基于 NMR的代谢组学研究

基于NMR的代谢组学研究代谢物是生命过程中发生的生物化学反应的产物，能够从某种程度上反映生命过程的本质。

虽然人们对代谢物和代谢水平的认识和研究已经有上百年的历史，但是，将生物体作为一个整体进行研究的代谢组学(metabonomics/metabolomics)，成为分子病理、基因功能分析和系统生物学研究的强有力的技术平台只有7年的历史。

1998年Tweeddale等[1]在研究大肠杆菌的代谢时提出了代谢组(Metabolome)这个概念用来表示代谢物整体(total metabolite pool)，并且指出，代谢组分析能够提供有关细胞代谢和调控的信息。

Nicholson等[2]在1999 年提出代谢组学的概念(metabonomics)时将其定义为：对病理/生理刺激或基因改变时生物体系的动态代谢响应的多参数定量分析(the quantitative measurement of the dynamic multiparametric metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli or genetic modification)。

Metabonomics一词来自希腊文的词根“meta”和“nomos”。

“meta”意思是“变化(change)”，“nomos”意思是“规律”或“原则”(就象economics)。

从这个定义本身不难看出，代谢组学分析的对象是生物体本身，而且是一个动态的整体。

Nicholson研究组的工作包括动物体生理[3~5]、药物毒理[6~9]、分子表型学[10,11]、疾病诊断[12~14]和以系统生物学为基础的功能基因组学[15~17]。

Fiehn等[18]在2000年，Raamsdonk 等[19]在2001 年又提出了metabolomics这个单词，用以强调把代谢组学这个技术平台用于研究细胞系统基因的功能。

目前，metabolomics有多个定义，但其本质是：给定细胞在给定时间和环境下的所有小分子代谢物的定量分析(the quantitative measurement of all low molecular weight metabolites in an organism's cells at a specified time under specific environmental conditions)。

所以从定义来看，metabolomics指的是静态生物体系代谢组分析，因此可以认为是metabonomics 的一部分。

事实上，近年来也有动态代谢组学(dynamic metabolomics)[20]提法出现，说明metabolomics的含义正在朝着metabonomics靠近。

在中文的表述中，没有必要将两个名词分开,一律用“代谢组学”以避免不必要的名词混淆。

2002年以来，Nicholson等[21]和Fiehn等[22]分别撰写综述文章从不同的角度阐明代谢组学是研究药物毒性和基因功能的平台技术，以及联结基因型和性状表型的有力工具。

这一系列论述奠定了代谢组学的基础。

代谢组学的出现，主要得益于分析技术的发展使得对大量样品和大量代谢物的快速定量测定成为可能，而最为常用的方法是核磁共振(NMR) 和质谱(MS)(图1) 。

1 代谢组学的发展趋势代谢组学是一个全新的研究热点。

这主要表现在：第一、代谢组学的研究论文数正在以指数方式增长(图1)；第二、高影响因子(>8.0) 学术刊物上发表的论文数量较多(>60 篇)[17~19,21,23~81]；第三、核心论文引用率高，其中引用100 次以上的有6篇，单篇最高引用接近240 次；第四、研究范围广泛并不断增加，涉及到功能基因组学、营养学、病理学、药理学、毒理学、植物学、微生物学以及系统生物学等众多领域；第五、仪器和分析技术的快速发展为代谢组学的进步提供了更加广阔的空间，也就带来了更多的挑战和机会。

不断提高的磁场强度使得核磁共振谱仪的分辨率有了更进一步的提升，超低温探头的出现也让NMR的检测灵敏度有了一定程度的提高。

自动进样技术极大的缩短了大批量样品的检测时间。

而计算机技术的飞速发展为数据分析的速度和可靠性提供了更有力的支撑。

2 代谢组学与基因组学、蛋白质组学的关系代谢组学研究的是在病理生理刺激或基因改变条件下生物体系代谢水平的应答，此前提出的基因组学和蛋白质组学则分别从基因水平和细胞蛋白表达水平研究生物体系对药物刺激的响应。

每个物种的基因组所含的基因序列与基因数目相对固定，但这些基因的表达水平会随着发育阶段不同或外部条件的变化而变化。

从药物研究和毒理学的角度来看，基因组学研究的是生物体受外源性药物刺激后基因表达的改变，然而基因表达的改变或者调节与细胞系统整体功能之间的关系尚不清楚。

因此蛋白质组学方法主要针对给药或其它病理生理过程引起的细胞蛋白质组成的变化进行半定量测量[82~84]。

尽管与基因组学相比，蛋白质组学研究不那么昂贵，但是由于蛋白质数量众多，现有蛋白组学手段通量有限，因此劳动强度较大，进展缓慢。

同时必须指出，基因组、转录组和蛋白质组研究更强调生命过程的调控机制和物质基础，而代谢组是以体内生物化学反应的产物的整体变化为出发点来研究生命过程的本质。

事实上，多数哺乳动物(如人)是动物体本身(宿主)和消化系统微生物菌群共同进化、协同工作的“协同生物体”(symbiotic species)[85]，对宿主本身的基因，蛋白质的认识只是该体系的一小部分[86]。

因此，基因组、转录组、蛋白质组和代谢组是从不同层面和水平上研究生命过程的途径。

基因和蛋白质数量众多，它们的功能除了与一级和二级结构有关外，在更多情况下与它们的三级结构、动力学过程和相互作用有关。

这也是功能基因组学和功能蛋白质组学研究的重点。

与此形成对比的是，代谢物分型要少得多。

目前已知的代谢物只有几千种。

由于代谢物是生命过程的终端产物，不仅分子量小而且在所有的生物体中都是相同的，因此，一般不存在三维结构和动力学的问题，也不要求完整的基因序列或者庞大的EST(Expression Sequence Tag)数据库。

基因和蛋白表达具有重复性，由此导致的代谢物或代谢水平的变化则具有累加性。

这种含量上的放大效应，使得代谢物的识别比基因或蛋白质的识别要容易得多。

有限的代谢物分型必然导致一种代谢物同时涉及多个代谢过程或代谢循环。

每个代谢循环会产生多个代谢物，不同代谢循环之间相互联系、互相影响。

代谢组学正是从代谢物整体变化的角度来研究生物体对各种刺激的动态响应。

3 代谢组学研究方法体液中的代谢物质与细胞以及组织中的代谢物质处在一个动态的平衡当中，所以当机体由于毒性或代谢障碍导致组织细胞出现异常的时候，生物体液的组成就会产生变化。

代谢组学研究方法就是检测代谢物水平的整体和动态变化，提取潜在的有诊断或常规程序化价值的生化信息，以此来反映生物体在外源刺激作用下真实的体内的生物学过程，建立“组学”参数的输入与响应输出之间的联系。

代谢物整体水平的检测所依赖的方法是分析化学中的各种谱学技术，如核磁共振波谱、质谱、高效液相色谱、红外光谱、紫外可见光谱以及各种原子光谱等。

对海量谱学数据进行统计和归类分析，从中提取代谢特征或代谢时空的整体变化规律，是分析化学中的化学计量学或化学信息学的研究范畴。

值得指出的是，代谢组学所强调的代谢特征或代谢时空的整体变化，不是传统意义上的某种代谢物或少数几种代谢物含量和存在方式的变化。

建立代谢特征或代谢时空的变化与生物体特性的变化之间的有机联系，是代谢组学研究的最终目标。

因此，分析化学在代谢组学研究中发挥着非常重要的作用，甚至是不可取代的作用。

3.1 代谢组学的研究过程代谢组学研究一般包括四个步骤：第一步，给予生物体一定的刺激。

这种刺激可以是基因的变异、剔除或引入，体内生物过程的催化或抑制，致病或致病物质(无机、有机、病毒、细菌、寄生虫等等)的引入，以及各种环境因素的改变等等。

除了刺激因素之外，引入刺激的时间和强度等也需要精心设计。

适合于代谢组学研究的样品种类非常广泛，可以说是无所不包，例如尿液、血液、组织或组织提取物、器官甚至整个生物体等等。

样品收集时间、部位、种类等应给予充分考虑。

第二步，代谢组数据的采集。

用核磁共振、质谱、色谱等分析手段测定其中代谢物的种类、含量和状态以及其变化。

第三步，建立表征代谢特征的时空模型[87]。

在代谢组学中最常用的建模方法是主成分分析(Principle Components Analysis, PCA)。

PCA 是对多变量数据进行统计处理的一种数据线性投影方法，它在保留原有信息的基础上将高维空间中的样本投影到较低维的主成分空间中。

其基本思路是以一种最优化方法浓缩数据，寻找几个由原始变量线性组合而成的主成分,以揭示原始数据的特征，提取基本信息，实现对数据的可视化和样本的分类聚集。

用PCA 方法建立的以代谢物的种类、含量和状态随时间的变化为基础的代谢物时空模型应能够清楚地反映出外源性刺激的种类、程度和动态变化以及引起样本在时空模型中的不同分布的标志性代谢物。

第四步，建立代谢物时空变化与生物体特性的关系，达到从不同层次和水平上阐述生物体对相应刺激的响应的目的。

3.2 基于NMR的代谢组学的特点作为众多化学分析方法中的一种，NMR在代谢物组学的研究中起着非常重要的作用。

这主要取决于NMR所具有的优势：首先，用NMR分析生物体液等复杂混合物时样品的前处理简单，测试手段丰富，包括液体高分辨NMR、高分辨魔角旋转(HR-MAS)NMR 和活体核磁共振波谱(MRS)，因此，能够在最接近生理状态的条件下对不同类型的样品进行检测。

其中需要特别提到HR-MAS方法，该方法是将样品在与静磁场成魔角(54.7°) 的方向旋转，消除了磁场不均匀性、化学位移各向异性和偶极－偶极相互作用带来的谱线增宽影响，从而可以获得与液体高分辨NMR相媲美的分辨率。

更重要是，这种方法对代谢物在组织中的定位有独特的优点，目前已经有不少将此方法用于肝脏[88~90]，脑组织[91~93]，前列腺[94~96]等组织的研究报道。

其次，NMR 是一种无损的多参数和动态分析技术，NMR同时具有定性分析和定量分析功能，并且通过单次检测可以得到所有含量在NMR检测限以上的物质(含有NMR可观测核的物质)的特征NMR谱，以及这些物质在整个刺激周期中的动态变化，而且NMR谱携带有丰富的分子结构和动力学信息；再次，NMR检测可以在很短的时间内完成(一般5～10 min)，这对于实现高通量样品检测和保证样品在检测期内维持原有性质来说是至关重要的。