分子医学技能实验课件：1口腔粘膜细胞基因组DNA制备
从口腔脱落细胞中提取人类基因组DNA
从口腔脱落细胞中提取人类基因组DNA一．实验目的1、了解从细胞中提取DNA的基本原理2、学习从口腔脱落细胞中提取高分子量DNA的基本操作步骤和会影响提取效果的注意事项。
二．实验原理1.用蛋白酶K（使膜上蛋白变性分解）和去污剂SDS（破坏细胞膜的脂质结构）共同消化细胞。
2.然后酚、氯仿等有机溶剂进行抽提，进行DNA的纯化，去掉蛋白质、RNA、多糖等生物大分子。
3.最后用无水乙醇沉淀DNA，干燥后用TE溶解，在4℃下可保存一年。
三．实验步骤1、先用清水漱口。
然后用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。
用1ml生理盐水洗涤，后将1.5ml液体转入1个干净的EP管中，2000rpm离心5分钟，倒掉上清。
2、重复用1.0ml生理盐水洗涤沉淀1次，离心，去上清。
3、沉淀中加500μl 1x细胞裂解液（STE），打散细胞团、混匀，再加15μl 20mg/ml蛋白酶K，充分混匀。
55℃水浴30min。
4、加500μl饱和酚，轻摇混匀，室温12000rpm离心10min。
5、上清（注意不要吸到中间层白色絮状物质以及下层有机相）移至另一加入装有500μl氯仿的EP管，轻摇混匀，室温12000rpm离心10min。
6、吸取400μl上清（注意不要吸到中间层白色絮状物质以及下层有机相）至已装有900 μl预冷无水乙醇的离心管，混合均匀，可见白色絮状沉淀，10000rpm离心5min，DNA沉淀在管底。
7、去上清，加入70%乙醇1ml清洗沉淀，10000rpm离心5min，去上清（尽量用小枪头将液体去干净，但注意不要将沉淀也吸走），室温干燥5min，再用50μl TE buffer溶解沉淀，4℃储藏备用。
四．实验结果五．结果分析编号：100如图所示，100号几乎没有提取出DNA，只有很弱的一条带，如果量再多一些的话，应该也看得到会有几条带。
经过分析后认为主要以下几点原因：【1】.唾液稀释过度，导致取到的细胞很少。
1口腔粘膜细胞基因组DNA制备-201509
减少物理因素对核酸的降解
机械剪切力：强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融 高温
防止核酸的生物降解
核酸酶的预防
常见问题：
1、提取的DNA不纯
原因？改进的方法？
2、提取的DNA成涂布状 原因？改进的方法？ 3、没有获得足够量的DNA 改进的方法？
分子医学实验注意事项
微量移液器的正确使用
（不要剧烈震荡！）
12000rpm5min，上层水相转移至新的EP管②
（高速离心机的使用与安全意识）
加入等体积【氯仿/异戊醇】，颠倒混匀
12000rpm5min，上层水相转移到新的EP管③
加入2倍体积
无水乙醇，颠倒混匀
12000rpm10min
弃上清，沉淀中加入300 l 70%乙醇 12000rpm2min
样品与试剂
实验基本流程和注意事项
实验结果和讨论
总结或感想
完成两部分的作业：课后作业，实验报告
其它
/science-education-database?language=Chinese
QQ群：豌豆射手的奇妙旅程 305333833
取材:用生理盐水漱口后，口含生理盐水10~15ml约2~3min，用 15ml离心管（4000rpm 10min）收集细胞沉淀
（离心机的使用，平衡）
加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀 ，转移至1.5ml EP管①
（微量移液器的正确使用）
混匀，65℃ 温育30min 加入等体积的【饱和酚(~0.25ml)：氯仿/异戊醇(~0.25ml)】 充分颠倒混匀
实验一 口腔粘膜细胞基因组DNA制备
袁 洁 生物化学教研室
分子医学技能实验
口腔微生物分子生物学课件
口腔微生物分子生物学
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(二)RNA的生物合成——转录
• 转录:在RNA多聚酶作用下，以DNA为 模板合成RNA的过程。
1.转录的模板和方向： 有意义链：模板链（3’ →5’DNA链） 反义链：非模板链
口腔微生物分子生物学
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2.RNA多聚酶与启动子 启动子：能特异性地与RNA多聚酶 结合，引发RNA合成。 从DNA上特定起始序列（启动子） 开始，至终止信号结束
口腔微生物分子生物学
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基因表达调节的方式
• 调节蛋白的作用 — 负向调节 — 正向调节
– 3个终止密码子UAA,UGA,UAG，起始 密码子：AUG
– 密码子具有兼并性
– 通用性
口腔微生物分子生物学
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2.蛋白质的生物合成——翻译
蛋白质的合成过程 Ⅰ.氨基酸活化
氨基酸结合至tRNA，即氨基酸活化，由 氨酰-tRNA 合成酶催化。
氨基酸与tRNA结合后，由tRNA根据遗传 密码子将氨基酸按顺序排列合成蛋白质。
口腔微生物分子生物学
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3.转录的起始与延伸
口腔微生物分子生物学
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4.内含子和外显子的概念
原核生物：基因是连续的DNA片段
真核生物：基因由若干个不连续的DNA片段组成的。
内含子：插入序列，它是位于基因的内部，能够被转录 的一段DNA。但在转录后，与之相应的那部分转录产 物在拼接中被去掉了。
外显子：基因中与成熟的mRNA相对应的DNA片段，它
不仅包括蛋白质编码的部分，而且包括5’和3’末端不
翻译的前导序列和尾随序列。
口腔微生物分子生物学
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釉原蛋白基因表达示意图
口腔微生物分子生物学
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口腔粘膜细胞基因组DNA制备
总结词
介绍口腔粘膜细胞基因组DNA制备在 口腔癌研究中的应用。
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口腔粘膜细胞基因组DNA制备
目录
• 实验准备 • 实验步骤 • 结果分析 • 注意事项 • 参考文献
01 实验准备
实验材料
口腔粘膜细胞样本
用于提取基因组DNA，应确保样本新鲜、无污染。
离心管
用于细胞洗涤、离心等操作。
吸头和移液器
用于精确转移液体。
实验设备
离心机
用于细胞离心分离。
恒温震荡器
用于细胞培养过程中的震荡培养。
3
遵循文献中的方法
在进行实验时，应遵循文献中报道的方法，并注 意文献中提到的关键细节，以确保实验结果的可 重复性。
05 参考文献
参考文献
总结词
详细描述口腔粘膜胞基因组DNA制 备的实验原理、实验材料、实验步骤 和注意事项。
详细描述
口腔粘膜细胞基因组DNA制备是基因 组学研究中一项基础且重要的实验技 术。通过该技术，可以从口腔粘膜细 胞中提取出高质量的基因组DNA，为 后续的基因组分析提供可靠的样本。 实验原理基于DNA的抽提和纯化，通 过使用特定的缓冲液和离心技术，去 除细胞中的蛋白质和其他杂质，从而 获得纯净的基因组DNA。实验材料主 要包括口腔粘膜细胞、缓冲液、离心 管、离心机等。实验步骤包括细胞收 集、细胞裂解、离心分离、洗涤和 DNA干燥等。注意事项包括避免交叉 污染、确保细胞充分裂解、控制温度 和时间等。
DNA释放
在细胞裂解液中加入蛋白酶K，消化细胞蛋白，释放出基因组 DNA。
DNA纯化
去除杂质
将释放出的基因组DNA与杂质混合物进行离心，去除蛋白质、RNA等杂质。
一、口腔粘膜脱落细胞采集二、口腔拭子基因组DNA提取（天根Kit
一、口腔粘膜脱落细胞采集注意：为了保证样本不被食物或者饮料污染，取样前30min内请勿进食和饮水。
1、洗净双手；2、取出棉签；3、手持棉签，伸进口腔，从口腔内侧颊粘膜处（腮帮子内侧）反复擦拭40次以上（不时旋转棉棒），取出棉签；4、从试管盒中取出试管，打开管盖，将棉签头部伸入管中，用力掰断，将棉签头部留在管内，并扣紧管盖。
二、口腔拭子基因组DNA提取（天根Kit，DP322）使用前，请先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。
1. 处理材料：将在面颊内擦拭过的棉签转置于2ml离心管中，用剪刀将棉签部分从其杆上剪下，加入600ul缓冲液GA。
注意:如果需要去除RNA，可加入4 μl RNase A(100 mg/ml)溶液(客户自备，目录号:RT405-12)，振荡15 sec，室温放置5 min。
2. 加入40ul Proteinase K溶液，涡旋10 sec混匀，56°C放置20 min，其间每7 min涡旋混匀数次。
3. 加入600ul缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10 min。
此时溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的液滴，然后挤压去除拭子，将尽可能多的裂解液转移至新的离心管中。
注意1: 加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70°C放置时会消失，不会影响后续实验。
如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA 量少和提取出的DNA不纯。
注意2: 如果由于拭子上细胞数少导致提取的基因组DNA少于1 μg，可以在添加缓冲液GB的同时添加Carrier RNA(客户自备，目录号:RT416)。
4. 加300ul无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
注意:加入无水乙醇后可能会出现絮状沉淀，但不影响DNA提取。
5. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CR2中(吸附柱CR2放入收集管中)，12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中。
口腔脱落粘膜细胞中基因组DNA的提取
实验九口腔脱落粘膜细胞中基因组DNA的提取[原理]利用煮沸法裂解口腔脱落粘膜使得细胞破碎，DNA片段释放，基因组DNA溶解于上清中，可取做PCR反应模板。
[器材]1、1.5ml离心管2、微量移液器3、高速冷冻离心机4、加热锅[试剂]1、PBS（137mmol/L NaCI, 2.7mmol/L KCI, 4.3mmol/L Na2HPO4.7H2O, 1.4mmol/LKH2PO4）2、TE溶液[实验步骤]：1、用棉签刮拭口腔粘膜3-4次，将其放入1.5ml离心管内，加入1 ml PBS缓冲液或双蒸水，反复挤压搅动，使细胞脱落；2、10000 r/min离心3min；3、倒掉上清液，沉淀加入100ul TE缓冲液；4、高速振荡5-10sec，悬浮沉淀，沸水煮10min后冰浴3-5 min；5、高速振荡5-10sec；10000/min离心3min；6、取上清液用于扩增反应；4℃保存或冻存剩余DNA。
实验十二瘦素受体基因的限制性片段长度多态性分析[原理]限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP) 技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。
因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。
瘦素受体（LEPR）基因，又被称为糖尿病基因，于1995年被定位克隆，属细胞因子受体超家族，由1165个氨基酸组成。
LEPR是肥胖基因编码产物的受体，其基因变异主要影响机体的体脂分布和脂肪代谢，并通过调节胰岛素的敏感性来参与糖尿病的发生。
LEPR基因多态性来自于其基因序列中的单碱基变异。
目前研究已经证实了瘦素受体基因多种突变和多个多态性位点。
人类LEPR 基因第六外显子上存在有Gln223Arg变异（第668 位碱基A →G变异, 使223位氨基酸Gln被A rg取代）。
口腔基因提取实验报告
一、实验目的本实验旨在通过学习口腔拭子样本的基因组DNA提取方法，掌握基因提取的基本原理和操作步骤，为后续的分子生物学实验打下基础。
二、实验原理口腔拭子样本中包含有口腔黏膜细胞，这些细胞中含有大量的基因组DNA。
本实验采用快速硅胶柱纯化方式，通过裂解细胞释放DNA，然后利用硅胶柱的特异性吸附DNA的能力，去除蛋白质和其他污染物，最终获得高质量的基因组DNA。
三、实验材料1. 口腔拭子样本2. DNA提取试剂盒3. 无菌EP管4. 裂解液5. 蛋白酶K6. 结合液7. 纯化柱8. 洗脱液9. 离心机10. 水浴锅四、实验方法1. 样本处理- 将口腔拭子样本插入无菌EP管中。
- 加入适量的裂解液和蛋白酶K，充分混匀。
- 在58℃水浴锅中孵育15分钟，使细胞破碎，DNA释放到溶液中。
2. DNA结合- 将裂解处理后的液体转移至新的EP管中。
- 加入结合液，充分混匀。
- 在70℃水浴锅中孵育10分钟。
3. DNA纯化- 将液体转移至纯化柱中并离心。
- DNA与滤膜选择性结合。
- 使用洗涤液去除蛋白质和残留的污染物等。
4. DNA洗脱- 使用洗脱液将DNA从滤膜中洗脱。
- 得到DNA产物。
五、实验结果通过以上步骤，成功提取了口腔拭子样本中的基因组DNA。
经检测，DNA片段完整、纯度高，可用于后续的分子生物学实验，如PCR、荧光定量PCR、文库构建、高通量测序等。
六、实验讨论1. 实验要点- 裂解液和蛋白酶K的加入有助于细胞破碎和DNA释放。
- 结合液和纯化柱的选择性吸附能力有助于去除蛋白质和其他污染物。
- 洗涤液的加入有助于去除残留的污染物。
2. 实验改进- 可以尝试使用不同的裂解液和蛋白酶K浓度，以优化实验结果。
- 可以增加洗涤步骤，进一步提高DNA的纯度。
3. 实验应用- 本实验所提取的基因组DNA可用于口腔疾病的研究，如口腔癌、牙周病等。
- 可用于口腔微生物的研究，如口腔菌群与口腔健康的关系。
七、实验结论本实验成功提取了口腔拭子样本中的基因组DNA，为后续的分子生物学实验提供了高质量的DNA模板。
人类口腔黏膜上皮细胞提取基因组 DNA 方法的初步研究
人类口腔黏膜上皮细胞提取基因组 DNA 方法的初步研究孙佳蕊;马行川;陈仲栩;易柳;刘湘;宁勇【期刊名称】《国际检验医学杂志》【年(卷),期】2015(000)011【摘要】目的：探索从人类口腔黏膜上皮细胞中提取基因组DNA 方法的可行性。
方法分别采用煮沸法和碱裂解法从人口腔黏膜上皮细胞提取基因组 DNA ，然后与临床常用的碘化钠（NaI）法提取的人全血基因组 DNA 进行比较。
结果煮沸法和碱裂解法2种方法均能从口腔黏膜上皮细胞抽提到 DNA ，提取的 DNA 浓度虽低于 NaI 法，但用2种方法提取到的 DNA 样品进行聚合酶链反应，均能获得满意效果，与常规 NaI 法无明显差异。
结论从人口腔黏膜上皮细胞提取基因组 DNA简便、快捷、无损，在临床上具有潜在的应用价值。
【总页数】3页(P1513-1514,1517)【作者】孙佳蕊;马行川;陈仲栩;易柳;刘湘;宁勇【作者单位】湖北中医药大学检验学院，湖北武汉 430065;湖北中医药大学检验学院，湖北武汉 430065;湖北中医药大学检验学院，湖北武汉 430065;湖北中医药大学检验学院，湖北武汉 430065;湖北中医药大学检验学院，湖北武汉 430065;湖北中医药大学检验学院，湖北武汉 430065【正文语种】中文【相关文献】1.磁铁矿尾矿宏基因组DNA提取方法的初步研究 [J], 吕志堂;纪翠平;马亭亭2.一种玉米叶片基因组DNA快速提取新方法的初步研究 [J], 雷开荣;石春焱;李明顺;李晓辉;李新海3.无限增殖化人类B淋巴细胞基因组DNA提取方法的建立 [J], 唐斯;李桢;王大明4.酚/氯仿法和盐析法提取人类外周血基因组DNA方法的比较 [J], 宋洁云;刘芳宏;马军;陈远帆;王海俊5.人类外周血基因组DNA提取方法的比较分析 [J], 史嘉翊;高晓虹;邓代千;王斌艳;宋洁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
DNA 的制备41页PPT
沉淀 RNA 洗涤 RNA 沉淀 用 RNase-free ddH2O 溶解 RNA，并置-20C保存 检测 RNA (加５l RNA到１% 琼脂糖凝胶中)
RNA 的检测
哺乳动物细胞的总 RNA
rRNA 80% tRNA 和 snRNA > 10% mRNA 1-3%
制备基因组DNA时的注意事项
(1) 防止内源性 DNase 应快速分离、剪切、匀降组织或快速洗涤培养细胞。
(2) 保证得到高质所污染，否则将影响限制性内切酶
对 DNA 的酶切作用。 高纯度 DNA 的 OD260/OD 280 值大于 1.8；
(2) 蛋白质淬取 用酚/氯仿/异戊醇 (25/24/1) 淬取蛋白质。
(3) 基因组 DNA 沉淀 用 0.1 倍体积的 3 M NaAC 和 2.5 倍体积的 100% 乙醇沉淀 DNA, 用 70% 乙醇除去 DNA 沉淀中的盐离子。
(4) 将基因组 DNA 溶解在 TE 缓冲液中，使其终浓度为 ~1 mg/ml，置 4C 保存。
Northern 印迹方法检测某一特定基因的表达； • 用 RT-PCR 方法检测某一特定基因的表达。
异硫氰酸胍法提取总 RNA
• 异硫氰酸胍和十二烷基肌氨酸钠为强烈的蛋白质变 性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破坏，使 总 RNA 从细胞中释放出来。
50% 蛋白质 /50% DNA 混合物的 OD260/OD280 值大约为 1.5。
基因组DNA的检测
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小鼠基因组 DNA
1. 未被酶切的 DNA 2. HindIII 酶切产物 3. MboI 酶切产物
总 RNA 的制备 (Preparation of total RNA)
口腔黏膜细胞基因组dna提取的应用
口腔黏膜细胞基因组dna提取的应用口腔黏膜细胞基因组DNA提取的应用
生物学中，DNA提取是一项基础而重要的实验技能。
它不仅应用于生
物学领域中的基础研究，还广泛应用于医学、农业、环境等行业。
近
年来，口腔黏膜细胞基因组DNA提取技术在口腔医学领域中得到了广
泛的应用。
一、基因检测
随着医学的发展，基因检测在口腔医学中的应用也越来越广泛。
对于
口腔黏膜细胞基因组DNA的提取，可以用于检测一些口腔疾病的遗传
基础，例如牙齿畸形、唇裂腭裂等。
同时，基于基因的检测方法可以
为患者提供个性化的诊疗方案，进一步提高了医疗诊断和治疗的准确
性和效果，为患者带来更好的治疗体验。
二、口腔癌的早期诊断
口腔癌是一种常见的恶性肿瘤，对人体健康造成了极大的威胁。
然而，该疾病在早期时往往没有典型症状，导致难以及时发现和诊断。
近年来，基于口腔黏膜细胞基因组DNA提取技术的早期诊断方法逐渐成熟。
该方法可以从口腔黏膜中提取DNA样本，进而识别出口腔黏膜上增殖
和生长的异常细胞。
早期检测和诊断口腔癌，不仅可以及时治疗，还
可以避免患者造成长期的生理和心理成本。
三、人口统计学研究
在口腔医学中，基因组DNA提取技术还可以应用于人口统计学研究，例如基于家族史和口腔黏膜细胞DNA提取技术，确定风险人群。
这对于家族性口腔疾病的筛查和预防有着重要的应用。
总之，口腔黏膜细胞基因组DNA提取技术在口腔医学领域中的应用越来越广泛。
在未来，随着基因诊断技术的进一步发展，其在口腔医学领域中的应用前景将更加广阔。
口腔粘膜细胞基因组dna的制备
口腔粘膜细胞基因组dna的制备口腔粘膜细胞基因组DNA的制备可以用于许多不同的研究领域，如遗传学、癌症研究和生物技术。
这篇文档将探讨这一制备过程的步骤以及在这个过程中应该注意的重点。
第一步是收集口腔粘膜细胞，这可以通过口腔刮片或口腔黏膜切片来完成。
收集细胞的质量将直接影响后续步骤的结果，影响DNA纯度和量，因此应该仔细选择收集的细胞并确保采样质量。
下一步是将细胞从样品中分离出来。
对于口腔刮片，这可以通过离心来实现；对于口腔黏膜切片，则需要先处理成单个细胞，可通过一般的消化酶方法来完成，如胰酶-EDTA 或以组织溶解酶（如Niagenase) 为主的酶混合液等。
随后，需要处理细胞以释放DNA。
如果您正在使用口腔刮片，则可以直接将细胞破碎并裂解以释放DNA。
对于细胞悬液，需要通过一系列化学加工和物理活化来裂解细胞膜和核膜以释放DNA，其中一种常用的化学物质是SDS去离子剂（如0.1%）或含蛋白酶K 的方法以诱导细胞的裂解。
将DNA释放后，需要使用酒精沉淀或商用酒精中和某些离子（如为NaCl），对DNA进行净化。
对于较高纯度的样品可以使用硅烷悬浮剂（如Spin column）来纯化DNA。
之后可以通过光度学、凝胶电泳等方法来检测纯度并根据要求调整纯化过程的细节。
总体来说，口腔粘膜细胞基因组DNA的制备需要细心和耐心，以确保DNA纯度和质量的高度，以便在后续实验过程中获得准确的结果。
在此，我们需要注意的是，如何处理DNA样品中的污染物如RNA、蛋白质以及碱基的退火等。
要减少这些影响，建议使用硅烷悬浮剂进行高纯化，也可以在处理前通过酶消化等其他措施来去除样品的杂质。
对于口腔粘膜细胞基因组DNA的制备，这个过程通常不难掌握，只需要注意细节和控制样品的自覆盖等，如果需要自行开发DNA预处理的方法，建议先引用一些比较成熟的试剂、方案，如上述所述，再进行自主开发和优化。
总的来说，在口腔粘膜细胞基因组DNA的制备过程中，需要注意操作规范、重视样本质量并根据实验要进行适当的调整，以确保得到高质量的DNA样本。
口腔细胞DNA萃取步骤
口腔黏膜＊細胞 Nhomakorabea口
腔
細
胞
DNA萃取 溶液
DNA
萃
取
放置恆溫水槽65℃ for 6 minutes
步
驟
放置恆溫水槽98℃ for 2 minutes
DNA水平電泳槽
＊組裝水平電泳膠片等膠片凝 固約15分鐘
Agarose( 膠片)
(三分一的高度)
1.拿Loding dye +自己口腔萃取DNA溶液 染色1:5
(1)溴化乙啶(ETBR)染色 (2)在使用UV照射 (3)最後使用電泳膠片顯像儀，
看自己DNA序列
1.注意事項: (1)ETBR是一個致癌化學物質 ，使用前請戴手 套，使用請小心，觸碰到ETBR請別亂摸周遭環境
2.ETBR廢棄物要在陽光下，照射N禮拜才會分解掉
DNA萃取原理
將複雜的細胞分子混合物加入有機溶媒，除去蛋白質 及其他成分，就可以純化DNA。
一般常用酚及氯仿(phenol/chloroform)可使蛋白質變 性(denaturaion)的特性來進行萃取的步驟，DNA和 RNA不溶於有機溶媒中，而溶於水層。
另外，分子選殖(molecular cloning)常利用洋菜膠 (agarose)來分離不同大小的DNA片段或用以純化 DNA。
2.電壓100V：電流由負極往正極流 3.加好SAMPLE 等待25分鐘左右
Etbr染色原理
EtBr會嵌入核酸配對(雙股DNA或單股DNA、RNA的 自我配對二級結構)之間。
EtBr受到紫外線照射時會發出橘紅色的螢光，與核酸 結合時的螢光強度約是游離態時的20倍。藉此可偵測 核酸。
(跑好電泳膠片)
实验基因组DNA的制备ppt课件
③ 加0.45ml50℃预热的G-A溶液，用1ml枪头快速吸注10次； 若太粘稠，则在45℃下保温5min, 再用1ml枪头快速吸注 10次。冰浴5min.
④ 加0.15mlG-C溶液，混匀，12000rpm离心1min.
⑤ 将样品加于微量滤器（置于2ml离心管中），12000rpm 离心1min.
⑤ 去上相液体，保留间相和下相溶液。加入1ml buffer DV (4℃ 预冷），用力混匀， 12000g离心2min.
⑥ 去上相液体，将下相溶液转移至Filter(置于2ml离心管中）。 12000g离心30秒。
2、实验步骤
⑦ 弃上相，在过滤液中加入400ul buffer DV ,混合均匀。
三、细菌基因组DNA提取 1、 试剂 A. CTAB/NaCl 溶液：4.1gNaCl溶解于80mlH2O中，
缓慢加入10 g CTAB, 加水至100ml. B. 氯仿：异戊醇（24：1）; C. 苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） D. 70%乙醇，
E. TE,
F. 10%SDS, G. 蛋白酶K(20mg/ml),
附注
A. 如需降解RNA, 则在步骤G后加入5ulRNaseA （10ug/ul），37℃保温30分钟，除去RNA （RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省 略该步骤）。
B. 用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提，5000rpm离 心10分钟。
C. 上清液至另一离心管中，加入1/10体积的 3mol/L NaAC及2x体积的冰乙醇，混匀，-20℃ 放置20分钟左右，使DNA形成絮状沉淀。
实验十、基因组DNA的提取
一、概述人们关注的生物基因组学研究中染色体DNA的片段长度应尽可能的长（至少应大于需溶剂的抽提、震荡、反复抽提和乙醇沉淀等步骤都会造 成DNA断裂。我们应尽可能采用温和的方法和手段。
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加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀 ，转移至1.5ml EP管①
（微量移液器的正确使用）
混匀，65℃ 温育30min
加入等体积的【饱和酚(~0.25ml)：氯仿/异戊醇(~0.25ml)】 充分颠倒混匀
（不要剧烈震荡！）
12000rpm5min，上层水相转移至新的EP管②
（高速离心机的使用与安全意识）
不同生物（植物、动物、微生物）的基因组 DNA的提取方法有所不同，分离方法也有差异。 主要根据不同细胞的特点而有区别，但原理相似， 因此它们有共同的步骤： ❖ 裂解细胞：SDS裂解细胞，EDTA抑制核酸酶 ❖ 除去蛋白质：蛋白酶K水解蛋白质，酚和氯仿/异 戊醇抽提、分离蛋白质； ❖ 析出DNA：乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
❖ 减少物理因素对核酸的降解
▪ 机械剪切力：强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融 ▪ 高温
❖ 防止核酸的生物降解
▪ 核酸酶的预防
二、人基因组DNA的制备
❖ 实验目的及意义：
▪ 从人口腔上皮细胞中提取纯的基因 组DNA
▪ 掌握基因组DNA抽提的方法，理解 核酸分离纯化的基本原理
分离纯化基因组DNA的常用方法：
加入等体积【氯仿/异戊醇】，颠倒混匀
12000rpm5min，上层水相转移到新的EP管③
加入2倍体积 无水乙醇，颠倒混匀
12000rpm10min
弃上清，沉淀中加入300 l 70%乙醇 12000rpm2min
轻轻弃去上清，打开EP盖，待乙醇挥发干净 加入30 l 0.1×TE溶液，充分混匀后检测结果
实验一 口腔粘膜细胞基因组DNA制备
蔡俊超分子医学来自能实验一、基因组DNA的提取与纯化
目的：
及PCR分离基因 等。
➢ 是一般的基因工程实验中DNA操作的最初步骤。
核酸分离纯化的总原则：
实验材料及试剂
❖ 材料：人口腔上皮细胞 ❖ 试剂：
▪ 抽提缓冲液：Tris-Cl pH8.0 ，EDTA，NaCl， RNAase， SDS，蛋白酶K
▪ 水饱和酚 ▪ 氯仿/异戊醇（V/V=24:1） ▪ 70%乙醇、无水乙醇 ▪ TE缓冲液：Tris，EDTA
主要试剂的功能
❖ 抽提缓冲液：由SDS、EDTA、蛋白酶K组成
实验报告格式
❖ 实验目的和应用价值 ❖ 实验原理 ❖ 实验基本流程和注意事项 ❖ 实验结果和讨论 ❖ 总结或感想
完成两部分的作业：课后作业，实验报告
▪ SDS的作用是裂解细胞 ▪ EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子，防止DNA
酶对DNA分子的降解作用。 ▪ 蛋白酶K的作用是水解蛋白质。
❖ 酚和氯仿/异戊醇：抽提分离蛋白质 ❖ 乙醇：沉淀DNA ❖ TE：溶解DNA
实验步骤及注意事项（一人一组）：
取材:用生理盐水漱口后，口含生理盐水10~15ml约2~3min，用 15ml离心管（4000rpm 10min）收集细胞沉淀
分子医学实验注意事项
❖ 微量移液器的正确使用 ❖ 离心机的正确使用 ❖ 上课纪律 ❖ 撰写实验报告的规范
实验结果及其分析 定性分析：DNA琼脂糖凝胶电泳 ❖ apoB基因多态性分析
下次实验课进行
常见问题：
1、提取的DNA不纯 原因？改进的方法？
2、提取的DNA成涂布状 原因？改进的方法？
3、没有获得足够量的DNA 改进的方法？
保证核酸一级结构完整 排除其它分子的污染：
✓ 细胞内：蛋白质、脂类、糖、RNA等 ✓ 提取过程中：有机熔剂、金属离子、外源DNA
细胞样品的核酸提取的主要步骤
▪ 破碎细胞 ▪ 去除细胞内的其它分子：
蛋白质 多糖 脂类 ▪ 去除盐类、有机溶剂等杂质
核酸提取注意事项
❖ 减少化学因素对核酸的降解
▪ 如过量酸碱