓冲液。
SSR的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与银染检测技术实验报告
SSR的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与银染检测
技术实验报告
实验报告。
实验名称，SSR的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与银染检测技术。
实验目的，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离技术，对SSR （Simple Sequence Repeat）进行分离和检测，利用银染技术对分离的片段进行可视化检测。
实验步骤：
1. 提取DNA样品并进行PCR扩增，得到含有SSR序列的DNA片段。
2. 准备聚丙烯酰胺凝胶电泳，将PCR产物加入样品槽中，进行电泳分离。
3. 取出凝胶，进行银染处理，使得SSR片段能够被可视化。
实验结果：
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，我们成功地分离出了含有SSR 序列的DNA片段，并进行了银染处理。
在凝胶上可以清晰地观察到SSR片段的条带，证明了我们的实验取得了成功的结果。
实验分析：
通过本次实验，我们成功地运用了聚丙烯酰胺凝胶电泳分离技术和银染检测技术，对SSR进行了分离和检测。
这为我们进一步研究SSR的应用提供了可靠的实验基础。
存在问题及改进措施：
在实验过程中，我们发现在PCR扩增时，需要对反应条件进行进一步优化，以提高PCR产物的质量和数量。
在电泳分离中，也需要注意凝胶的制备和运行条件，以获得更好的分离效果。
结论：
通过本次实验，我们成功地利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离技术和银染检测技术，对SSR进行了分离和检测。
这为我们今后进一步
研究SSR的应用提供了重要的实验基础。
编写人，XXX 日期，XXXX年XX月XX日。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
8%聚丙烯酰胺凝胶电泳
50ml配方：
30%丙烯酰胺：13.33ml
10×TBE：5ml（或者5×TBE加10ml）
TEMED：25ul
10%过硫酸铵（新鲜配制）：250ul
ddH2O:补到50ml
丙烯酰胺30%为29：1（质量比，丙烯酰胺：双甲叉丙烯酰胺）
电泳槽中加入0.5×TBE
银染液的配制：
固定液: 100mL 冰乙酸加水稀释至1000mL，可重复使用；
染色液: 1g AgNO3、1. 5mL 37%甲醛, 加水至1000mL (4摄氏度预冷效果佳)，可重复使用，棕色瓶存放；
显色液: 30g Na2 CO3、1. 5mL 37% 甲醛、0. 2mL Na2S2O3(10mg/mL) , 加水至1000mL；
终止液：配方同固定液，10%冰乙酸，可以用回收的固定液进行终止。
染色：
1、加入固定液固定30min，水洗5-10min；
2、加入染色液染色30min，水洗2次，每次不超过30s；
3、加入显色液显色（条带清晰即可，一般不超过5min）；
4、加入终止液终止反应；
需要配制的溶液：
10%过硫酸铵：称取5g过硫酸铵溶解于50ml蒸馏水中。
37%甲醛：37ml甲醛和63ml蒸馏水混匀。
10mg/mL Na2S2O3：称取0.3g溶解于30ml蒸馏水中。
10%冰乙酸：100mL 冰乙酸加水稀释至1000mL，可重复使用。
5×TBE缓冲液：54gTris，27.5g硼酸，20ml 0.5M EDTA(pH8.0)，加水定容至1升。
DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染方法的探讨_李其松
H e ilong jiang A ni m a l Sc ience an d V e te r in a ry M ed ic in e
10 2006
要远, 同样有利于基因型的判断。 目前 , 许多实验室 PCR 扩增的片段主要采用琼 脂糖电泳、 EB 染色。在琼脂糖中用 EB 染色可检测 出少于 10 ng 的 DNA, 但琼脂糖电泳的分辨率较低 , 对有些试验不太适用。聚丙烯酰胺的分离效果较好 , 但如果用 EB 染色 , 聚丙烯酰胺淬灭 EB 的 荧光, 使 EB 染色的 灵敏 度降 低, 不能 检测 出少 于 10 ng 的 DNA。另外, EB 染色容易产生污染。用 EB 染色后 , 只能用照片记录试验结果, 而不能把试验结果及时保 存下来为以后的试验做参考和指导。试验采取了银 染的方法 , 同时在试验中我们将染色 的方法作了改 进。这种方法可提 高灵敏度 5 ~ 10 倍 , 而且避免了 EB 的污染及紫外光对人眼睛和皮肤的损伤 , 并缩短 了银染的时间。同时改进的染色方法与其他方法相 比具有操作时间短、 背景颜色浅、 操作程序简单、 灵敏 度高、 染色液容易保存等优点。 高浓度、 高交联度的凝胶中不同的 DNA 分子条 带更易分开, 条带清晰, 利于判型; 低浓度、 低交联度 的凝胶中 , 同一电泳道中的多个条带之间的绝对距离 更远, 同样利于不同基因型的判断, 每位试验者应该 根据自己的试验适时调整试验方法, 同时选择简单方 便的染色方法 , 可以收到事半功倍的效果。 ( 009)
收稿日期 : 2005 09 19 作者简介 : 李其松 ( 1981 ) , 男 , 硕士研究生 . 通讯作者 : 王金玉 ( 1952 ) , 男 , 教授 , 硕士 , 博士生导师 .
图 3 14% 的胶
双向电泳凝胶银染操作流程.
2.银染液成分：
(18cm 胶)每块用 500 ml 银染液
成分
(7cm 胶)
(18cm 胶)
(克，毫升,微升) 100 mlⅹ1 500mlⅹ1 500mlⅹ2 500mlⅹ3 500mlⅹ4
AgNO3
0.25 g
1.25 g
2.5g
3.75g
5.0g
1
北京基因组研究所-阳光
纯水
定容
定容
定容
定容
北京基因组研究所-阳光
双向电泳凝胶银染操作流程
目的：检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。
原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，使
银颗粒沉淀在蛋白带上。
一、固定：过夜+10minⅹ3
1.方法：1）.固定 30min 后纯水洗 10minⅹ3。2）.固定过夜后纯水洗 10minⅹ3（推荐）。
1.24g
6.20 g
12.4g
18.6g
24.8g
纯水
定容
定容
定容
定容
定容
总体积
100 ml
500ml
1000 ml
1500 ml
2000 ml
K3Fe(CN)6：铁氰化钾，深红色菱形结晶，比重 1.845，在碱性介质中为强氧化剂； Na2S2O3·5H2O：易溶于水，水溶液呈弱碱性，不溶于乙醇。
Glycine
0.4 g
2g
4g
6g
8g
纯水
定容
定容
定容
定容
定容
总体积
100 ml
500ml
1000 ml
1500 ml
2000 ml
甘氨酸：Glycine，75.07（可以用 EDTA 代替，3.65g 的 EDTA.2H2O 相当于 1g 甘氨酸） 六、（补充）：脱色
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验一变性聚丙烯酰胺凝胶电泳1、30%acrylamide（14.5g丙烯酰胺，0.5g双丙烯酰胺，加水溶解，定容至50ml，4℃，棕色瓶中储存）2、10%过硫酸铵（0.5gaps，溶5ml去离子水中，4℃可储存数个月）3、10×tbe缓冲液（10.8gtris,0.744gedta,5.5g硼酸，定容到100ml）4、temed5、20-200dnamarker1、布局10%的胶10ml：8m*10ml*60g/mol=4.8g尿素6.1mlwater3.3ml30%acrylamide1ml10×tbe0.11mlaps0.01mltemed2、立即将胶放入两块板间并挂不好梳子，置放，等待凝结30min，时间可以适度缩短。
3、向电泳槽加入1×tbe，拔出梳子并用注射针筒多次洗涤点样孔，尽可能排除未聚合的丙烯酰胺。
4、将dnamarker加进点样孔中，以120v（10v/cm）展开电泳直至燃料跑至紧邻底部的三分之一处，大约须要60-90分钟。
银染溶液的配置：实验之前准备4℃水1、紧固液（10%醋酸）：20ml冰醋酸，180mlddh2o搅匀（通风厨中展开）2、染色液：将0.1gagno3溶解于100mlddh2o中，使用前加1.5ml37%甲醛溶液，必须储存于避光瓶中，防止接触皮肤（通风厨中进行）3、显影液：将30gna2co3熔化于ddh2o中，加热至4℃，采用ka1.5ml37%甲醛溶液（通风厨中展开），0.1m五水硫代硫酸钠150μl；（0.1mna2s2o3。
5h2o：将2.48gna2s2o3。
5h2o溶100mlddh2o）。
1、染色液和显影液要现用现配；2、显影液必须在4℃采用且必须留存在4℃；3、甲醛蒸汽致癌，在通风厨内操作；4、实验室中轻盈的背景光线有助于减少背景颜色；5、显色不能在透光的盒子中进行；6、溶液无法轻易好像在胶面上，应当并使盘弯曲后将溶液好像在盘的角上，或者将每种溶液各方一盘，然后将胶从一个盘转至另一个盘；7、溶液的体积必须足够将胶全部浸没；8、呈色过程中盘中须轻轻晃动。
实验4 小垂直板 - 聚丙烯酰胺凝胶分离DNA片段及银染
实验三聚丙烯酰胺凝胶分离DNA片段及银染一、目的与要求1.了解聚丙烯酰胺电泳的原理与技术；2.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA片段的技术；3.了解银染显影技术。
二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N'，N'—四甲基乙二胺(N，N，N'，N'—tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。
三、试剂与器材1.试剂：脲素（Urea，分析纯）、丙烯酰胺（Acrylamide）、N,N'-甲叉双丙烯酰胺(Bisacrylamide)、N，N，N'，N'—四甲基乙二胺(N，N，N'，N'—tetramethyl ethylenedia mine)、10%过硫酸铵，5×TBE；2.器材：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪、脱色摇床、微量移液器。
四、实验步骤1.6%的PAGE的配制配制1L的胶液需要：420g 尿素，100ml 5×TBE，60g 丙烯酰胺（丙烯酰胺是强烈的神经毒素，可经皮肤吸收，配制时需戴口罩），3g N-N甲叉双丙烯酰胺，加ddH2O至1000ml, 过滤，4保存。
2.制备凝胶板（l）装板：先将玻璃板和胶条彻底洗净、晾干，将平板玻璃和嵌有1mm垫条的玻璃扣在一起，两块玻璃上下之间应错开3CM的距离，并把平板玻璃插入胶条的凹槽中，同时用胶条固定两块玻璃的两侧；（2）封板：装板完成后，将玻璃板倾斜750靠在墙壁上，然后称取1g琼脂糖溶加100mL 的水，在微波炉中迅速溶解在凝固之前用胶头滴管吸取1%琼脂糖溶液沿玻璃板与胶条底部的缝隙缓缓加入，应保证溶液完全覆盖缝隙并不外流，待溶液凝固。
SSR的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与银染检测技术实验报告
SSR的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与银染检测技术实验报告英文回答：Introduction。
Single-stranded RNA (SSR) is a type of RNA that is not double-stranded like most other types of RNA. It is found in some viruses and in some eukaryotic cells. SSR can be separated by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and visualized by silver staining.Materials and Methods。
SSR sample。
10% polyacrylamide gel。
Electrophoresis buffer。
Silver staining solution。
UV transilluminator。
Procedure。
1. Load the SSR sample onto the polyacrylamide gel.2. Run the gel at 100 volts for 2 hours.3. Stain the gel with silver staining solution for 30 minutes.4. Visualize the SSR bands under a UV transilluminator.Results。
The silver staining revealed several SSR bands in the gel. The bands were of different sizes, indicating that the SSR sample contained SSRs of different lengths.Discussion。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染实验操作指导书(银染) V1.0
8.1.2红色硅胶条应保持清洁，以保证良好的密封性。然后将玻璃板置于制胶夹上的红色硅胶条中心，轻推夹牢即可，无需下压（按压夹子时应轻柔）。
8.2制胶（6%）
8.2.130%聚丙烯酰胺（29:1）8ml,5*TBE，定容至40ml(每块胶约5ml),加过硫酸铵200ul，TEMED20ul,插入梳子。室温凝固，垂直向上轻轻拔出梳子。避免产生气泡。（若有气泡，用手轻轻弹几下玻璃板，赶尽气泡）
7.银染试剂
7.1固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1L。
7.2 0.4%硝酸银：硝酸银1克，水250ml。
7.3 1.5%氢氧化钠：氢氧化钠15克，水1L。
7.4 37%甲醛
8.非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备
8.1安装玻璃板夹心
8.1.1分别取内板（10cm*7.3cm）、外板（10cm*8.3cm）各一块（注意勿用手接触灌胶面的玻璃），将内板置于外板夹条一侧，使内外玻板底部、两边齐平（否则需重新安装），置于玻璃夹中，将两边固定（夹子应夹在侧边条中央位置）。
5．仪器与器具
移液枪和枪头、脱色摇床、EP管、205ml锥形瓶、塑料盒、电泳仪、液：
丙烯酰胺：29g,N,N’-亚甲基双丙烯酰胺：1g,加去离子水定容至100ml，装于棕色瓶内，4℃可保存两个月。
6.2．过硫酸铵0.1g/ml：称取过硫酸铵1g加去离子水值10ml。4℃可保存一周，-20℃可保存一个月。
6.3．TEMED(四甲基乙烯基二胺)：和过硫酸铵一起作为交联反应的催化剂。易吸潮，4℃封闭保存。
6.4. 5*TBE电泳缓冲液
分别称取54克Tris,27.5克硼酸，20ml0.5M/EDTA(pH=8.0)定容至1L
SSR的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与银染检测技术实验报告
SSR的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与银染检测技术实验报告英文回答：Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and silver staining techniques experiment report。
Introduction。
Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) is a technique used to separate proteins based on their molecular weight. The proteins are first denatured by boiling them in a solution containing SDS, a detergent that disrupts the protein's interactions and unfolds it. The denatured proteins are then loaded onto a polyacrylamide gel, which is a porous matrix that acts as a molecular sieve. When an electric current is applied to the gel, the proteins migrate through the gel at different rates, with smaller proteins moving faster than largerproteins.Silver staining is a sensitive technique used to visualize proteins on a polyacrylamide gel. The proteinsare first fixed to the gel by soaking it in a solution containing glutaraldehyde, a cross-linking agent that prevents the proteins from diffusing. The gel is then incubated in a solution containing silver nitrate, which binds to the proteins. The silver ions are then reduced to silver metal, which appears as a dark brown band on the gel.Materials and methods。
DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳实验(详细参考)
Aptamer的稳定性考察—聚丙烯酰胺凝胶电泳Aptamer识别肿瘤细胞若选择4℃识别，则需要提前控温离心机，且样品在上样检测前宜放置于冰中；37℃就不用控温了。
Aptamer浓度：荧光标记的是50μM，没有标记的是100μMDNA提取-----注意实验中戴好橡胶手套，穿好实验服，以防苯酚粘到皮肤上。
1. 取7.3μl aptamer（100μM）于1460μl小鼠血清（无需过滤）中，在37℃细胞培养箱中孵育；2. 于不同时间点（6h, 5h, 4h, 3h, 2h, 1h, 1min）取200μl该小鼠血清到新的EP管中，加入200μl（等体积）的苯酚-氯仿（取苯酚-氯仿之前先将苯酚-氯仿混匀），混匀，管中溶液变浑浊；3. 用15000转/分离心10分钟，管中出现3层：上清、白色变性蛋白层、苯酚层；4. 取上清到新的EP管中。
在原EP管（变性蛋白层和苯酚层）中加入200μlTE溶液，混匀（该步进一步提取残留的DNA）；5. 用15000转/分离心10分钟，收集上清；6. 重复4、5步直到上清澄清；7. 在上清中加入等体积的氯仿（用于去除苯酚），混匀，用15000转/分离心10分钟，取上清到新的EP管中；8. 加入等体积乙醚（用于去除氯仿），混匀后静置10分钟，弃上层乙醚（乙醚比水轻，在上层）；9. 重复步骤8，敞开管盖15分钟，待乙醚挥发；10. 加入1/10体积的3M NaAc、2倍体积的无水乙醇，放置于-20℃冰箱中30分钟（DNA沉淀）；11. 用16500转/分（转速不宜再高，EP管容易破裂！）离心30分钟；12. 将管中溶液吸出，转移至新的EP管中。
原管中保留约30μl溶液，打开管盖，待管中溶液蒸发；（我通常将EP管敞开，封上封口膜，再扎7、8个孔，放在通风橱中过夜。
）（管底看不到沉淀，因为DNA含量太低。
）13. 在管中加入16μL 1*TE溶液；14. 进行电泳分析前，将样品在95℃水浴中加热10分钟（小心管盖冲开或进水），在冰上骤冷（使DNA成单链），上样或保存在-20℃冰箱中。
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤
D N A非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤Hessen was revised in January 2021DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂：1、30％聚丙烯酰胺(29:1)丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。
2、10％过硫酸胺过硫酸胺1克，水10ml。
3、TEMED4、5xTBETris 27克，硼酸克， EDTA(pH 10ml，定容至500ml。
二、银染试剂1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。
2、% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。
3、% NaOH：NaOH 克，水500ml。
4、37％甲醛。
三、配胶(6%)：30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；TEMED 20ul。
室温凝固时间>1小时。
四、银染：1、固定液固定10m。
2、水洗2m x3次。
3、% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。
4、水洗 20秒x2次。
5、% NaOH 100ml，加37％甲醛，混匀，显色3～10m。
6、水洗若干次，终止显色。
电泳时间：150v x 3h，溴酚兰的位置相当于40bp。
银染后胶面积将膨胀10％。
在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。
显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴！！！聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。
我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。
因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，厚。
实验十SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（银染色法）
实验十 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（银染色法）实验目的1.通过实验了解蛋白质凝胶电泳银染色法的原理。
2.进一步熟悉SDS—PAGE操作，掌握银染色法的实验技术。
实验原理自1979年，Switzer等人提出银染色法后，又经许多学者不断改进，实验表明银染色法较考马斯亮蓝R250灵敏100倍，但染色原理尚不十分清楚，可能与摄影过程中Ag+的还原相似，也可能它对蛋白质分子中氨基酸具有较高的亲和力，从而使蛋白质染成黑色谱带。
试剂与器材(一)、试剂1.牛血清白蛋白（经微量凯氏定氮法测定蛋白含量）溶液准确称量牛血清白蛋白0.5mg，溶于连续系统SDS—PAGE样品溶解液2.5ml中。
2.0.05%考马斯亮蓝R250染色液内含20%磺基水杨酸3.固定液20%三氯乙酸及1%戊二醛各200ml。
4.氨银染色液此液应临用前配制，取0.1mol/LNaOH 20ml、浓氨水 1.4ml，混合摇匀得混合液，取4ml19.4%硝酸银溶液慢慢滴入混合液中，边滴加边摇动器皿，全部滴完后用重蒸馏水定容到200ml。
5.显色液此液应临用前配制，取40%甲醛50µL和1%柠檬酸0.5ml，混匀后加重蒸馏水定容至250ml。
6.脱色液(1).称NaCl 37g，CuSO4·H2O 37g,加重蒸馏水850ml,滴加浓氨水至溶液呈澄清的深蓝色,定容至1000ml.(2).称硫代硫酸钠21.8g,加重蒸馏水至100ml,4℃贮存.使用前将(1)和(2)等量混合后稀释30倍.(二)、器材夹心式垂直板电泳槽[凝胶模(135×100×1.0mm)],直流稳压电泳仪(300—600V，50—100 mA)，微量注射器，大培养皿（Φ18cm）。
操作方法(一)仪器安装配制连续SDS—PAGE 10%PAA，制胶后，加入含0.1%SDS的PH7.2 0.1mol/L磷酸盐电极缓冲液。
(二)加样加样量分别为2.5µl，5µl，8µl，10µl。
SSR的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与银染检测技术实验报告
SSR的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与银染检测技术实验报告英文回答：Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining of Single-Stranded RNA。
Introduction。
Single-stranded RNA (ssRNA) is a type of RNA that does not form a double helix. It is found in a variety of organisms, including viruses, bacteria, and eukaryotes. ssRNA can be separated by size and charge using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). PAGE is a technique that separates molecules based on their size and charge. The molecules are placed in a gel and an electric current is applied. The molecules will migrate through the gel at a rate that is inversely proportional to their size and charge. The smaller and more negatively charged molecules will migrate faster than the larger and lessnegatively charged molecules.After the molecules have been separated by PAGE, they can be visualized using a variety of staining methods. Silver staining is a staining method that is used to visualize ssRNA. Silver staining is a sensitive method that can detect very small amounts of RNA.Materials and Methods。
SSR的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与银染检测技术实验报告
实验报告一、实验目的和要求1.了解SSR标记的检测方法；2.了解PAGE银染检测SSR的原理；3.掌握PAGE银染检测SSR的技术。
二、实验内容和原理1. 根据DNA大小及类型的不同，可通过电泳进行分离。
聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，适宜于微卫星等位基因间的差别检测。
2. 银染方法的建立始于1979 年对蛋白质的染色，以后逐渐应用于核酸。
3. 银染原理：扩增DNA经电泳分离后，Ag+可与之形成稳定的复合物，在甲醛的作用下被还原成银颗粒，呈现棕褐色谱带。
三、实验仪器与材料1、实验材料：已准备的12个水稻材料的PCR产物。
2、实验耗材：PCR管、枪头（tip）、1次性塑料手套等；仪器设备：PCR仪、电泳仪、垂直电泳槽及制胶装置、凝胶成像系统/扫描仪、移液枪、塑料托盘等。
3、试剂及配制：①引物（10mM）：根据含有SSR的序列设计而合成的，用无菌双蒸水配制所需浓度。
②dNTP溶液（2mM）：将采购的溶液分装，直接稀释到所需浓度即可。
③Taq DNA聚合酶（5U/μl）：直接采购。
④10 x PCR缓冲液：直接采购。
⑤DNA分子量标准：直接采购。
⑥0.5mol/LEDTA ：在800ml水中加入186.1g EDTA-Na.2H2O，搅拌并用氢氧化钠调PH至8.0，定溶至1L，分装后高压灭菌备用。
⑦TBE电泳缓冲液（Tris-硼酸5×贮存液）：Tris 碱54g/L和硼酸27.5g/L溶于蒸馏水，加入20ml (pH8.0)0.5mmol/L EDTA，定溶到1L。
用时稀释5倍。
⑧上样液（6×）：溴酚兰0.25%、二甲苯青0.25%、蔗糖40%的混合液。
⑨封胶液：1g琼脂糖放于100ml TBE煮沸溶解、混匀。
⑩30%丙烯酰胺（100 ml）：将丙烯酰胺29克和N、N-亚甲叉双丙烯酰胺1克用蒸馏水溶解，定容至100ml。
或从公司直接采购的40%（Acr:Bis=29：1）溶液。
银染聚丙烯酰胺检测牙鲆微卫星DNA实验方法的分析探讨
银染聚丙烯酰胺检测牙鲆微卫星DNA实验方法的分析探讨杜爽杨磊仇雪梅摘要：为了筛选和检测牙鲆种群中具有较好表现的微卫星多态性,对聚丙烯酰胺凝胶及银染方法进行了选择。
经过反复的实验，总结出了一套适用于牙鲆微卫星检测的方法。
该方法具有灵敏度高、背景浅、污染小、条带清晰等突出特点,能有效地控制染色背景,显著提高检测分辨率,整个染色过程所需时间短,具有广泛的推广价值。
关键词:银染;微卫星;聚丙烯酰胺凝胶微卫星DNA(microsatellite ) 又称简单序列重复(Sample Sequence Repeats ,SSR) ，一般以1～6 个碱基为核心序列，经过多次的串联重复组成的长达几十个核苷酸的序列[1]。
与其它分子标记相比，微卫星标记具有的优点:微卫星标记具有座位数目巨大并随机分布于基因组中(内含子、外显子、基因间序列)、多态性丰富、共显性遗传方式、分析方法简单、重复性好和近缘种中引物通用性高等优点,在动物的群体遗传分析、亲子鉴定、基因组作图和遗传育种中得到了广泛的应用[2] [3]。
微卫星PCR 产物的检测方法主要有荧光标记引物的测序法,同位素标记引物的聚丙烯酰胺电泳法,以及银染变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶方法。
目前很多国内外的实验室都是通过PAGE-银染的方法来鉴定微卫星产物。
在鱼类微卫星PCR产物的鉴定中，变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶方法都有所报道[4] [5]。
本次实验，我们在应用微卫星标记对牙鲆群体的检测工作中,对银染聚丙烯胺凝胶电泳技术的最适条件进行了探索,经过多次实验,最终研究找到了其最适条件，可以对牙鲆微卫星DNA扩增产物进行更为准确、可靠的鉴定分析。
1.材料和方法材料1.1.1 样本大连海域牙鲆群体30尾,取其肌肉加入70%乙醇后放入-20℃保存备用。
1.1.2 微卫星引物从NCBI上下载牙鲆微卫星序列，经过Primer 5设计引物，由上海生物工程技术服务公司合成引物，并按照说明溶解引物。
BIO-RAD 聚丙烯酰胺凝胶银染方法
聚丙烯酰胺凝胶银染方法
（2块8*10cm厚0.75-1.0cm的小胶）
1、固定——20min
(1)固定液的准备：
(2)取出电泳后的聚丙烯酰胺凝胶，放入固定液中，置于摇床上，轻轻震荡20min。
注意：固定时间参照表1.
2、漂洗——20min
弃去固定液，加入400ml的去离子双蒸水，置于摇床上，震荡10min。
重复1次。
对于更大更厚的胶，用800ml的水漂洗。
3、染色——20min
染液的准备：（使用前5min之内准备）
35ml去离子水于一锥形瓶中
5.0ml Silver Complex Solution
5.0ml Reduction Moderator Solution
5.0ml Image Development Reagent
使用前快速加入50ml的室温的Development Accelerator Solution，充分混匀，倒入染色槽中，轻轻振荡，直至蛋白质条带具有足够的显色强度。
约15min。
4、终止——15min
准备5%的乙酸溶液。
将胶放入终止溶液中,置于摇床上，振荡15min，然后用超纯水中漂洗5min。
表1。
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F8G聚丙烯酰胺凝胶电泳银染方法的选择
李西平 ! 钱新华 ! 姚英民 ! 刘志杰 !刘 阳 " 第一军医大学南方医院儿科 ! 广东 广州 ’($’(’ #
摘要 ! 目的 比较 , 种聚丙烯酰胺凝胶银染方法 # 为初次使用者选择方法时提供参考 % 方法 用 ",5H31 的引物作为上样 样本 # 分别采用氨水法 & 低浓度硝酸银法 &$I(J 及 $I"K 硝酸银法染色 % 后 " 种配合不同的显色剂显色 % 结果 前 " 种未显 色 #$I(K 及 $I"K 硝酸银可显色 % 结论 $I"K 的硝酸银与氢氧化钠显色剂相结合具有最高的灵敏度 ’$I"K 的硝酸银与碳 酸钠显色剂相结合具有最佳的显像效果 % 关键词 !F8G ’ 银染 ’ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 中图分类号 !L%")I%,!!!!!!!! 文献标识码 !G!!!!!!!! 文章编号 !($$$E"’++B"$$,C$)E($*"E$%
别!
*=*=*11 不同浓度的硝酸银 同一浓 度 硝 酸 银 染 色 " 染 色时间在 >IJ?I19-% 范围内 " 显色时间及显色结果无
差异 ! 当染色时间继续减少 " 显色时间需相应延长 "而 且 I=51 !. 带 型 逐 渐 不 能 显 示 出 来 ! I=*+ 硝 酸 银 比
I=*+ 硝酸银 #!=5+J>=I+ 氢氧化钠作为染色剂和显色 剂 ! 稳妥起见 " 建议选用 I=*+ 的硝酸银染色以减少失
:A(1&%<1B CDE=<10,= _0O=0H/913O,OY:<\31OY29:;:;QOH32A04YO?01OF8GO4323=2:0;O:;O/0<79=17<9H:43OQ3<O3<3=210/A013Y:YIO F=1@! "6( G?231O2A3O3<3=210/A013Y:YO‘9YO=0H/<3234RO2A3OQ3<YO‘313OY29:;34OY3/91923<7O67O?0.1O4:??313;2OH32A04YRO;9H3<7O.Y:;QO9HH0E ;:9EY:<\31E=:21:=O9=:4RO<0‘E=0;=3;2192:0;OY:<\31O;:21923RO$I(JO9;4O$I"JOY:<\31O;:21923IOG=(H/1( F8GO‘9YO4323=234O0;<7O67OY29:;E :;QO‘:2AO$I(JO9;4O$I"JOY:<\31O;:21923I ! I")</H(0") $I"JOY:<\31O;:21923O.Y34O9<0;QO‘:2AOY04:.HOA7410a:43OYA0‘YO2A3OA:QA3Y2O Y3;Y:2:\:27O:;OF8GO4323=2:0;RO‘A:<3O:2YO.Y3O‘:2AOY04:.HO=9160;923O/104.=3YO2A3O63Y2Ob.9<:27O0?O2A3O:H9Q3I J=; K"&6(B F8GcOY:<\31OY29:;:;QcO/0<79=17<9H:43OQ3<O3<3=210/A013Y:Y
代硫酸钠显色较前两种慢 " 灵敏度稍差 " 但背景浅 " 对 比度好 !
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&* ’ 李瀚晣 R1 盛国光 R1 冉瑞琼 R1 等 =1UTYFZZTU 银染技术筛检 [P\ 基因 突变实验方法的建立 &Q ’=1 临床肝胆病杂志 R1!XXXR1!5N*O’1!IXF!I=
*($*"* OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO 第一军医大学学报 jkO>:1Y2O[:<O[34OU;:\COOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO"$$,c",B)C
&! ’ P0$%21QPR1S8,2$/61TLR1U&2&01VS=1W$,21$%71,&%,-2-/&1,-./&01,2$-%L 带型显 色 更 深 # 更 快 # 灵 敏 度 更
高!
*=*=>11 不同浓度的凝胶 相同硝酸银浓度及染色时间 下 "> 种不同浓度的凝胶间相比 " 低浓度的显色更快 ! !*+ 的凝胶在 I=!+ 的硝酸银中染色 >I19-% 后 " 仍不 能使 I=51!. 的带型出现 ! *=*=?11 不同的显色试剂 !=5+ 及 >+ 氢氧化钠显色结 果无差别 " 背景均较黄 ! >+ 的碳酸钠加 ?II1!GH# 的硫
化乙锭相比 # 具有无染色体畸变 & 可使单链核酸着色 的特点 # 因而得到广泛应用 # 特别是近几年在 --@X &
FFX@d&F8G 测序等实验中更显示出其优越性 % 可以 预 测 # 在 分 离 特 定 片 断 的 d8G 时 # 也 会 显 示 出
("e*)
%$OH:; 后 # 每孔上样 (O!< ! 即 ($O;Q"#"D$Oi 电泳 ,$O H:; 后 #每孔再加样 $I’O!<!$I’O;Q"% 继续电泳 #,$OH:;
(I"OO 方法
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收稿日期 !"#$%&$’&(" 基金项目 ! 国家自然科学基金 !%)**$*+, "
A
A
为显色剂时结果无差别 ! 高凌云等 &!*’报道的方法中甲 醛浓度为 I=IM>+N 体积比 O" 但我们之前用此浓度未能 显色 $ 结果未列出 %" 甚至显色时间延长至过夜也无带 型出现 " 提示过低的甲醛可使灵敏度下降 ! 甲醛浓度 在 I=!+JI=*+ 时 " 显色时间无变化 ! 但过高则显色速 度加快 " 难以控制显色程度 ! 总之 "在选择染色方法时 "首先应依据样本量 ! 样 本量大可以选择碳酸钠作显色剂 " 以得到背景低 # 对 比度好的结果 ( 同时选择 I=!+ 或 I=*+ 硝酸银均可 " 选择后者时可以节省显色时间 ! 样本量小者 " 应选用
后终止电泳 % 小心取胶后 # 每个上样孔道为一个单位 分割凝胶 #以便采用不同的银染方法 %每一浓度 + 条 #
其独特的优势 % 尽管文献报道的方法很多 # 但具体操 作差异较大 # 使初次使用者难以从中做出最佳选择 % 我们从中选择几种方法加以采用 # 略作比较 # 旨在为 初用者选择方法时提供参考 %
第X期
李西平 R 等 =CKL 聚丙烯酰胺凝胶电泳银染方法的选择
)!If>)
!11111111*11111111>111111111?1111111111511111111B $ $
兰变为黄色即可停止 ! I=!+ 与 I=*+ 的硝酸银相比 " 后 者的灵敏度更高 ! 从图中可以看出 "碳酸钠作为显色 剂 " 较氢氧化钠具有背景浅的优势 " 但相比较而言 " 后 者具有更高的灵敏度 ! 当用碳酸钠不能显色时 " 移入 氢氧化钠中仍能继续显色 ! !=5+ 及 >=I+ 氢氧化钠作
败率 ! 注意染色过程中各种液体体积一定要足够大 " 保证凝胶自始至终浸没其中 " 以免出现染色不均或镜 面现象 ! 显色时 "应及时更换显色液 " 可以避免形成的 碳酸银颗粒沉积于凝胶表面 " 使背景颜色加深而影响 灵敏度 ! 用碳酸钠显色时将显色液预冷至 !I1!" 有利 于控制显影速度及程度 ! 参考文献 !
*=*=511 不 同 浓 度 的 甲 醛 甲 醛 浓 度 在 I=!+ #I=!5+ # I=*+ $ 体积比 % 范围内 "显色差异不大 ! >11 讨论
我们选择经聚丙烯酰胺凝胶纯化的引物作为样 本是为了精确定量 ! CKL 的片断大小对检测的灵敏 度具有很大的影响 " 当 CKL 片断低于 5I1AD 时 " 最大 检测范围是 51%G &!>’" 因此选用最 小 上 样 量 为 51%G 以 判断灵敏度 ! 文献提及的银染法 " 多以乙醇或乙酸固 定 " 由于乙酸固定后带色较浅 &!I’" 因此我们选用乙醇 固定 ! 尽管文献报道认为氨水 F 柠檬酸法 # 低浓度硝 酸银法具有很大的优越性 " 但我们用此 * 种方法经
( 条用方卫国 等 ()) 的 氨 水 E 柠 檬 酸 法 &( 条 用 潘 尚 领 等 (($)的低浓度硝酸银法 #其余 D 条用常规银染法 % 后 者在 ($J 乙醇固定 ($OH:;# 蒸馏水漂洗 (OH:; ’(J 硝 酸 %e(’OH:;(((#(")#蒸馏水漂洗 (OH:;% 各取 % 条分别在 $I(J&$I"JGQ8T% 中染色(’#($#(")% 每组染色后 #又分别用 %J 碳酸钠 &%I$J 氢氧化钠及 (I’J 氢氧化钠显色 ((#"#*)% 各显色液分别加入 $I($J &$I(’J &$I"$J ! 体积比 " 的 %*J 甲醛 % 显色满意时用 ($J 乙酸终止 % 扫描保存 % "OO 结果 "I(OO氨水 E 柠檬酸法及低浓度硝酸银法 虽将显色时间延长至 "OA #仍未见任何带型出现 #