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农杆菌污染问题经验之谈：来自丁香园，小木虫论坛

1.与农杆菌共培养后的愈伤组织最好用含头孢霉素500～700mg/L 的无菌水冲洗两三遍，然后用无菌吸水纸将洗液充分吸干（重要），再转到选择和除菌培养基上。

2.在共培养时在愈伤与培养基之间垫上一层滤纸，这样可以减少菌的营养来源。对抑菌起到一定的作用.

3.用0.1M的灭菌甘露醇洗菌效果也可以

4.我觉得以上的建议不大可行，我做过这样的实验，用抗生素的水溶液给他们洗澡，但是这种方法会严重刺激破坏幼嫩脆弱的愈伤组织，菌虽然抑制了，但是过一段时间愈伤表面会褐华接着枯黄死掉，建议就是不要让菌长起来，共培养的时候常观察，如有培养既有一点混浊，立即更换含抗生素的培养基，初始浓度要大一点。一般在做转化实验之前应做一个正常叶片对卡纳和头孢的抗性实验，确定正常叶片的抗性临界值，然后再确定你要的浓度，繁琐的活，慢慢做吧。另外转基因是个反复多次的过程，不要等上一次失败以后做坐下一批，应该是前仆后继的。

5.1 一般共培养温度设置在20度，

2

培养时间的问题，不能说限制在2天或者3天，而是要根据农杆菌感染的情况及时洗，换培养基

感染状态，只要出现小的菌台，即可进行去除农杆菌处理，不能让它继续感染，不然菌台太大了

6.1.共培养温度有关系：依据经验，培养温度超过26度时，三天时间能够使农杆菌长出可见量；用20-23度即可。

2.共培养后入筛选培养时，用250--

500mg/L的头孢是完全可以抑制住农杆菌的；如果用PPT作为筛

选剂，头孢浓度宜高些。

3.共培养三天后，多洗几次。

7.侵染前灭过菌的1.0M甘露醇洗愈伤,因为甘露醇是一种对细胞无害的渗透调节物质,

共培养完成后会有很多菌吸附在细胞表面,而这种浓度的甘露醇渗透压略大于细胞的胞内渗透压,使得胞内水分有外渗的趋势,有利于洗脱菌,就我的经验来说,等到明显看到菌长出来时,基本上可以放弃这一批材料了,另外,在我做草的转化时,浸染液的OD最好不超过0.3,不过不同的材料可能不同,因为不同的材料耐受抑菌抗生素的浓度不同,象我的草愈伤梭卞和头孢不能超过300,而有的材料可以用500,500的话肯定可以把浸染液的浓度提高点,这些你做多了自己可以慢满摸索出来一个适合你的材料的方法测一下菌的OD 值，在0.4至0.6之间,用于侵染比较好

8.我们这（作物遗传改良国家重点实验室分子分室)技术很成熟，很少有农杆菌污染长起来的

1.侵染时，悬浮培养基里不要接太多的农杆菌，

2、愈伤在农杆菌悬浮培养基里放置时间最好为15-

30分钟，不要太长，特别是对于粳稻，更是没有必要时间太长。

3、水洗共培养的愈伤后加适量CN（羧苄青霉素二钠，浓度为23

3.69mg/ml）静置30分钟，

4、筛选培养基上加450-500ul以上浓度的CN每250ml培养基

5、更重要的是共培养的温度应该在19-21度之间为最好

6、培养时间不超过72小时，当然如果看到农杆菌长起来，就要马上洗了

7、因为共培养的培养基PH值一般比较低（5.4-

5.6），所以有点湿，这就更要求要仔细认真的做。

9.不同菌株所用抑制剂不同，一般用羧卞抑制LBA4404，EHA105和AGLI用头孢，用量在250-500mg/L

10.菌液a右为佳可以在培养基上放一张灭过的滤纸把材料防止上面培养。抗生素要在培养基不烫加入。

11.不妨参考我们实验室的流程:

1 烟草叶片的预培养

取烟草无菌苗叶片或经过70％的酒精和0.1％

升汞消毒的实生苗叶片，切成约1

cm2大小的叶盘并用解剖刀在表面划伤口，接种于培养基MS1（MS基本培养基添加0.1 mg L-1的NAA和1 mg L-1的BA，pH

5.8）上，25℃光照预培养2 d。

2 YEB平板制备单菌落，挑分离良好的单菌落于

3 mL

液体YEB（加相应的抗生素,我们是加35 mg L-1的Chl和50 mg L-1的 Kan）中28℃振荡暗培养36～44 h

3

将2得到的农杆菌菌液用MS1液体培养基稀释10到20倍(OD值0.3 ~0.4的样子)，将1预培养后的烟草叶片浸入菌液中浸泡15

min，然后用无菌吸水纸吸去表面菌液，置于MS2培养基（MS1培养基添加250 mg L-1的Carb）上，28℃黑暗共培养2～3

d。将经过共培养的材料转移至MS3培养基（MS1培养基添加250 mg L-1的Carb和100 mg L-1的Kan），光照培养。20

d继代一次。将成功分化的苗转至培养基MS4（MS基本培养基添加250 mg L-1的Carb和100 mg L-

1的Kan）上生根，待长出5～7片真叶时，开瓶炼苗，移栽到土中

这是我们实验室的成熟流程,希望对你有帮助,如果此法不凑效,请务必对你的农杆菌株做个检测,农杆菌抑制不住是因为你的抑菌抗生素浓度太低,

12. 1.我们取烟草无菌苗，将叶片剪成约1 -

2cm大小，接种于培养基MS基本培养基，24℃倒置暗培养3 d。

2 .挑农杆菌单菌落于50mL

液体LB（不加相应的抗生素）中28℃振荡暗培养18h至OD值1.0，没有用MS悬浮。

3

.将预培养后的烟草叶片先用无菌水泡，然后浸入到培养好的农杆菌菌液(OD值1.0)中浸泡5-6

min，然后用无菌吸水纸吸去表面菌液，置于选择培养基（MS +

1.0 mg/L 6-BA + 0.1mg/L NAA + Kan 50mg L-1 + 头孢 400mg

L-1）上，25℃光照共培养。

大约两周之后应该出苗。我们又做了一批，还在观察之中。而我们的作法跟lmx751221所给的建议有些许不同，我们的方法也是向技术比较成熟的实验室所学的，不知道是不是有什么地方有误的，很感谢你的建议，希望你能再给我提些意见。非常感谢大家的建议，希望各位看完我们的具体作法能再给出一些意见，多谢！

13.愈伤组织的预培养

取生长旺盛的胚性愈伤组织（从继代培养上挑选分散状，颜色鲜黄的2－3mm的胚性愈伤颗粒）转接到预培养培养基，27℃暗培养3－4天。生长旺盛的愈伤用于农杆菌转化。

10、愈伤组织与根癌农杆菌的共培养

取生长旺盛的水稻胚性愈伤组织（预培养4d的水稻幼胚去掉胚芽或继代2-3周后2-

3mm的愈伤颗粒转入新鲜培养基中预培养4d），置于灭菌培养皿中，浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液（含100uM AS）中10-

15min后将幼胚取出，中间轻缓晃动数次，倒掉菌液，将愈伤于无菌滤纸上，吸除残余的菌液并凉干，随即转移到共培养培养基