干细胞鉴定ppt课件

CD44 ≥70 % 阳性
CD29 ≥70 % 阳性
CD105 ≥70 % 阳性
名称 检验标准 结论
CD117 ≤5 % 阴性
CD34 ≥70 % 阳性
CD44 ≥70 % 阳性
CD29 ≥70 % 阳性
Sca-1 ≥70 % 阳性
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胞 细 干 间 肪 脂 鼠 质 大
4.
胞 细 干 质 间 髓 骨 鼠 大
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Von Kossa染色
确定细胞外基质矿化的方 法，只有成骨细胞在体外 培养时能形成矿化的细胞 外基质，一般培养至 6~8 周即可出现。原理是将矿 化基质中的磷酸盐(钙)、 碳酸盐(钙)转变为磷酸银、 碳酸银，然后用日光、紫 外线或强还原剂使其还原 为黑色的金属银。
≥70 % ≥10 % ≥50 %
按1:6分种率，2～3天可 传代 按1:6分种率，5～7天可 传代 按1:6分种率，3～4天可 传代
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间质干细胞



定义：来源于中胚层的早期细胞，主要存 在于结缔组织和器官间质中，能够分化为 多种中胚层和神经外胚层来源的细胞。 来源组织：骨髓、骨膜、脂肪组织、脐血 等。 来源物种：人、大鼠、小鼠、猴子、犬、 兔子、猪等。
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鉴定方法

形态学：梭型、纤维样贴壁细胞 表面抗原：MSCs属混杂细胞群，其表面抗原也具有非专一性, 它表达了 间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括: ①黏附分子, 如 CD166、CD54、CD102、CD44、CD106 等。②生长因子和细胞因子受体, 如白介素21 受体( IL-1R )、IL-3R、IL-4R、IL-6R、IL-7R、C干扰素受体 ( IFN-CR)、肿瘤坏死因子(TNF) -A等。③整合素家族成员, 包括CD49a、 CD49b、CD49c、CD29、CD104 等。④其他如CD90、CD105 等。不表达 造血细胞的表面标志, 如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8 等, 也不 表达与人白细胞抗原(HLA ) 识别有关的共刺激分子及主要组织相容性复合 物类分子如HLA-DR 抗原等。 多向分化能力：如可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、 平滑肌细胞、骨髓基质细胞、成纤维细胞及多种血管内皮细胞，甚至神经 系统的神经元和神经胶质细胞
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生长增殖要求
细胞类别 复苏存活率 ≥80 % 增殖速度 按1:3分种率，2～3天可 传代 细胞密度(个/cm2） 人：1.5~2.5X104 大鼠：6x103 小鼠：8x103 兔：2~3x104 狗：1.5~2.5X104 5~10X104 1~5X104 1.5X105
间质干细胞
小鼠胚胎干细胞 人胚胎干细胞 大、小鼠神经干细 胞
3.
名称 检验标准 结论
CD34 ≤5 % 阴性
CD45 ≤5 % 阴性
CD11b ≤5 % 阴性
CD44 ≥70 % 阳性
CD29 ≥70 % 阳性
CD90 ≥70 % 阳性
名称 检验标准 结论
CD34 ≤5 % 阴性
CD45 ≤5 % 阴性
CD11b ≤5 % 阴性
CD106 ≤5 % 阴性
CD44 ≥70 % 阳性
干细胞鉴定
Oricell TM 检测项目

常规检测：细菌、真菌检测；支原体检测； 内毒素检测；
来自百度文库

鉴定检测：生长形态、增殖能力、诱导分 化能力、特异性抗原表达、核型分析等
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常规检测
项目 细菌、真菌检测 支原体检测 检测方法 直接接种培养法 直接接种培养法 PCR法 内毒素检测 凝胶法 检测对象 培养上清液 培养上清液 细胞 培养上清液 检测标准 阴性 阴性 阴性 ≤50EU


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形态学
梭形、纤维样细胞 原代：克隆样生长 传代后：均质、旋涡状排列
Human
Rat
Mouse
Dog
Monkey
Rabbit
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定鉴式流（原抗面表 ）
干 间 骨 小 胞 细 质 髓 鼠 细 质 髓 人 胞 干 间 骨 1. 2.
名称 检验标准 结论
CD14 ≤5 % 阴性
CD45 ≤5 % 阴性
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成骨诱导检测方法
茜素红染色
成骨诱导过程中钙离子以 钙盐的方式沉淀下来，形成 “钙结节” ，茜素红和钙发生 显色反应，产生一种深红色 的带色化合物，这样成骨诱 导的细胞外沉积的钙结节也 就被染成深红色。
碱性磷酸酶染色
碱性磷酸酶活性是成骨细胞 分化成熟的重要标志。BCIP/NBT 是碱性磷酸酯酶的常用底物。 在其催化下， BCIP会被水解产生 强反应性的产物，该产物会和NBT 发生反应，形成不溶性的深蓝色 至蓝紫色的NBT-formazan。
CD29 ≥70 % 阳性
CD90 ≥70 % 阳性
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诱导分化能力



成骨：茜素红染色 成脂：油红O染色 成软骨：阿利辛蓝/甲苯胺蓝染色
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成骨诱导

诱导原理：
地塞米松：通过促进Cbfal mRNA（核心结合因子-1） 和 Osterix mRNA（成骨分化必需转录因子）的表达而促进骨 髓基质细胞向成骨细胞分化。 β-甘油磷酸钠：提供磷离子作为ALP 作用的底物，诱导和 激活ALP，促进有机磷向无机磷转化，为钙盐矿化沉积提 供条件。 Vc：一种重要的营养素和氧化还原剂，在骨盐代谢及骨形 成中具有重要作用。在体外，它能增加钙盐的沉积，促进 矿化结节的形成。
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鉴定检测共通项目

复苏存活率：台盼蓝拒染法--如果细胞膜不 完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变 蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为 台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。
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细胞倍增时间：生长曲线测定（计数法或MTT法）
Growth Curve 60
（1X104 ） Cell quantity
50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7
Day 细胞倍增的时间区间即细胞对数生长期，细胞传代、实验等多应在此区间进行。可在 细胞生长曲线的对数生长期找出细胞增加一倍所需的时间，即倍增时间。
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细胞周期测定： 碘化丙锭(PI)染色流式检测法
由于细胞周期各时相的DNA 含量不同，通常正常细胞的G1/ G0 期具有二倍体细胞的 DNA 含量(2N) ，而G2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N) ，而S 期的DNA含量介 于二倍体和四倍体之间。因此，可通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA 含量进行 检测，由此可知细胞周期的分布情况并确知细胞的倍体是否正常。