DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳银染方法的选择

( 条用方卫国 等 ()) 的 氨 水 E 柠 檬 酸 法 &( 条 用 潘 尚 领 等 (($)的低浓度硝酸银法 #其余 D 条用常规银染法 % 后 者在 ($J 乙醇固定 ($OH:;# 蒸馏水漂洗 (OH:; ’(J 硝 酸 %e(’OH:;(((#(")#蒸馏水漂洗 (OH:;% 各取 % 条分别在 $I(J&$I"JGQ8T% 中染色(’#($#(")% 每组染色后 #又分别用 %J 碳酸钠 &%I$J 氢氧化钠及 (I’J 氢氧化钠显色 ((#"#*)% 各显色液分别加入 $I($J &$I(’J &$I"$J ! 体积比 " 的 %*J 甲醛 % 显色满意时用 ($J 乙酸终止 % 扫描保存 % "OO 结果 "I(OO氨水 E 柠檬酸法及低浓度硝酸银法 虽将显色时间延长至 "OA #仍未见任何带型出现 #
前者背景较染色前无任何变化 # 后者仅见凝胶普遍轻 微 变 黄 % 即 使 把 后 一 种 方 法 的 染 色 时 间 延 长 至 %$O
(OO材料与方法 (I(OO 主要仪器与试剂
北京东方仪器厂恒压恒流 F>EF 型电泳仪 # 北京 六一仪器厂 FSSENNN 型垂直电泳槽 % 三羟甲基氨基甲 烷 !_1:Y "& 四 甲 基 乙 二 胺 !_f[fF" 为 636=0 公 司 产 品 # 银染所用其它试剂均为分析纯试剂 # 广东汕头化 学试剂厂生产 % 用浓度为 ($O;Qg!< 的 ",OH31 引物作 为上样样本 %
第X期
李西平 R 等 =CKL 聚丙烯酰胺凝胶电泳银染方法的选择
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!11111111*11111111>111111111?1111111111511111111B $ $
兰变为黄色即可停止 ! I=!+ 与 I=*+ 的硝酸银相比 " 后 者的灵敏度更高 ! 从图中可以看出 "碳酸钠作为显色 剂 " 较氢氧化钠具有背景浅的优势 " 但相比较而言 " 后 者具有更高的灵敏度 ! 当用碳酸钠不能显色时 " 移入 氢氧化钠中仍能继续显色 ! !=5+ 及 >=I+ 氢氧化钠作
-.//012345675892:0;9<5892.19<5-=:3;=35>0.;492:0;!0?!@A:;9!B%)**$*+,C
作者简介 ! 李 西 平 !()D)E "# 女 # 第 一 军 医 大 学 在 读 博 士 研 究 生 # 电 话 $
$"$ED(D,()")
H:; #仍无带型出现 % 实验重复 ($ 余次均如此 % % 种浓 度的凝胶结果相同 !图 ( "% "I"OO常规银染法 "I"I(OO 不同的硝酸浸泡时间 %OH:; 与 (’OH:; 间无差
败率 ! 注意染色过程中各种液体体积一定要足够大 " 保证凝胶自始至终浸没其中 " 以免出现染色不均或镜 面现象 ! 显色时 "应及时更换显色液 " 可以避免形成的 碳酸银颗粒沉积于凝胶表面 " 使背景颜色加深而影响 灵敏度 ! 用碳酸钠显色时将显色液预冷至 !I1!" 有利 于控制显影速度及程度 ! 参考文献 !
图 !"" 硝酸银染色比较
!"#$% &’()*+",’- ’. /"..0+0-1 ,"234+ ,15"-"-6 (417’/,
#$%&"!’"()*+",-./&01%-20$2&13-241!)5+1,67-8914:706;-7&<1#$%&1*’1 (=*+1,-./&01%-20$2&13-241>+1,67-8914:706;-7&<1#$%&1>’1(=!+1,-./&01 %-20$2&13-241!=5+1,67-8914:706;-7&<1#$%&1?’1(=!+1,-./&01%-20$2&1 3-241>+1,67-8914:706;-7&<1#$%&15’1(=*+1,-./&01%-20$2&13-241>+1 ,67-891@$0A6%$2&<1#$%&1B’1C&/&.6D&71-%1!=5+1,67-8914:706;-7&1 $E2&01$996%-$F,-./&0F@-20-@1,2$-%-%G=1$’151%GH!.<1A’1!I1%GH!.
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为显色剂时结果无差别 ! 高凌云等 &!*’报道的方法中甲 醛浓度为 I=IM>+N 体积比 O" 但我们之前用此浓度未能 显色 $ 结果未列出 %" 甚至显色时间延长至过夜也无带 型出现 " 提示过低的甲醛可使灵敏度下降 ! 甲醛浓度 在 I=!+JI=*+ 时 " 显色时间无变化 ! 但过高则显色速 度加快 " 难以控制显色程度 ! 总之 "在选择染色方法时 "首先应依据样本量 ! 样 本量大可以选择碳酸钠作显色剂 " 以得到背景低 # 对 比度好的结果 ( 同时选择 I=!+ 或 I=*+ 硝酸银均可 " 选择后者时可以节省显色时间 ! 样本量小者 " 应选用
*($*"* OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO 第一军医大学学报 jkO>:1Y2O[:<O[34OU;:\COOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO"$$,c",B)C
*=*=511 不 同 浓 度 的 甲 醛 甲 醛 浓 度 在 I=!+ #I=!5+ # I=*+ $ 体积比 % 范围内 "显色差异不大 ! >11 讨论
我们选择经聚丙烯酰胺凝胶纯化的引物作为样 本是为了精确定量 ! CKL 的片断大小对检测的灵敏 度具有很大的影响 " 当 CKL 片断低于 5I1AD 时 " 最大 检测范围是 51%G &!>’" 因此选用最 小 上 样 量 为 51%G 以 判断灵敏度 ! 文献提及的银染法 " 多以乙醇或乙酸固 定 " 由于乙酸固定后带色较浅 &!I’" 因此我们选用乙醇 固定 ! 尽管文献报道认为氨水 F 柠檬酸法 # 低浓度硝 酸银法具有很大的优越性 " 但我们用此 * 种方法经
化乙锭相比 # 具有无染色体畸变 & 可使单链核酸着色 的特点 # 因而得到广泛应用 # 特别是近几年在 --@X &
FFX@d&F8G 测序等实验中更显示出其优越性 % 可以 预 测 # 在 分 离 特 定 片 断 的 d8G 时 # 也 会 显 示 出
("e*)
%$OH:; 后 # 每孔上样 (O!< ! 即 ($O;Q"#"D$Oi 电泳 ,$O H:; 后 #每孔再加样 $I’O!<!$I’O;Q"% 继续电泳 #,$OH:;
(I"OO 方法
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收稿日期 !"#$%&$’&(" 基金项目 ! 国家自然科学基金 !%)**$*+, "
代硫酸钠显色较前两种慢 " 灵敏度稍差 " 但背景浅 " 对 比度好 !
6E1CKL1-%1D6.:$@0:.$9-7&1G&., &Q ’=1 L%$.1P-6@4&9R 1!XX!R1!XBN!O’ 1 MIF>=
&* ’ 李瀚晣 R1 盛国光 R1 冉瑞琼 R1 等 =1UTYFZZTU 银染技术筛检 [P\ 基因 突变实验方法的建立 &Q ’=1 临床肝胆病杂志 R1!XXXR1!5N*O’1!IXF!I=
后终止电泳 % 小心取胶后 # 每个上样孔道为一个单位 分割凝胶 #以便采用不同的银染方法 %每一浓度 + 条 #
其独特的优势 % 尽管文献报道的方法很多 # 但具体操 作差异较大 # 使初次使用者难以从中做出最佳选择 % 我们从中选择几种方法加以采用 # 略作比较 # 旨在为 初用者选择方法时提供参考 %
F8G聚丙烯酰胺凝胶电泳银染方法的选择
李西平 ! 钱新华 ! 姚英民 ! 刘志杰 !刘 阳 " 第一军医大学南方医院儿科 ! 广东 广州 ’($’(’ #
摘要 ! 目的 比较 , 种聚丙烯酰胺凝胶银染方法 # 为初次使用者选择方法时提供参考 % 方法 用 ",5H31 的引物作为上样 样本 # 分别采用氨水法 & 低浓度硝酸银法 &$I(J 及 $I"K 硝酸银法染色 % 后 " 种配合不同的显色剂显色 % 结果 前 " 种未显 色 #$I(K 及 $I"K 硝酸银可显色 % 结论 $I"K 的硝酸银与氢氧化钠显色剂相结合具有最高的灵敏度 ’$I"K 的硝酸银与碳 酸钠显色剂相结合具有最佳的显像效果 % 关键词 !F8G ’ 银染 ’ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 中图分类号 !L%")I%,!!!!!!!! 文献标识码 !G!!!!!!!! 文章编号 !($$$E"’++B"$$,C$)E($*"E$%
!"#$%&’(") "* (+,-&./ (0/,-& (120)0)3 4-15"6( 7"& 89: $"/;.<&;/%406= >=/ =/=?1&"$@"&=(0(
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OOOOOOOO由于银染可以检测到低至 ;Q 范围的核酸 # 具有
可与同位素相比拟的高灵敏度 # 与常用的染色剂溴
(()
分别灌制浓度为 DJ &+J 及 ("J 的聚丙烯酰胺凝 胶 # 厚度 $I%OHH %(!_hf 电泳缓冲液及聚丙烯酰胺凝 胶的配制参见文献 (+ )# 均为 + 个泳道 % (’$Oi 预电泳
&! ’ P0$%21QPR1S8,2$/61TLR1U&2&01VS=1W$,21$%71,&%,-2-/&1,-./&01,2$-%-%G1
I=!+ 的硝酸银 CKL 带型显 色 更 深 # 更 快 # 灵 敏 度 更
高!
ຫໍສະໝຸດ Baidu
*=*=>11 不同浓度的凝胶 相同硝酸银浓度及染色时间 下 "> 种不同浓度的凝胶间相比 " 低浓度的显色更快 ! !*+ 的凝胶在 I=!+ 的硝酸银中染色 >I19-% 后 " 仍不 能使 I=51!. 的带型出现 ! *=*=?11 不同的显色试剂 !=5+ 及 >+ 氢氧化钠显色结 果无差别 " 背景均较黄 ! >+ 的碳酸钠加 ?II1!GH# 的硫
:A(1&%<1B CDE=<10,= _0O=0H/913O,OY:<\31OY29:;:;QOH32A04YO?01OF8GO4323=2:0;O:;O/0<79=17<9H:43OQ3<O3<3=210/A013Y:YIO F=1@! "6( G?231O2A3O3<3=210/A013Y:YO‘9YO=0H/<3234RO2A3OQ3<YO‘313OY29:;34OY3/91923<7O67O?0.1O4:??313;2OH32A04YRO;9H3<7O.Y:;QO9HH0E ;:9EY:<\31E=:21:=O9=:4RO<0‘E=0;=3;2192:0;OY:<\31O;:21923RO$I(JO9;4O$I"JOY:<\31O;:21923IOG=(H/1( F8GO‘9YO4323=234O0;<7O67OY29:;E :;QO‘:2AO$I(JO9;4O$I"JOY:<\31O;:21923I ! I")</H(0") $I"JOY:<\31O;:21923O.Y34O9<0;QO‘:2AOY04:.HOA7410a:43OYA0‘YO2A3OA:QA3Y2O Y3;Y:2:\:27O:;OF8GO4323=2:0;RO‘A:<3O:2YO.Y3O‘:2AOY04:.HO=9160;923O/104.=3YO2A3O63Y2Ob.9<:27O0?O2A3O:H9Q3I J=; K"&6(B F8GcOY:<\31OY29:;:;QcO/0<79=17<9H:43OQ3<O3<3=210/A013Y:Y
别!
*=*=*11 不同浓度的硝酸银 同一浓 度 硝 酸 银 染 色 " 染 色时间在 >IJ?I19-% 范围内 " 显色时间及显色结果无
差异 ! 当染色时间继续减少 " 显色时间需相应延长 "而 且 I=51 !. 带 型 逐 渐 不 能 显 示 出 来 ! I=*+ 硝 酸 银 比
I=*+ 硝酸银 #!=5+J>=I+ 氢氧化钠作为染色剂和显色 剂 ! 稳妥起见 " 建议选用 I=*+ 的硝酸银染色以减少失