实验二 显微镜的使用

微生物学实验

微生物实验室规则及要求

⏹实验前要预习，写好预习报告。

⏹保持室内整洁，不要随意走动。

⏹如若发生意外，及时报告老师。

⏹作好实验记录，写好实验报告。

⏹对于实验材料，写好姓名组号。

⏹牢记无菌概念，保持清洁卫生。

⏹上课认真听讲，课后积极讨论。

⏹上课不许闲聊，不得随意走动。

⏹注意实验安全，祝你实验顺利。

实验二、显微镜的使用以及细菌形态观察

一、目的要求：学习并掌握油镜的原理和使用方法

二、材料用具：显微镜擦镜纸香柏油标本

三、显微镜的构造及工作原理

（一）显微镜的构造

微生物学研究用的显微镜物镜通常有：

低倍物镜(16mm，10⨯); 高倍物镜(4mm，40-45⨯); 油镜(1.8mm，95-100⨯)

普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一为机械装置，一为光学系统，这两部分很好的配合，才能发挥显微镜的作用。

1.光学部分:接目镜、接物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等). 它使检视物放大,造成物象.

2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件.它起着支持调节固定等作用.

(1)光源

(2)聚光器聚光器在载物台下面，它是由聚光透镜、虹彩光圈和升降螺旋组成的。

（3）物镜安装在镜筒前端转换器上的接物透镜利用光线使被检物体第一次造像，物镜成像的质量，对分辨力有着决定性的影响。物镜的性能取决于物镜的数值孔径（numerical apeature简写为NA），每个物镜的数值孔径都标在物镜的外壳上，数值孔径越大，物镜的性

能越好。

(二) 油镜工作原理

油镜常标有黑圈或红圈，它是三者中放大倍数最大的。

使用油镜时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与接物镜之间，不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。

这种油常选用香柏油，香柏油的折射率n ＝1.52，而玻璃的折射率n ＝1.52。

当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。

如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系；当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样视野的照明度就减低了

1 数值孔径

利用油镜不但能增加照明度；更主要的是能增加数值孔径。因为

显微镜的放大效能由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线

投射到物镜上的最大角度(称镜口角)的一半正弦，乘上玻片与物镜

间介质折射率所得的乘积，可用下列公式表示：

⏹ NA=数值孔径;n= 介质折射率α—最大入射角 即镜口角

数值孔径的大小又是衡量一台显微镜分辨力强弱的依据；

2、分辨力（D ）:分辨力是指显微镜能辨别物体两点间最小距离的能力。

⏹ 可见光的波长为0.4-0.7微米，平均波长为0.55微米。若用数值孔径为0.65的物镜，

则D=0.55微米/2×0.65=0.42微米。这表示被检物体在0.42微米以上时可被观察到，若小于0.42微米就不能视见。如果使用数值孔径为1.25的物镜，则D=0.22微米。凡被检物体长度大于这个数值，均能视见。

由此可见，D 值愈小，分辨力愈高，物象愈清楚。

根据上式，可通过：（1）减低波长；（2）增大折射率；（3）加大镜口角来提高分辨力。 紫外线作光源的显微镜和电子显微镜就是利用短光波来提高分辨力以检视较小的物体的。物镜分辨力的高低与造象是否清楚有密切的关系。目镜没有这种性能，目镜只放大物镜所造的

A N =2λ D 2sin

α =n A N ⋅

象。

3、放大率：

显微镜放大物体，首先经过物镜第一次放大造象，目镜在明视距离造成第二次放大象。放大率就是最后的象和原物体两者体积大小之比例。因此，显微镜的放大率（V）等于物镜放大率（V1）和目镜放大率（V2）的乘积，即：V=V1×V2

4、焦深：

在显微镜下观察一个标本时，焦点对在某一象面时，物象最清晰，这象面为目的面。在视野内除目的面外，还能在目的面的上面和下面看见模糊的物象，这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深和数值孔径及放大率成反比：即数值孔径和放大率愈大，焦深愈小。因此调节油镜比调节低倍镜要更加仔细，否则容易使物象滑过而找不到。

四、操作步骤

1、取镜

2、调节光源

3、低倍镜观察

4、高倍镜观察

5、油镜观察

油镜观察油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。

使用油镜按下列步骤操作：

1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出。

2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。

3、从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，（或镜筒下降），使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。

4、从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。

注意事项

⏹使用显微镜时应据不同的物镜而调节光线

⏹油镜使用完毕，取下标本片。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾少量

二甲苯擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头，可用绸布擦净显微镜的金属部件。

⏹将各部分还原，将接物镜转成八字形，再向下旋。罩上镜套，然后放回镜箱中。

五、实验报告

1、结果

分别绘出你在油镜下观察到的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的形态，同时标明物镜的放大倍数和总放大率

2、思考题：P18

（1）用油镜便于观察细菌的依据是什么？

（2）使用油镜应特别注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作用？（3）当物镜从低倍镜转到高倍镜和油镜时，对照明度有何要求？应如何调节？

（4）影响显微镜分辨率的因素有哪些？