细菌生物被膜

细菌生物被膜（或称细菌生物膜Bacterial biofilm，BF），根据《Annu Rev Microbiol》等权威期刊所归纳发表的定义，生物薄膜是指细菌粘附于接触表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物。

多糖基质通常是指多糖蛋白复合物，也包括由周边沉淀的有机物和无生物被膜是微生物为适应自然环境而形成的。

例如：河流中的微生物就能吸附在岩石表面，这种吸附作用更有利于自身的生存。

对于细菌来说，它可以分泌多糖蛋白复合物(glycocalyx)将自身粘附于各种物体的表面，细菌在所吸附的物体表面不断分裂就形成了细菌生物被膜。

使病原菌可以在体内插管表面及粘膜表面形成生物被膜［1］。

三、细菌生物被膜的致病特点一般来说细菌生物被膜导致的难治性细菌感染性疾病有以下特点：1.病灶局部的炎症反应不很强烈，感染有相互转化的静止期和发作期；2.抗菌药物治疗起初可能有效，但以后治疗常常失败；3.致病菌主要是来自皮肤和周围环境中的致病菌如铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌［1］。

铜绿假单胞菌是慢性呼吸道感染的重要致病菌之一，它的粘液型菌株可以产生藻酸盐，而非粘液型菌株可以产生其它种类的多糖蛋白复合物形成细菌生物被膜。

比较典型的病例是肺囊性纤维化合并肺部感染，虽然抗菌药物有一定的临床疗效，但是铜绿假单胞菌总是难以彻底清除，电镜观察可见病变部位有细菌生物被膜形成。

其中藻酸盐是重要的组成成分，它可以使细菌牢固地粘附于肺上皮表面形成生物被膜，一方面可以抵御单核-巨噬细胞的吞噬作用，另一方面可以抵制抗菌药物的杀灭作用。

进一步的研究表明，铜绿假单胞菌藻酸盐的合成是由细菌alC和alD基因控制的。

有实验表明，铜绿假单胞菌和硅胶膜表面接触后，可以激活控制藻酸盐合成的基因组，促使细菌合成大量的藻酸盐。

所以细菌生物被膜的形成是受严密的基因调控的［12］。

1、生物膜的研究历史：1676 年Antony用自制的显微镜从牙菌斑中观察到了微生物的存在,为生物膜的研究奠定了基础。

Bayston 和Penny (1972年) 首先认识到表皮葡萄球菌生物膜形成与其在多聚物表面定植有关。

后来,通过扫描电镜发现葡萄球菌在导管表面定植,多层细菌嵌于多糖-蛋白复合物(Glycocalyx) 中形成生物膜。

1978 年Costerton 首先开始了对细菌生物膜的研究并提出生物膜理论。

生物膜研究涉及微生物学、免疫学、分子生物学、材料科学和数学等多学科,其真正作为一个独立学科发展起来始于20 世纪70 年代末。

90 年代后,随着相关学科的发展及对BF 细菌在医学上重要性的认识,BF研究得到迅速发展。

1990年,蒙大拿州立大学建立了世界上第一个生物膜工程中心。

2、生物膜的成份生物膜中水份含量可高达97 % ,除了水和细菌外,生物膜还可含有细菌分泌的大分子多聚物、吸附的营养物质和代谢产物及细菌裂解产物等。

因此, 生物膜中存在各种主要的生物大分子如蛋白质、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等物质3、生物膜的特性BF是细菌在表面生活时采取的一种生长方式，它是细菌的一种本能，任何细菌均能形成BF。

但当细菌发生遗传改变时，则可影响其形成BF的能力。

具体到某一菌株能否形成BF，是与其所处的环境密切相关的，如环境中的营养成分、温度、渗透压、pH、铁离子浓度和氧化还原电位等因素，其中，营养成分对BF的形成具有重要作用。

此外，BF可由纯菌种形成，也可以由多菌种组成。

细菌的生物膜与浮游细胞在生长过程中具有本质的区别，在细菌的生物膜的不同区域，细菌的生理状态和基因表达不同，并且生物膜可以形成运输营养和代谢产物的孔道，细菌生物膜的这种复杂的结构和代谢方式与高等生物的组织相似。

4、生物膜形成过程细菌生物膜的形成需要胞间信号的相互传递和一系列有别于游走态细胞的遗传物质的活动。

首先,游动细胞接受环境中的营养信号,通过鞭毛或纤毛等附着结构粘附于表面;附着于表面后,进行生长、分裂、繁殖,同时其他游走细胞继续附着,最终导致该附着位点的细菌生长环境极度拥挤,有毒代谢产物积累,许多细菌得不到营养物质;在这种竞争压力下,细菌启动胞间信号系统,产生胞间信号;在胞间信号系统的调节下,细菌一边分泌胞外多糖,一边从附着的表面轻轻移动,最后形成蘑菇样或柱样亚单位,多个单位形成具有三维立体结构的成熟细菌生物膜。

当生物膜内环境不适应时,细菌可分泌胞外水解酶水解胞外多糖,膜内细菌脱离( detached) 生物膜,成为游走态细胞。

脱离生物膜的游走细胞继续粘附、生长、分裂、分化,形成生物膜。

形成游走细胞—细菌生物膜—游走细胞—细菌生物膜的循环往复。

5、生物膜内细菌的分布及信号传导生物膜内细菌分布并不是简单杂乱无章的。

电子显微镜、激光共聚焦显微镜( scanning confocal laser microscopy) 、荧光探针、报告基因技术( reporter gene technology) 等观察分析研究发现,生物膜内环境是不一致的, 通常越接近基质, 氧的浓度和pH 值越低。

在同种细菌组成的生物膜内,细菌通过调整基因的表达来达到最大限度地适应其生存的特殊环境。

在自然条件下所形成的多菌混合型生物膜内,细菌除调整自身以适应所处的生物膜微环境外,还要根据种间的共生关系调整自身,以使其达到最适生存条件。

因此,无论是单菌种还是多菌种组成的生物膜内,细菌都不是随机分布的,而是按各自的最适生存需求所组成。

只有在生物膜表面的细菌才具有旺盛代谢活动,接近基质的细菌处于缓慢生长或不生长状态。

在生物膜内,细菌之间通过细菌的产物来实现信息传递。

高丝氨酸内酯是已被证实了的在天然或培养条件下,生物膜内细胞间的信号传递分子。

在单菌种组成的生物膜中,高丝氨酸内酯在形成和维持生物膜的三维空间结构中起着关键作用,不产高丝氨酸内酯的缺陷型菌株紧紧包裹在一起的细胞,极易被十二烷基硫酸钠所破坏。

Davies 等研究证实,铜绿假单胞菌生物膜形成过程中,细胞间信号传导系统(LasR～LasI 信号系统) 起着关键作用。

该系统能自身调节且高度感应和应答(quorum sensing and response) 。

lasI基因的产物调节弥散性胞外信号物质32氧十二酰-L-高丝氨酸内酯(3OC1-2HSL) 的合成,3OC1-2SHL 积累到一定量即启动lasR 基因, lasR 基因产物是转录调节因子, 该因子反过来促进lasI 基因表达3OC1-2HSL 。

发生LasR～LasI 信号系统突变的铜绿假单胞菌,仍可产生相同量的胞外多糖,可粘附和繁殖,但不能形成成熟生物膜的复杂结构。

这说明LasR～LasI系统主要参与细菌生物膜的分化,可以肯定,还有其他胞间信号参与了生物膜的形成。

多菌组成的生物膜胞间信号的作用知道不多,但它与在单菌组成的生物膜的情况有明显差异。

信号分子对细菌定植在已形成菌落或定植在竞争十分剧烈的环境表面起着十分重要的作用。

这些信号分子包括细菌代谢产物如细菌素、高丝氨酸内酯、分泌蛋白,甚至于包括RNA 和DNA 在内的遗传物质和还未被发现的细菌产物。

这些信号分子可以改变生物膜内的种群分布,改变相邻细胞蛋白的表达,将某些遗传特性(如抗药性) 传递给邻近细胞。

因此,在多菌组成生物膜内,细胞间的信号传递对于膜内细菌的定植和分布起着关键作用。

生物膜内细菌分裂受到周围多糖的限制。

在一个成熟的生物膜内,细胞很少发生分裂,大部分能量用于合成胞外多糖。

当细菌处于饥饿或其他不利条件下,细菌能分泌胞外多糖水解酶,将胞外多糖水解,从生物膜内游离出来,寻求更适宜的生存环境。

6、细菌生物膜相关感染近年来,随着抗菌药物不断问世,感染性疾病的防治有了很大的改善,然而一些难治性感染,即使使用药敏试验确定有效的抗生素,短暂临床缓解,但感染反复恶化。

此外,随着现代医学高科技的发展,新型生物材料的应用日益增多,生物材料相关感染发生逐年上升。

根据流行病学调查,导尿管相关泌尿系统感染发生率为92 %～93 % ,约占院内感染的40 %;心脏外科生物材料植入术合并感染发生率为3313 %;99 %的机械通气患者气管插管处有细菌定植并反复发生感染;大静脉导管,伤口引流管,人工关节置入等相关感染的发生率也很高。

Rontery 总结了生物医学材料与生物膜相关感染的细菌,主要包括革兰氏阳性的肠球菌、葡萄球菌、链球菌和革兰氏阴性的大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、变形菌和铜绿假单胞菌等。

近年来大量的研究证实,人类的许多慢性和难治性感染如慢性呼吸道感染、慢性泌尿系统感染、骨髓炎、心内膜炎、中耳炎、前列腺炎、牙周炎以及某些肾结石的形成等大都与细菌生物膜有关,据美国疾病预防与控制中心(CDC)专家估计, 65 %以上的人类细菌感染与生物膜有关。

6、细菌生物膜耐药某些与生物膜相关的感染性疾病生物膜内的细菌表现出的这种极强耐药性的机制目前还不十分清楚,有渗透限制(penet ration limitation) 、营养限制( nutrient limitation) 和表型(phenotype) 推断三种学说。

渗透限制学说认为,生物膜内的细菌对抗菌剂的不敏感性是由于生物膜内细菌分泌的胞外多聚物被膜所形成的屏障,阻止了抗生素的穿入。

这一假说被许多研究者所接受,并被一些研究所证实。

但正如Stewart 所指出,对多数抗生素来说,渗透限制还不足以解释生物膜内细菌的耐药性。

营养限制学说认为,生物膜内细胞,至少是部分细胞,由于受到营养供给的限制,处于缓慢生长或饥饿状态,这种状态的细胞对抗生素不敏感,或者使对只杀伤处于分裂状态的细胞的抗生素难以发挥作用。

研究表明,生物膜内细胞的确存在明显的空间不均一性( spatial heterogeneity) ,只有位于生物膜顶部的细胞具有代谢活性。

但Karen 认为,该假说还不能对生物膜引起的顽固性难治感染做出满意的解释,如果该假说成立,那末生物膜顶部具有代谢活性的细胞就能被杀菌剂所杀死,之后,原来位于次层的受到营养限制处于缓慢生长或不生长的细胞,就成为生物膜顶部细胞,重新具有代谢活性,可被杀菌剂杀死。

这样生物膜内层细胞就会逐步被消灭,最终细胞全部被消灭,生物膜消失。

显然,这与实际情况不符。

表型推断学说认为,细菌生物膜表现出的抗药性可能是生物膜内细胞,至少某些细胞采用一种与游走态细胞不同的有保护作用的生物膜表型( a distinct and protected biofilm phenotype) ,这种表型不是对营养限制的一种反应,而是细菌附着在表面的一种生物学反应,细菌的一些新基因表达产物对生物膜的抗药性起着关键作用。

表型推断学说从基因一表型角度来解释其抗药性,涉及到细菌生物膜抗药性的实质,并被一定的试验所证实。