细胞与分子生物学技术
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一 保持核酸一级结构的完整性,因完整的一级结构是 核酸结构和功能研究的最基本的要求；
二 是尽量排除其他分子的污染，保证核酸样品纯度。
保持核酸的完整性（一）
尽量简化操作步骤，减少对核酸的破坏； 合适pH值（pH4－10）
过酸或过碱－破坏磷酸二酯键 减少机械剪切力，包括剧烈的溶液振荡、搅拌，使溶
蛋白水平-----蛋白分离纯化；Western Blot; 蛋白芯片等 ；
第一章 生物大分子的分离纯化
生物大分子是指生物体内由分子量较低的基本 结构单位首尾相连形成的多聚化合物。
核酸和蛋白质的结构与功能及相互作用是分子
水平生命活动的基础；
内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致
病基因的侵入是人类疾病发生、发展的根本原因。
影响后继研究的溶液和试剂 －－加入的有机溶剂和某些金属离子；
核酸的浓缩、沉淀与洗涤
液快速通过狭长孔道，细胞突置于低渗溶液中，DNA 样品反复冻融等都可引起DNA的降解。 常在0－4℃的条件下提取，还可降低核酸酶的活性与 反应速率，减少对核酸的生物降解；
保持核酸的完整性（二）
抑制核酸酶活性： 内源或外源的各种核酸酶能破坏磷酸二酯键；
DNA酶的激活需要Mg2+、Ca2+等二价金属离子，可使用 二价金属离子螯合剂乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、柠檬酸盐并在 低温条件下操作，基本可抑制DNA酶的活性；
RNA酶，分布广泛，耐高温、耐酸碱，不易灭活。
技术路线的设计
核酸的释放
DNA和RNA一般均位于细胞内（病毒除外）， 分离纯化的第一步是裂解细胞、释放核酸。
破碎细胞的方法：
包括机械和非机械法（干燥法，溶胞法）两大类。
应清除的杂质
非核酸的大分子污染物 －－主要是蛋白质、多糖及脂类物质；
非需要的核酸分子 －－分离某一特定的核酸分子时，其它的核酸分子 皆为杂质；
核苷 如果是存在于DNA中的脱氧核苷则2’位则 是H而不是OH
DNA的双螺旋结构
特征：
①两条链以反向平行的方式围绕同一中心轴向右盘绕 ②主链处于螺旋的外侧（核糖+磷酸）
亲水核糖平面与螺旋轴平行 碱基处于螺旋的内侧，与中轴垂直 ③螺距：10bp—3.4nm—3600 đ=2nm ④大沟与小沟：
蛋白质识别DNA的特定遗传信息的关键点 ⑤ 碱基互补配对A = T,C≡G
核酸变性
在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对 的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹 结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单 链分子，称为核酸的变性。
核酸的变性、复性一级结构不变；氢键；碱基堆 积力；
碱基配对 A＝T，C≡G
核酸的变性与复性
50％的DNA变性
变性，解链温度或融解温度 （melting temperature，Tm） 复性，淬火（quench）与退火（annealing）
生物大分子(biomacromolecule)
核酸: 核苷酸（碱基，核糖，磷酸） DNA RNA (mRNA,tRNA,rRNA, siRNA ,miRNA ……)
蛋白质: 氨基酸
中心法则 (The Central Dogma)
复
转录
制 逆转录
翻译
核 酸 —— 储存和传递遗传信息 蛋白质 —— 构成生物体的基本组分，
核酸的一般理化性质
多元酸，具较强的酸性。 DNA是线状高分子，粘度很大，碱性条件下稳定；
RNA分子较小，粘度也小，对酸稳定。 核酸分子在机械力的作用下易发生断裂。 碱基有共轭双键，具紫外吸收特性，最大吸收峰在
260nm。可对核酸进行检测和定量，也可分析纯度。 核酸变性
——加热、极端的pH、有机溶剂如甲醇、乙醇、 尿素及甲酰胺等。
剑桥分子生物学研究所 1916年--
沃森 James Dewey
Watson 美国
哈佛大学 1928年--
威尔金斯 Maurice Hugh Frederick
Wilkins 英国
伦敦大学 1916年--
发现了核酸的分子结构（DNA双螺旋）及其在 遗传信息传递中的作用
Cohen的重 组DNA实验 (1974年)
基因治疗
第一例基因临床治疗的方案(1990.9.14,NIH)
病因: 淋巴细胞缺乏ADA
腺苷、dATP堆积
破坏免疫功能
患儿很少活到成年
腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的 严重联合免疫缺陷(SCID)
分子生物学基本技术
核酸水平（DNA, RNA)-----核酸的分离纯化 ; PCR技术 ；分子杂交 ； 分子克隆 ；RNA干扰；基因芯片；DNA测序等 ；
核酸（DNA，RNA）和蛋白质是生物体中最重要的生 物大分子，是分子生物学研究和分子诊断的对象。
核酸和蛋白质的分离纯化是分子生物学 研究及对疾病进行分子诊断的最基础工作。
核酸的化学组成
核酸
核苷
（RNA、DNA） 酸
磷酸 戊糖
核苷
碱基
核糖（RNA） 脱氧核糖（DNA）
A、G、C、U A、G、C、T
DNA重组（DNA recombination）：
指不同来源的 DNA分子通过磷酸二 酯键将末端连接形成 重组DNA分子。
分子生物学技百度文库的临床应用
分子杂交技术 －筛选21三体 （间期）
13号染色体（绿）和21号染色体（红）探针与羊水间期细胞 杂交，可见两个绿色信号和三个红色信号，说明是21三体。
基因诊断
执行各种生理功能
《基因论》(1926年)
在一次国际遗传学大会上，有 人问他为什么会有这么多的发现， 摩尔根回答：“一靠勤奋、二靠实 验材料得当，三靠愿意放弃任何没 有证据的假说，最后还得靠少开些 遗传学大会”。
1933年获诺贝尔医学或生理学奖
1962年诺贝尔生理学或医学奖得主
克里克
Francis Harry Compton Crick 英国
材料与方法的选择
临床诊断与研究常见的标本——血液、尿液、唾液、 组织及培养的细胞。
不同研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有 不同要求，另外尚需考虑制备核酸所需的时间与成本。
不影响核酸制品质量与产量的前提下，应选安全的试 剂与制备方案。
核酸提取－－ 溶于水而不溶于有机溶剂的性质
核酸分离纯化的原则：
二 是尽量排除其他分子的污染，保证核酸样品纯度。
保持核酸的完整性（一）
尽量简化操作步骤，减少对核酸的破坏； 合适pH值（pH4－10）
过酸或过碱－破坏磷酸二酯键 减少机械剪切力，包括剧烈的溶液振荡、搅拌，使溶
蛋白水平-----蛋白分离纯化；Western Blot; 蛋白芯片等 ；
第一章 生物大分子的分离纯化
生物大分子是指生物体内由分子量较低的基本 结构单位首尾相连形成的多聚化合物。
核酸和蛋白质的结构与功能及相互作用是分子
水平生命活动的基础；
内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致
病基因的侵入是人类疾病发生、发展的根本原因。
影响后继研究的溶液和试剂 －－加入的有机溶剂和某些金属离子；
核酸的浓缩、沉淀与洗涤
液快速通过狭长孔道，细胞突置于低渗溶液中，DNA 样品反复冻融等都可引起DNA的降解。 常在0－4℃的条件下提取，还可降低核酸酶的活性与 反应速率，减少对核酸的生物降解；
保持核酸的完整性（二）
抑制核酸酶活性： 内源或外源的各种核酸酶能破坏磷酸二酯键；
DNA酶的激活需要Mg2+、Ca2+等二价金属离子，可使用 二价金属离子螯合剂乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、柠檬酸盐并在 低温条件下操作，基本可抑制DNA酶的活性；
RNA酶，分布广泛，耐高温、耐酸碱，不易灭活。
技术路线的设计
核酸的释放
DNA和RNA一般均位于细胞内（病毒除外）， 分离纯化的第一步是裂解细胞、释放核酸。
破碎细胞的方法：
包括机械和非机械法（干燥法，溶胞法）两大类。
应清除的杂质
非核酸的大分子污染物 －－主要是蛋白质、多糖及脂类物质；
非需要的核酸分子 －－分离某一特定的核酸分子时，其它的核酸分子 皆为杂质；
核苷 如果是存在于DNA中的脱氧核苷则2’位则 是H而不是OH
DNA的双螺旋结构
特征：
①两条链以反向平行的方式围绕同一中心轴向右盘绕 ②主链处于螺旋的外侧（核糖+磷酸）
亲水核糖平面与螺旋轴平行 碱基处于螺旋的内侧，与中轴垂直 ③螺距：10bp—3.4nm—3600 đ=2nm ④大沟与小沟：
蛋白质识别DNA的特定遗传信息的关键点 ⑤ 碱基互补配对A = T,C≡G
核酸变性
在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对 的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹 结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单 链分子，称为核酸的变性。
核酸的变性、复性一级结构不变；氢键；碱基堆 积力；
碱基配对 A＝T，C≡G
核酸的变性与复性
50％的DNA变性
变性，解链温度或融解温度 （melting temperature，Tm） 复性，淬火（quench）与退火（annealing）
生物大分子(biomacromolecule)
核酸: 核苷酸（碱基，核糖，磷酸） DNA RNA (mRNA,tRNA,rRNA, siRNA ,miRNA ……)
蛋白质: 氨基酸
中心法则 (The Central Dogma)
复
转录
制 逆转录
翻译
核 酸 —— 储存和传递遗传信息 蛋白质 —— 构成生物体的基本组分，
核酸的一般理化性质
多元酸，具较强的酸性。 DNA是线状高分子，粘度很大，碱性条件下稳定；
RNA分子较小，粘度也小，对酸稳定。 核酸分子在机械力的作用下易发生断裂。 碱基有共轭双键，具紫外吸收特性，最大吸收峰在
260nm。可对核酸进行检测和定量，也可分析纯度。 核酸变性
——加热、极端的pH、有机溶剂如甲醇、乙醇、 尿素及甲酰胺等。
剑桥分子生物学研究所 1916年--
沃森 James Dewey
Watson 美国
哈佛大学 1928年--
威尔金斯 Maurice Hugh Frederick
Wilkins 英国
伦敦大学 1916年--
发现了核酸的分子结构（DNA双螺旋）及其在 遗传信息传递中的作用
Cohen的重 组DNA实验 (1974年)
基因治疗
第一例基因临床治疗的方案(1990.9.14,NIH)
病因: 淋巴细胞缺乏ADA
腺苷、dATP堆积
破坏免疫功能
患儿很少活到成年
腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的 严重联合免疫缺陷(SCID)
分子生物学基本技术
核酸水平（DNA, RNA)-----核酸的分离纯化 ; PCR技术 ；分子杂交 ； 分子克隆 ；RNA干扰；基因芯片；DNA测序等 ；
核酸（DNA，RNA）和蛋白质是生物体中最重要的生 物大分子，是分子生物学研究和分子诊断的对象。
核酸和蛋白质的分离纯化是分子生物学 研究及对疾病进行分子诊断的最基础工作。
核酸的化学组成
核酸
核苷
（RNA、DNA） 酸
磷酸 戊糖
核苷
碱基
核糖（RNA） 脱氧核糖（DNA）
A、G、C、U A、G、C、T
DNA重组（DNA recombination）：
指不同来源的 DNA分子通过磷酸二 酯键将末端连接形成 重组DNA分子。
分子生物学技百度文库的临床应用
分子杂交技术 －筛选21三体 （间期）
13号染色体（绿）和21号染色体（红）探针与羊水间期细胞 杂交，可见两个绿色信号和三个红色信号，说明是21三体。
基因诊断
执行各种生理功能
《基因论》(1926年)
在一次国际遗传学大会上，有 人问他为什么会有这么多的发现， 摩尔根回答：“一靠勤奋、二靠实 验材料得当，三靠愿意放弃任何没 有证据的假说，最后还得靠少开些 遗传学大会”。
1933年获诺贝尔医学或生理学奖
1962年诺贝尔生理学或医学奖得主
克里克
Francis Harry Compton Crick 英国
材料与方法的选择
临床诊断与研究常见的标本——血液、尿液、唾液、 组织及培养的细胞。
不同研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有 不同要求，另外尚需考虑制备核酸所需的时间与成本。
不影响核酸制品质量与产量的前提下，应选安全的试 剂与制备方案。
核酸提取－－ 溶于水而不溶于有机溶剂的性质
核酸分离纯化的原则：