免疫学检测方法

斑点免疫金渗滤法原理：
NCM为固相载体-----通过渗滤----抗原与抗 体在膜上快速反应-----标记的胶体金堆积显 色。
胶体金
吸水垫
抗原
抗体
NCM
临床应用： 间接法测抗体：
NCM 抗原----样品抗体----金标抗抗体显
色
夹心法测抗原：
NCM多抗----样品抗原----金标单抗显色。
与阴性对照的值），判定ELISA反应结果。大于2.1时可判断为阳性。 以最大显色至阳性的显色孔50%反应孔的抗体稀释倍数为抗体效价。
图 DOT BLOT方法筛选结果图。
免疫组织化学方法定扇贝血细胞分布
细胞免疫化学法检测病毒感染
四、Western blot
是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法 。 原理及步骤 样品
荧光色素
异硫氰酸荧光素（FITC） 四乙基罗丹明（RB200） 四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC)
1、荧光抗体染色方法
直接法
间接法
2、荧光抗体技术的应用 在细菌学诊断中的应用 在病毒感染诊断中的应用 其它方面的应用
间接荧光抗体法（IFAT）操作步骤如下：
（1）单层血细胞滴片，室温晾干，放入丙酮中固定10min。 室温晾干。 （2）以小白鼠抗血清（或杂交瘤细胞上清液）为第一抗体 ，加在血细胞抗原上。37℃湿盒中孵育45min。 （3）0.01M PBS洗三次，每次5min。 （4）加第二抗体IgG-FITC ，37℃湿盒中孵育45min。 （5）0.01M PBS洗三次，每次5min。 （6）甘油封片，荧光镜下观察，拍照。
2
3
4
5
6
7
0.9 0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
1.0
兔抗X菌血清
0.1 0.1(1 0.1(
)
2)
0.1( 3)
0.1( 4)
0.1(5 0.0 )
2.玻片凝集法
A.用1ml移液枪取6号离心管中的溶液一滴滴在载玻片的一端，另一端加一滴 磷酸盐缓冲液，然后分别加一滴准备好的X菌液。
B.牙签混匀，至于显微镜下观察，看是否有凝集块的形成。 C.后取5、4……1号管的溶液逐个重复1、2步骤。 D.取有凝集块变为无凝集块时,那个有凝集反应的试管作为抗体的效价。
间接免疫荧光法检测对虾白斑症病毒病
间接免疫荧光法检测淋巴囊肿病毒
直接ELISA
间接ELISA
间接酶联免疫吸附试验
操作步骤如下： （1）分别以不同单抗为第一抗体，加在血细胞抗原上。37℃湿盒中孵育60min
。 （2）0.01M PBS洗三次，每次5min。 （3）加AP-IgG 为第二抗体，37℃湿盒中孵育45min。 （4）0.01M PBS洗三次，每次5min。 （5）加NBT/BCIP底物缓冲液发色10min， （6）出现颜色加终止液终止反应。 （7）用酶标分析仪在405nm,处测定各孔的吸光度，计算P／N（样品光吸收值
当抗原和金标抗体反应时，肉眼可见红色或 粉红色斑条（点）,在显微镜下观察，抗原 抗体结合处为黑褐色的颗粒。
斑点免疫金渗滤法（DIGFA）的应用 与研究进展
是20世纪八十年代发展起来的一种免疫学检 测方法，具有简便、快速、准确等优点。目前在 医学检验中主要应用于检测 HBsAg、HCG 和 HIV等。
1、原理
荧光免疫技术是一种以荧光物质作为标记 物的免疫分析技术，荧光物质的分子在特定 条件下吸收激发光的能量后，分子呈激发态 而极不稳定，其迅速回到基态时，以电磁辐 射形式释放出所有的光能，发射出波长较照 射光长的荧光。荧光免疫技术可分为荧光免 疫组织化学技术和荧光测定技术。荧光抗体 技术属于前者，它是利用某些荧光素通过化 学方法与特异性抗体结合，形成的免疫复合 物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此 借助荧光显微镜检测或定位被检抗原。其又 可分为直接荧光抗体法、间接荧光抗体法和 补体荧光抗体法。
铁蛋白抗体法 酶标记抗体法 重金属标记抗体法
图 胶体金标记免疫电镜结果[(A) (D) bar = 200 nm; (B) (C) bar = 100 nm]
胶体金免疫技术
胶体金是氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸 等作用下的水溶液，具有高电子密度，并能 与多种大分子发生物理吸附，因此，不但所 有的大分子物质都可被金标记，而且标记后 大分子物质活性不发生改变。
聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白 （SDS-PAGE )
转移（印迹）于硝酸纤维素膜
加抗体检测某种特异性蛋白质
West Blot
Leabharlann Baidu
图：淋巴囊肿病毒与抗血清的Western blotting结果
免疫电镜技术
免疫电镜技术（immune electron microscopic technique） 是一种将免疫学技术与电子显微镜技术相结合的血清学方 法，能使抗原在分子水平上进行定位。它实际上是将细胞 水平的荧光抗体技术的基本原理应用于分子水平上。这一 技术的发明使抗原和抗体的定位研究达到了亚细胞或分子 水平。主要有以下几种技术。
沉淀凝集反应
双向免疫扩散沉淀线示意图
琼扩反应
中和实验
荧光免疫技术
荧光免疫技术又称荧光抗体技术。它将免疫 化学和血清学的高度特异性和敏感性与显微技术 的高度精确性相结合，为免疫学、临床组织化学 及实验室诊断提供了一项其它方法尚不能取代的 、并有其独特风格的技术。目前，该技术已广泛 应用于细菌、病毒、原虫以及真菌等的鉴定和相 应病的诊断，血清抗体的检查，病理组织学抗原 、抗体和补体的鉴定及定位，免疫复合物病理的 研究，细菌、病毒与细胞之间抗原关系的研究等 方面。其主要优点在于：特异性强，速度快，敏 感性高；其缺点在于：非特异性染色问题尚未解 决，结果判定的客观性不足，技术程序也比较复 杂。
直接法检测抗原
NCM病毒---金标单抗显色
DIGFA步骤简化、时间缩短。
DIGFA检测操作程序
检测技术种类
一、免疫学检测
免疫凝集试验 免疫沉淀试验 酶联免疫试验 荧光免疫技术 免疫电镜技术 免疫印迹试验
细菌凝集反应被广泛应用于细菌学的诊断。在凝集反应 中，将参与反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。
凝集法测定哈维氏弧菌抗体的效价
1.稀释抗体
管号 磷酸盐缓冲液
1