人感染高致病性禽流感标本采集及实验室检测技术方案
人感染H7N9采样方法及实验室检测策略
采集鼻咽拭子注意事项
• 1、采样时用干拭子采，不能蘸采样液，因为采样 液中有抗菌素，防止过敏。
• 2、采样液平时保存在-20℃或-70℃，采样前融化 到4℃。
• 3、采样液颜色呈紫色时失效不能用了。
人感染H7N9禽流感病毒鼻咽拭子标本 采集方法（2）
• 三、标本运送：
• • 新鲜的临床采集标本应在4℃条件下随样品送检单24小时
（二）标本转送和检测
• 1.H7N9禽流感病毒实验室活动和样本运输按照《人间传染 的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒进行管理。病 例的临床标本采集后，县级疾病预防控制机构和病例收治 的医疗机构要密切配合，按照生物安全的相关规定进行包 装，在24 小时内送到当地流感监测网络实验室进行检测。
• 2.当地流感监测网络实验室收到标本后24 小时内，立即对 呼吸道标本开展甲、乙型流感病毒通用引物、H5、H7亚型 的检测。
内运送至市CDC流感检测实验室。未能24小时内送至实验 室的，应置-70℃或以下保存；冻存的标本应在冻存条件 下，低温送至实验室。
• 四、采样时的生物安全防护：
• 采样时应带口罩，穿隔离衣，带一次性手套及帽子。若在 现场进行快速检测，应将现场用过的所有废物带回销毁。
谢谢，祝大家工作顺利！
• 若当地流感监测网络实验室检测结果为H5、H7核酸检测 阳性时，应当于24小时内将其中2管呼吸道相关原始标本 分别送省级疾控中心流感网络实验室和国家具备相应生物安全条件的网络实验室可开展病毒 分离，并将分离的毒株按要求及时送国家流感中 心。
• 3.若当地流感监测网络实验室检测结果为甲型流 感和乙型流感通用引物均阴性时，应当立即将1管 原始呼吸道标本送省级疾控中心。省级疾控中心 收到标本后，应当立即对其中1管进行SARS 、新 型冠状病毒等相关病原体的检测，另1管送国家流 感中心。
重大传染病疫情、食物中毒现场采样及实验室生物安全
1、霍乱的现场采样和现场检测用品准备
霍乱概述：霍乱是由霍乱弧菌引起的一种急性肠道传染病，以发病急、传播快、波及范围广 为特征，是《中华人民共和国传染病防治法》规定的甲类传染病之一，也是《国际卫生条例 》规定的国际检疫传染病之一，《国内交通卫生检疫条例》也将其列为检疫传染病。目前引 起霍乱暴发流行的菌株为O1、O139群。霍乱弧菌经水和食物传播，引起大流行的规律目前尚 不十分明确，在我国引起霍乱流行的自然因素和社会因素依然存在。
（2）标本的采集
采集的标本包括：粪便、呕吐物、肛拭子和血清等。
对病人接触的可疑食品、水体等，应规范采集标本进行病原分离。
方法：
a 、粪便：水样便以吸管吸取1—3ml，成型便采集成人拇指大小的便量，置 于灭菌管内或经增菌后送检。任何容器均应加橡皮塞或将螺旋盖旋紧。采集 肛拭子标本，以直肠拭子用保菌液或生理盐水湿润后，由肛门插入直肠内3— 5cm处采集，转动取出，插入保菌液或无菌试管内送检。粪便标本应在2小时 内尽快送检，否则标本放入Cayr-Blair运送培养基中。
重大传染病疫情、食物中毒现场采样及实验室 生物安全
呼伦贝尔市疾病预防控制中心 洪丽云
一、重大传染病疫情的采样
传染病概念：传染病是指具有传染性的致病性微生物或生物，如细菌、病毒、 立克次体、寄生虫等侵入人体，致使人体健康发生某些损害，并能危及其他不 特定人群的生命和健康，甚至对整个社会造成严重影响的疾病。
（2）现场个人防护用品：手套、防护眼镜、符号“N95标准的防护口罩、鞋 套、白大衣、隔离衣、洗手液、75%酒精等消毒液等。
（3）采集患者样本一式三份，其中两份分别送两家有人感染高致病性禽流感 检测条件的实验室同时进行平行检测，一份样品备复核；
（4）实验标本的采集：
人感染H7N9禽流感采样以及实验室检测技术
用真空负压采血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟， 1500～2000rpm离心10分钟，收集血清于2ml无菌螺口塑料管 中。
样本采集方法 (5)
鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：
用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取 呼吸道分泌物。先将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负 压，旋转收集器头部并缓慢退出；收集抽取的粘液，并用 采样液3ml涮洗收集器1次（可用小孩导尿管接在50ml注射 器上来代替收集）。
注：应当尽量采集病例发病早期的呼吸道标本（尤其是下呼 吸道标本）和发病7天内急性期血清以及间隔2-4周的恢复 期血清。
要求 呼吸道标本：发病早期采样，每份不少于3ml 血清标本每份分为2管，每管不少于0.5ml
样本采集方法 (1)
咽拭子：左手用压舌板压住患者舌头，右手用2根聚丙烯纤
维头的塑料杆拭子同时檫拭双侧咽扁桃体及咽后壁，应避免 接触舌头，将拭子头浸入含3ml采样液的管中，弃去尾部，旋 紧管盖。
胞分类计数减少； 4. 不能从临床或实验室角度诊断为常见病原所
致的肺炎。
• 包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱 液和鼻洗液）；
◆下呼吸道标本（如气管吸取物、肺洗液、肺组织标本）；
◆ 血清标本；
◆ 如病人死亡，应当尽可能说服家属同意尸检，及时进行尸 体解剖，采集组织（如肺组织、气管、支气管组织）标本；
样本采集方法 (4)
鼻洗液 患者取坐姿，头微后仰，用移液管将5 ml生理盐水注入一侧鼻孔，嘱患 者同时发K音以关闭咽腔。然后让患者低头使生理盐水流出，用平皿或烧 杯收集洗液。重复此过程洗两侧鼻孔
漱口液 用10 ml生理盐水漱喉。漱时让患者头部微后仰，发“噢”声，让生理
盐水在咽部转动。然后，用50ml的无菌螺口塑料管收集洗液。
人感染高致病性禽流感应急预案(正文)
人感染高致病性禽流感应急预案1 总则1.1 总体目标为做好人感染高致病性禽流感（以下简称“人禽流感”）防控工作，提高人禽流感的防治水平和应对能力，及时、有效地采取各项防控措施，做到早发现、早报告、早隔离、早治疗人禽流感病例，控制疫情的传播、蔓延，保障广大人民群众的身体健康和生命安全，维护社会的稳定，特制定本预案。
1.2 工作原则政府领导，部门配合；依法防控，科学应对；预防为主，防治结合；群防群控，分级负责。
1.3 编制依据《中华人民共和国传染病防治法》、《突发公共卫生事件应急条例》、《国家突发公共卫生事件应急预案》、《卫生部应对流感大流行准备计划与应急预案（试行）》。
1.4 适用范围本预案适用于我国各级卫生行政部门及各级各类医疗卫生机构开展的人禽流感防治应对准备及应急处置工作。
2 组织管理2.1 组织机构各级卫生行政部门在本级政府统一领导下，成立人禽流感防控工作领导小组，统一指挥、协调系统内的人禽流感防控工作。
各级各类医疗卫生机构实行人禽流感防控工作主要领导负责制、防控工作责任制和责任追究制，明确任务、目标和责任。
县级及以上卫生行政部门成立由临床、流行病学和实验室检验等相关专业人员组成的人禽流感防控技术专家组。
县级及以上医疗卫生机构成立人禽流感疫情应急处置小组，根据职责分工和卫生行政部门指派，负责开展本单位或本地区的人禽流感疫情应急处置工作。
农村乡镇（村）和城市社区卫生机构在上级疾控机构和医疗机构的指导下，开展本地区的人禽流感防控工作。
2.2 职责分工2.2.1卫生行政部门职责(1)卫生部负责全国人禽流感疫情防控管理和协调工作，组织制订人禽流感应急处置的政策、技术规范和专项预案，指导各地做好人禽流感防控工作；组织开展全国卫生系统专业人员的技术培训，组建国家级专家组为各省（区、市）提供技术支持和培训省级师资，组织专家组对各省（区、市）的年度首例人禽流感病例进行诊断，组织开展对全国人禽流感防控工作的督导检查；负责流感大流行及特别重大的人禽流感疫情应急控制的组织协调及社会动员，拟定国家应急防控物资储备清单，开展人禽流感防控工作的国际交流与合作，指导和协助相关部门开展人禽流感防控知识培训。
禽流感实验室检测技术方案
禽流感实验室检测技术方案禽流感，这个让无数人闻之色变的词汇，已经成为我们生活中无法回避的一部分。
如何快速、准确地检测出禽流感病毒，成为了当务之急。
今天，就让我来为大家详细介绍一下禽流感实验室检测技术方案。
我们需要明确检测的目标。
禽流感病毒有多种亚型，我们要检测的是哪些亚型，需要根据实际情况来确定。
一般来说，H5和H7亚型的禽流感病毒对我国养殖业和公共卫生安全威胁较大，因此，我们将重点检测这两种亚型。
我们要选择合适的检测方法。
目前，实验室检测禽流感病毒的主要方法有病毒分离、血清学检测和分子生物学检测。
病毒分离是传统的检测方法，准确性较高，但操作复杂，耗时较长。
血清学检测通过检测抗体来判断病毒感染情况，速度快，但准确性相对较低。
分子生物学检测，尤其是实时荧光定量PCR技术，具有高灵敏度、高特异性、快速简便等优点，成为近年来禽流感病毒检测的主流方法。
下面，我将详细介绍实时荧光定量PCR技术在禽流感实验室检测中的应用。
一、实验材料1.样本：采集疑似感染禽流感的家禽咽喉拭子、泄殖腔拭子等。
2.试剂：实时荧光定量PCR试剂盒、病毒提取试剂盒等。
3.仪器：实时荧光定量PCR仪、离心机、恒温箱等。
二、实验步骤1.样本处理：将采集的拭子样本放入病毒提取试剂盒中，按照说明书操作，提取病毒RNA。
2.模板制备：将提取的病毒RNA与实时荧光定量PCR试剂盒中的缓冲液、酶混合，进行模板制备。
4.结果分析：观察实时荧光定量PCR仪上的扩增曲线和溶解曲线，判断样本是否为阳性。
三、注意事项1.实验过程中要严格遵循无菌操作原则，防止样本污染。
2.实验室人员要具备一定的分子生物学实验技能，确保实验顺利进行。
3.实验结果要及时记录，并与临床诊断相结合，为疫情防控提供有力支持。
通过实时荧光定量PCR技术，我们可以快速、准确地检测出禽流感病毒，为我国养殖业和公共卫生安全保驾护航。
当然，实验室检测只是禽流感防控工作的一部分，我们还需要加强疫情监测、疫苗接种、生物安全等措施，共同抵御禽流感病毒的侵袭。
人感染HN禽流感诊疗方案及接诊流程
人感染HN禽流感诊疗方案及接诊流程诊断标准临床表现HN禽流感的临床表现与普通流感类似，但常见症状更加严重，包括高热、咳嗽、喉痛、鼻塞、鼻涕、乏力、肌肉疼痛、头痛和胸部不适等。
比较特殊的是，部分患者会出现呼吸急促、氧饱和度下降、发绀等表现，严重者可能发生呼吸衰竭和肺部感染。
诊断标准HN禽流感的诊断依据主要包括以下几个方面：1.有流感样症状的发热患者，并且满足以下几个条件中的一个或多个：•近期有华南湿地野鸟、家禽接触史或其环境接触史；•近期有密切接触HN禽流感确诊或疑似病例史；•近期有到禽类市场、活禽摊点、宰杀场等场所接触史；•近期有到禽养殖场或禽类散养区等地接触史。
2.特殊实验室检查（包括病原学和免疫学等）中有HN禽流感病毒阳性结果。
诊疗方案治疗准则HN禽流感患者应该在医疗机构进行住院治疗，一旦确诊应尽早给予抗病毒治疗。
应急用药HN禽流感的常用抗病毒药物主要包括奥司他韦、扎那米韦等。
应急用药的时限为发生症状的48小时内。
对症治疗HN禽流感的对症治疗主要是针对症状的处理，包括解热、止咳、清热、润肺等，同时应注意维持水、电解质平衡。
防治合并症在饮食调理、膳食营养支持、营养剂补充、抗生素预防等方面，应综合考虑患者的情况，以防治合并症。
接诊流程直接医疗机构若患者自感有流感症状或接触史时，应尽快前往直接医疗机构就诊，医护人员应有意识地寻找与流感疫情相关的接触史。
诊室检查在诊室检查时，应戴好口罩、手套、帽子等个人防护用品，建议以小隔间进行诊查。
信息记录医务人员应当详细记录患者的病情和接触史，并报告相关部门。
传染防控在患者就诊过程中，应采取相应的传染防控措施，避免交叉感染。
人感染HN禽流感的诊断标准主要包括临床表现和特殊实验室检查两大方面。
针对该疾病的治疗主要是抗病毒治疗及对症支持治疗。
在接诊流程中，医务人员应当严格按照相关规定和操作规程，采取相应的传染防控措施，避免交叉感染的发生。
高致病性禽流感诊断技术
一、标准制定背景高致病性禽流感(HPAI)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的。
在2005年至2021年期间，高致病性禽流感已导致全球3.16亿多只家禽死亡和扑杀，最多的年份是在2016，2020，2021年。
另外，在2006，2016，2017和2021年，这几年受到高致病性禽流感疫情影响的国家或地区超过50个。
此外，人偶尔也会感染禽流感病毒。
据WHO统计，人感染H5N1亚型约850例，其中约半数出现死亡；人感染H7N9约1500例，死亡约600例、感染H5N6病例约80例，死亡约30例，感染H9N2约75例，其中2例死亡，还有其他的H3N8，H7N4, H7N7和H10N8亚型感染人的报告。
这些数据表明，高致病性禽流感不仅会给养殖业造成严重的经济损失，还会给人类的生命安全带来威胁，因此要密切监测禽流感的动态以及发生发展趋势。
监测一个病原，离不开有效的诊断技术。
国际上禽流感诊断的依据是世界动物卫生组织出版的WOAH陆生动物法典和WOAH陆生动物诊断试验和疫苗标准手册，通常简称为陆生动物手册。
世界动物卫生组织OIE的缩写，今年5月份更改为WOAH。
陆生动物手册，每过一两年，都会根据病原的变化进行更新。
我国对禽流感诊断的依据有国家标准、行业标准等。
今天要和大家共同学习的《高致病性禽流感诊断技术》国家标准，第一版是在2003年制定的，标准起草单位是中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。
经过十几年的应用，伴随禽流感病毒不断遗传演化，伴随科技不断发展进步，新的诊断技术、诊断方法逐渐成熟，2003年出版的标准已经出现了滞后现象，对一些常用的，国际公认的检测方法，例如荧光RT-PCR检测方法，没有收录进来，因此，在2017年，我们提出了修订，该工作得到动卫中心全国动物卫生标准化技术委员会大力支持，并且在标准的征求意见阶段，得到大学、省市疫控部门、出入境检疫部门、大型养殖企业的大力帮助。
在此一并表示感谢。
在各位同行的帮助下，2020年末，《高致病性禽流感诊断技术》新版国家标准正式出版。
人感染H7N9禽流感病毒标本采集-北仑区人民医院
北仑区人民医院检验科人感染H7N9禽流感病毒标本采集、保存、运送实验活动要求根据浙江省卫生厅《关于做好人感染H7N9禽流感病毒实验活动生物安全管理工作的通知》未经培养的临床样本应当在已经市卫生局备案的生物安全二级实验室生物安全柜内分装、灭活和核酸提取。
在生物安全二级实验室开展实验活动时，个人防护应当佩戴眼罩、N95及以上水平的口罩等防护装备。
根据《人感染H7N9禽流感疫情防控方案（第一版）》规定，H7N9禽流感病毒实验室活动和样本运输按照《人间传染的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒进行管理。
原始标本采集呼吸道病毒的诊断取决于高质量标本的采集，及其保存运输等环节。
多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物及尸检组织。
标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存。
标本采集人员医疗机构的医生、护士或疾病预防控制中心专业人员负责标本采集并填写标本登记表，标本采集人员按照相关要求做好个人防护。
采集前的准备防护用品：1.口罩(N-95 or N/P/R-100)2.手套3.帽子4.鞋套5.防护服6.防护目镜采集物品包参考下图：常用的采样液/病毒运输液(VTM）1.pH 7.4～7.6的Hanks液2.MEM/DMEM液在采样液中需加入抗菌素，可用青霉素（终浓度为100U/ml）、庆大霉素（终浓度为1mg/ml）和抗真菌药物（终浓度为2µg/ml）。
在无菌的带螺旋塑料管分装2-3ml采样液。
采样拭子：使用头部为聚酯纤维的病毒采样拭子（鼻及口咽型），铝或塑料做柄，不推荐棉拭子和木柄。
采集对象1.监测病例，同时具备以下4项条件的病例：（1）发热(腋下体温≥38℃)；（2）具有肺炎的影像学特征；（3）发病早期白细胞总数降低或正常,或淋巴细胞分类计数减少；（4）不能从临床或实验室角度诊断为常见病原所致肺炎。
2.人感染H7N9禽流感疑似病例与确诊病例，定义参照《人感染H7N9禽流感诊疗方案（2013年第1版）》标本种类上呼吸道标本：咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液下呼吸道标本：气管吸取物、肺洗液、肺组织标本血清标本：发病7天内急性期血清和间隔2-4周的恢复期血清如病人死亡，可采集组织标本：肺组织、气管、支气管组织等注意事项：1.应当尽量采集病例发病早期的呼吸道标本（尤其是下呼吸道标本）。
人感染禽流感防控样本采集检测与运送要求市刘爱平
2*reaction buffer 酶 上游引物 下游引物 探针 H2O 模板
12.5ul 0.5ul 0.25ul 0.25ul 0.125ul 6.375ul
5ul 25ul
2024/4/7
24
PCR反响条件
2024/4/7
25
➢呼吸道灌洗液：
➢ 将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气 管〔约30cm深处〕，注入5ml生理盐水，接
通负压，旋转收集器头部并缓慢退出；收
集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器1次
〔可用小孩导尿管接在50ml注射器上来代
2024/4/7
9
➢ 咽漱液：用10 ml生理盐水漱喉。漱时让患者头部 微后仰，发“噢〞声，让生理盐水在咽部转动，然 后，用50ml的无菌螺口塑料管收集洗液。
➢ 禽类粪便：选择禽舍或环境中的新鲜禽类粪便，用无菌拭子 夹或挑取粪便3-5g置于含5ml采样液的管中，弃去尾部，旋 紧管盖。
➢ 笼具涂抹拭子：用蘸有采样液的拭子擦拭笼具外表禽类最常 接触的3-5个不同部位〔包括笼具底部〕，然后将擦拭过的 拭子放入含5ml采样液的采样管中，弃去尾部，旋紧管盖。 也可以用多个拭子充分擦拭笼具外表后放到一个采样管中。
➢ 甲型阳性H5、H7亚型阴性的标本继续开展季节性 流感病毒核酸检测和流感病毒别离，毒株上送省 CDC复核。
➢ 甲型通用引物阳性而不能区分型别或亚型的毒株 和阳性标本要求在48小时内送至国家流感中心〔 24小时内送至省CDC〕。
没有条件开展 核酸检测的医 疗机构请尽快 开展快速抗原 检测初筛试验。
➢ 甲型通用引物阳性而不能区分型别或亚型的毒株 和阳性标本要求在48小时内送至国家流感中心〔 24小时内送至省CDC〕。
H7N9排查病例
高致病性禽流感病毒实验室检测分析
高致病性禽流感病毒实验室检测分析摘要：禽流感即禽流行性感冒，属于甲型流感病毒所致禽类传染性疾病，可在鸡、鸟类中大范围传播。
禽流感包括非致病性、低致病性及高致病性等类型，其中高致病性禽流感具有传播速度快、病死率高及危害性大等特点，并可感染人类，因此国家将其列为一类动物疫病。
为有效防控高致病性禽流感，需采取有效实验室检测方案。
本文分析研究高致病性禽流感病毒实验室检测方法及检查过程中的风险防控措施，希望为相关人员提供参考。
关键词：高致病性禽流感病毒；实验室检测；检测方法高致病性禽流感属于禽类急性传染性疾病，致病菌为甲型流感病毒，其主要特点是传播速度快，病死率较高，可对禽养殖行业造成严重不良影响。
近年来，我国部分地区开展家禽检疫过程中多次检出高致病性禽流感病毒，为此需不断加强实验室检测分析工作，并在检测中采取有效的风险防控措施，以实现对高致病性禽流感的有效防控。
一、高致病性禽流感概述高致病性禽流感属于世界范围多发常见禽类疫病，可对公共卫生安全构成严重威胁。
高致病性禽流感病毒致病性较强，可寄生于多种宿主体内，人类及哺乳动物均可感染，不同禽流感感染病原亚型临床表现存在差异，H7N9亚型感染症状较为严重，可导致呼吸系统病变及多器官功能衰竭，致死率较高，H7亚型感染可导致呼吸道相关症状，H9N2亚型感染症状与普通流感近似[1]。
高致病性禽流感危害性较强，为此需及早确诊，并采取有效的防控措施，以避免其持续蔓延。
二、高致病性禽流感病毒实验室检测方法（一）病毒培养分离病毒培养分离是诊断高致病性禽流感病毒的常规方法，具有较高的灵敏度、特异度及准确度。
实验室检测人员利用临床标本获取毒株，通过培养分离操作技术可确定毒株的生物学特性与抗原基因，进而为疫苗的选用提供参考。
同时，病毒培养分离操作相对复杂，样品运输条件、采用时间及采样方式等均可影响检测结果，不适合应用于普查中。
另外，开展病毒培养分离过程中，高致病性H5N1毒株需在生物安全级别达到BSL-3的实验室中完成[2]。
流感病毒临床标本的采集方法运输保存处理
专用病毒样本采集管
临床标本的采集
常采集的标本类型
?上呼吸道标本（包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽 抽取物、咽漱液和鼻洗液）
?下呼吸道标本（如气管吸取物、肺洗液、肺 组织标本）
?血清标本（急性期 / 恢复期） ?肺组织、气管、支气管组织标本 （死亡病例）
标本采集量及分装
?呼吸道标本每份分为 3 管/每管不少于 1ml
? 各省行政部门应该 鼓励具备条件的实验室按 照技术规范 开展标本核酸检测工作 ，并可以 作为诊断的实验室依据。
实验室检测流程 1
? 当地流感监测网络实验室收到标本后 24 小时 内，立即对呼吸道标本开展甲、乙型流感病 毒通用引物 H5、H7亚型的检测。
? 若当地流感监测网络实验室检测结果为 H5、 H7核酸检测阳性时，应当于 24小时内将其中 2管呼吸道相关原始标本分别送省级疾控中心 流感网络实验室和国家流感中心。
人感染H7N9禽流感病毒标本 采集、保存、检测及结果反馈
省CDC 微生物检验科 史永林
2013-04-09
国家卫生和计划生育委员会
?人感染H7N9禽流感疫情防控方案 （第一版）
附件2： 人感染H7N9禽流感病毒标本采集及实验室检测策略
?人感染H7N9禽流感诊疗方案 （2013年第1版） ? 人感染 H7N9 禽流感医院感染预防与控制技术指 南（2013年版） ? 人感染 H7N9 禽流感病例诊断程序 ?关于做好人感染 H7N9禽流感病毒实验活动生物 安全管理工作的通知
?血清标本每份分为 2 管/每管不少于 0.5ml ? 2 ml螺口带盖塑料管 (不可用1.5ml离心管代替)
临床样本收集的注意事项
? 操作要细心，严防标本间交叉污染，要做好自我 保护
职业暴露人群血清学和环境高致病性禽流感监测方案(2011年版)
4
PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建
1．监测对象 监测点的水、禽类（含候鸟）粪便及笼具表面等环境标本。 2．监测时间 全年监测，每月监测 1 次。每次须提前几天了解监测点的情况， 避免在监测点消毒后 2 日内采样。 3．监测方法
3
PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建
象的空腹静脉血 5ml（见附录 1），填写“职业暴露人群血清标本采样 登记表”（见附表 3），在登记表上手写记录血清标本编号或粘贴打印 的血清标本编号条形码，同时确保调查问卷、血清标本登记表、血清 采样管上的血清标本编号要一致。血清标本编号规则：（1）血清标本 代号：B；（2）年份后两位；（3）网络实验室编号（三位）（见附录 2）； (4) 实验室标本编号：从 001 开始。
（3）实验室检测 各省级疾病预防控制中心统一组织血清标本 H5N1 抗体初筛检测 工作，采用的方法为马血球血凝抑制实验（HI）和/或单放射免疫扩 散溶血实验（SRH），或者根据国家流感中心每年下发试剂说明书中推 荐的检测方法（见附录 3）。标本采集后要求 1 个月内完成检测工作， 填写“职业暴露人群血清标本检测结果表”（见附表 5），检测结束后 1 周内将检测结果录入“传染病监测技术平台信息管理系统”。 国家流感中心采用微量中和实验（MN）对阳性标本和随机抽取的 5%阴性标本进行复核，并在收到标本 3 个月内向各网络实验室反馈复 核结果。
PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建
职业暴露人群血清学和环境高致病性禽流感 监测方案（2011 年版）
2009 年由一种新的人、禽、猪流感病毒重配而来的甲型 H1N1 流 感病毒所导致的流感大流行，再一次证明流感病毒的重配，并由新的 重配病毒导致流感大流行是不可避免的。因此尽管此次流感大流行已 经结束，但如何应对由其它新型病毒所导致的一场新的流感大流行仍 是我们的重要任务。高致病性 H5N1 禽流感病毒仍然在很多国家和地 区导致动物疫情，人感染病例也一直在不断发生，因此由其导致流感 大流行的警报并没有解除。2008 年以来，在卫生部每年中央财政转 移支付 SARS、人禽流感防治项目专项经费的支持下，各省均安排了 禽流感职业暴露人群的血清学和环境高致病性禽流感病原学监测工 作。通过此项工作不仅有效地提高了我国流感监测网络实验室的检测 能力，在 2009 年甲型 H1N1 流感的防控中发挥了重要作用，而且通过 及时分析 H5N1 禽流感病毒的变异情况以及在职业暴露人群中的感染 状况的变化，可以进一步监测感染来源，确定感染高危因素，监测禽 流感病毒致病力和传播能力的改变，为流感大流行的预警提供了依 据。为进一步规范此项工作，继续做好流感大流行的预测预警，持续 提高我国应对流感大流行的能力，在前期工作的基础上，结合目前我 国流感监测网络的发展现状，重新修定了《职业暴露人群血清学和环 境高致病性禽流感监测方案（2011 年版）》，用于指导全国的监测工 作。
人感染高致病性禽流感标本采集及实验室检测技术方案
人感染高致病性禽流感标本采集及实验室检测技术方案一、采集对象二、采集要求三、标本种类四、标本采集方法五、标本包装六、标本保存七、标本送检八、实验室生物安全九、标本的实验室检测十、检测结果的判断和报告十一、实验室检测流程十二、人禽流感实验室检测职责为及时、科学地采集和运送人禽流感病例或疑似污染环境等各种类型的标本，规范实验室检测程序和检测方法，提高检测质量，明确诊断或开展相关科学研究，特制定本方案。
一、采集对象1. 人禽流感医学观察病例、疑似病例、临床诊断病例及需要进一步研究的确诊病例。
2. 其他需要进行人禽流感诊断或排除者。
3. 需要采集的环境标本。
二、采集要求1. 从事人禽流感检测标本采集的技术人员必须经过生物安全培训和具备相应的实验技能。
在标本采集过程中，采样人员参照规定的防护措施进行安全防护。
2. 住院病例的标本由所在医院医护人员在当地疾病预防控制机构专业人员指导下采集。
3. 标本采集具体种类和数量由现场工作组确定。
4. 密切接触者标本由当地疾病预防控制机构负责采集。
5. 根据实验室检测工作的需要，结合病程再次采样。
三、标本种类每个病例应尽可能同时采集上、下呼吸道标本；需要排除人禽流感的死亡病例则依据《传染病病人或疑似传染病病人尸体解剖查验规定》（中华人民共和国卫生部令第43号）的规定采集尸体标本，没有条件进行尸体解剖的，可采集呼吸道灌洗液或经皮穿刺采集肺组织标本。
1. 上呼吸道标本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液、深咳痰液。
最佳采集时间为发病后3天内。
2. 下呼吸道标本：包括呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺组织活检标本。
3. 尸检标本：病人死亡后应依法尽早进行解剖，在严格按照生物安全防护的条件下，进行尸检，主要采集肺、气管组织标本，条件允许下也可采集肝、肾、脾、心脏、脑、淋巴结等组织标本。
4. 血清标本：每一病例必须采集血清标本，须采集急性期、恢复期双份血清。
第一份血清应尽早（最好在发病后7天内）采集，第二份血清应在发病后第3～4周采集。
人感染H7N9禽流感病毒标本采集、运送及保存
100 A/chicken/Karachi/NARC-23/2003_H7N3_Pakistan A/quail/Aichi/1/2009_H7N6_Japan
87
99
A/duck/Hong_Kong/301/1978_H7N2_Hong_Kong
A/black_kite/Egypt/054/2004_H7N7_Egypt
时-70℃冻存。流感病毒在-20℃～-40℃时不稳 定，故长期保存应在-70℃温度以下，不要冻存 于-20℃，会降低流感病毒的检出率 ➢ 避免反复冻融，冰上一周也比冻融一次要好 ➢ 血清标本暂时存在可在4℃冰箱，长期保存于20℃冰箱。
标本包装和运输
➢ 根据《人感染H7N9禽流感疫情防控方案（第一 版）》规定，H7N9禽流感病毒实验室活动和样本 运输按照《人间传染的病原微生物名录》中高致 病性禽流感病毒进行管理
在无菌的带螺旋塑料管分装2-3ml采样液。最好储存在:– 20℃,4℃可放48–96h,室温1–2天。
➢ 采样拭子：使用头部为聚酯纤维的病毒采样拭子（鼻 及口咽型），铝或塑料做柄，不推荐棉拭子和木柄
采集对象
1.监测病例，同时具备以下4项条件的病例： （1）发热(腋下体温≥38℃)； （2）具有肺炎的影像学特征； （3）发病早期白细胞总数降低或正常,或淋巴细胞分类计 数减少； （4）不能从临床或实验室角度诊断为常见病原所致肺炎。
核酸检测流程
• 若检测结果为甲型通用阳性，H7N9阴性，送剩余 的2份呼吸道相关原始标本送当地市级流感网络实 验室进行其他流感病毒型别鉴定；
• 市级流感网络实验室若不能分型或H5阳性标本应 立即送省级疾控中心流感参比实验室；
• 若检测结果全部阴性，将剩余的2份呼吸道相关原 始标本送省级疾控中心进行SARS、新冠状等病原 体检测；
禽流感实验室采样
禽流感实验室采样一、原始标本采集1、标本采集由医生、护士或疾病预防控制中心专业人员负责标本采集并填写标本登记表，标本采集人员按照《禽流感职业暴露人员防护原则》做好个人防护。
2、标本采集种类和时限（1）采集标本的种类：疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液、血清以及死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物。
（2）采集标本时间：①咽、鼻拭子或含漱液在发病的头3天采集；②急性期血清在发病后7天内采集，恢复期血清在发病后2-4周采集；③尸检标本尸检时采集。
3、标本的运送所有采集的标本应在医院采集时立即分装，一式两份，其中一份单独保存，以备复核，采集的标本若不能在24小时内送达，则应尽快在一70℃以下保存。
无一70℃条件的需在一20℃冰箱短时间暂存，井尽快联系递送标本。
4、标本采集的方法（1）鼻拭子将带有聚丙烯纤维头的拭子轻轻插入鼻道内鼻愕处，停留片刻后缓慢转动退出。
以另一拭子拭另侧鼻孔。
将拭子头浸入4-5m1采样液中，尾部弃去。
然后，塞紧或盖好管盖。
（2）咽拭子用带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭两侧咽扁桃体及咽后壁，同样将拭子头浸入4-5m1采样液中，尾部弃去，塞紧或盖好管盖。
注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。
（3）鼻咽抽取物或抽取气管和支气管分泌物用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取枯液或从气管抽取气管和支气管分泌物。
先将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。
收集抽取的粘液，并用采样液5m1测洗收集器3次。
近来国内有用小孩导尿管接在50m1注射器上来替代收集器。
（4）漱口液用10m1采样液（生理盐水）漱喉。
漱时让患者头部微后仰，发吱声，让洗液在咽部转动。
然后，用平皿或烧杯收集漱液。
（5）鼻洗液：患者取坐姿，头微后仰，用移液管将5m1生理盐水注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K音以关闭咽腔。
然后让患者低头使生理盐水流出，用平皿或烧杯收集洗液。
重复此过程洗两侧鼻孔。
（6）肺活检材料肺活检组织在无菌条件下，用灭菌过的乳钵磨碎，用生理盐水配成20%悬液，2000rpm离心10min，取上清加入抗菌素＜X、链霉素，或庆大霉素和抗真菌素）。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
附件2人感染高致病性禽流感标本采集及实验室检测技术方案为及时、科学地采集和运送人禽流感病例或疑似污染环境等各种类型的标本，规范实验室检测程序和检测方法，提高检测质量，明确诊断或开展相关科学研究，特制定本方案。
1 采集对象1.1 人禽流感医学观察病例、疑似病例、临床诊断病例及需要进一步研究的确诊病例。
1.2 其它需要进行人禽流感诊断或排除者。
1.3 需要采集的环境标本。
2 采集要求2.1 从事人禽流感检测标本采集的技术人员必须经过生物安全培训和具备相应的实验技能。
在标本采集过程中，采样人员参照（附件5）规定的防护措施进行安全防护。
2.2 住院病例的标本由所在医院医护人员在当地疾病预防控制机构专业人员指导下采集。
2.3 标本采集具体种类和数量由现场工作组确定。
2.4 密切接触者标本由当地疾病预防控制机构负责采集。
2.5 根据实验室检测工作的需要，结合病程再次采样。
3 标本种类每个病例应尽可能同时采集上、下呼吸道标本；需要排除人禽流感的死亡病例则依据《传染病病人或疑似传染病病人尸体解剖查验规定》（中华人民共和国卫生部令第43号）的规定采集尸体标本，没有条件进行尸体解剖的，可采集呼吸道灌洗液或经皮穿刺采集肺组织标本。
3.1 上呼吸道标本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液、深咳痰液。
最佳采集时间为发病后3天内。
3.2 下呼吸道标本：包括呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺组织活检标本。
3.3 尸检标本：病人死亡后应依法尽早进行解剖，在严格按照生物安全防护的条件下，进行尸检，主要采集肺、气管组织标本，条件允许下也可采集肝、肾、脾、心脏、脑、淋巴结等组织标本。
3.4 血清标本：每一病例必须采集血清标本，须采集急性期、恢复期双份血清。
第一份血清应尽早（最好在发病后7天内）采集，第二份血清应在发病后1第3～4周采集。
采集量要求5ml，以空腹血为佳，建议使用真空采血管。
3.5 其它标本：如果病例有腹泻症状，可在发病后采集粪便标本；有胸水者可采集胸水标本。
4 标本采集方法4.1 咽拭子：用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
4.2 鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。
取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。
上述两根拭子浸入同一含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
4.3 鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。
将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采样液冲洗收集器1次（亦可用小孩导尿管接在50ml 注射器上来替代收集器）。
4.4 咽漱液：用10ml不含抗菌素的采样液漱口。
漱口时让患者头部微后仰，发“噢”声，让洗液在咽部转动。
然后将咽漱液收集于50ml无菌的螺口塑料管中。
无条件的可用平皿或烧杯收集咽漱液并转入10ml螺口采样管中。
4.5 深咳痰液：要求病人深咳后，将咳出的痰液收集于50ml含3ml采样液的螺口塑料管中。
4.6 呼吸道灌洗液：将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管（约30cm 深处），注入5ml生理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。
收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器1次（亦可用小孩导尿管接在50ml注射器上来替代收集）。
4.7 胸水:在B超定位下进行胸腔穿刺，抽取胸水5ml，置于无菌的塑料螺口管中。
4.8 肺组织活检标本：在超声或X线定位下,经皮穿刺取肺组织活检标本,置于含3ml采样液的塑料螺口管中。
4.9 尸检标本：每一采集部位分别使用不同消毒器械，以防交叉污染；每种组织应多部位取材，各部位应取20～50g，淋巴结取2个。
4.10 粪便标本：采集5～10g粪便置于含5～10ml采样液无菌螺口管中，严格密封。
4.11 血清标本：用真空负压采血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟，1500～2000rpm离心10分钟，收集血清于2ml无菌螺口塑料管中。
注：常用的采样液配方为：pH 7.4～7.6的Hanks氏液或MEM/DMEM液。
在采 2样液中需加入抗菌素，可用青霉素（终浓度为100U/ml）、庆大霉素（终浓度为1mg/ml）和抗真菌药物（终浓度为2µg/ml）。
5 标本包装标本采集后在生物安全Ⅱ级实验室生物安全柜内分装成一式三份（分装标本的生物安全柜不能用于提取核酸）。
一份当地检测用，一份送中国疾病预防控制中心检测，一份保存以备复核。
5.1 所有标本应放在大小适合的带螺旋盖内有垫圈、耐冷冻的塑料管里，拧紧。
容器外注明样本编号、种类、姓名及采样日期。
5.2 将密闭后的标本放入大小合适的塑料袋内密封，每袋装一份标本。
5.3 标本有关信息填写“疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病例标本送检单”见《疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病例标本送检、接收、检测和结果报告反馈工作流程》（中疾控疾发[2005]526号），用另一塑料袋密封。
6 标本保存用于病毒分离和核酸检测的标本应尽快进行检测，24小时内能检测的标本可置于4℃保存，24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存。
如无－70℃保存条件，则于－20℃冰箱暂存。
血清可在4℃存放3天、-20℃以下长期保存。
标本运送期间应避免反复冻融。
标本应设立专库或专柜单独保存。
7 标本送检7.1 上送标本检测结果阳性或可疑的原始标本或分离物应及时送中国疾病预防控制中心复核和进一步检测；省级疾病预防控制机构实验室检测阴性，且有明确流行病学证据的病例的标本送中国疾病预防控制中心进一步检测。
7.2 标本运送的生物安全要求按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院424号令）和《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（中华人民共和国卫生部第45号令）等有关规定执行。
7.3 标本送检的程序各省（区、市）需要向中国疾病预防控制中心送检标本时，应事先与中国疾病预防控制中心疾病控制与应急处理办公室联系。
具体要求见《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（中华人民共和国卫生部第45号令）、《疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病例标本送检、接收、检测和结果报告反馈工作流程》（中疾控疾发[2005]526号）。
8 实验室生物安全从事人禽流感检测的技术人员必须经过生物安全培训和具备相应的实验技 3能，在检测的过程中必须采取生物安全Ⅲ级防护。
不同的标本检测生物安全级别要求如下。
8.1 标本的分装和核酸提取在生物安全Ⅱ级实验室的生物安全柜内进行，病毒培养物的核酸提取必须在生物安全Ⅲ级实验室的生物安全柜内进行。
8.2 标本的抗原快速检测在生物安全Ⅱ级实验室的生物安全柜内进行。
8.3 人禽流感病毒的分离、鉴定必须在生物安全Ⅲ级实验室里进行。
8.4 采用灭活抗原进行血凝抑制试验检测血清抗体时，要求在生物安全Ⅱ级实验室内操作。
采用微量中和试验进行血清抗体检测必须在生物安全Ⅲ级实验室操作。
8.5 阳性标本和分离物的保存及销毁应按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院第424号令）执行。
9 标本的实验室检测9.1 核酸检测：方法包括RT-PCR和Real-Time PCR，建议使用国家流感中心或世界卫生组织推荐的引物和探针。
9.2 抗原快速检测方法包括ELISA法和金标法，本方法仅具参考价值，不作为诊断依据。
9.3 病毒分离及鉴定：采用SPF鸡胚和MDCK细胞分离方法。
病毒的鉴定采用血凝抑制试验、神经氨酸酶抑制试验或序列测定。
9.4 血清学检测：方法包括微量中和试验、血凝抑制试验、单扩溶血试验。
以上实验室检测方法详见《全国流感/人感染高致病性禽流感监测实施方案》。
10 检测结果的判断和报告10.1 各检测项目阳性报告10.1.1 H5基因核酸检测：A型特异性引物能够扩增出预期大小的产物，两对H5亚型特异性引物都能够扩增出预期大小的产物。
10.1.2 抗原快速检测：按照试剂盒说明书进行检测，结果判断为阳性。
10.1.3 病毒分离及鉴定：分离出病毒，并经鉴定为H5亚型或H5N1亚型。
10.1.4 血清学检测：双份血清抗体滴度4倍或以上增高有诊断意义。
10.2 各检测项目阴性报告10.2.1 H5基因核酸检测： 两对H5亚型特异性引物均不能够扩增出预期大小的产物。
10.2.2 抗原快速检测：按照试剂盒说明书进行检测，结果判断为阴性。
10.2.3 病毒分离：培养物红细胞凝集试验阴性。
10.2.4 血清学检测：血清抗体滴度＜1:20为阴性。
410.3 H5基因核酸检测不一致两对H5亚型特异性引物扩增出的产物检测结果不一致时，则对阳性扩增产物进行测序，如果为H5N1病毒序列，则判断为阳性。
标本检测结果有关信息填写“人感染高致病性禽流感标本检测结果反馈表”（具体见《疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病例标本送检、接收、检测和结果报告反馈工作流程》中疾控疾发[2005]526号）。
11 实验室检测流程应采集人禽流感检测对象上呼吸道标本和下呼吸道标本进行禽流感病毒的核酸检测和病毒分离，同时要采集病例的急性期和恢复期血清标本进行H5N1亚型特异性抗体检测。
原则上，先由省级及以下疾病预防控制机构进行初步检测，阳性标本送中国疾病预防控制中心复核；省级疾病预防控制机构实验室检测阴性，且有明确流行病学证据的病例标本送中国疾病预防控制中心进一步检测。
省级疾病预防控制机构不具备检测条件的，送中国疾病预防控制中心或邻近具备相应条件和资格认证的省级疾病预防控制机构进行检测。
具体步骤见人感染高致病性禽流感标本实验室检测流程图。
12 人禽流感实验室检测职责12.1 中国疾病预防控制中心职责12.1.1 对省级以及其它人禽流感检测实验室的检测结果进行复核，并对上送的标本做进一步检测。
12.1.2 对不具备禽流感病毒核酸检测、病毒分离条件的省级上送的标本进行检测。
12.1.3 对需做微量中和实验的血清标本进行微量中和试验。
12.1.4 对分离到的禽流感病毒株做抗原及基因分析。
12.1.5 及时向送检标本的机构反馈检测结果。
12.1.6 对省级疾病预防控制机构实验室人员进行实验室技术和生物安全培训。
12.1.7 对省级疾病预防控制机构实验室提供技术和试剂支持并进行质量控制。
12.1.8 对省级疾病预防控制机构的实验室检测和生物安全工作进行督导。
12.2 省级疾病预防控制机构职责12.2.1 对辖区内人禽流感标本的采集工作提供技术指导和物质支持，必要时直接参与标本的采集。
12.2.2 按照生物安全要求，对采集到的标本进行禽流感病毒的核酸检测、 5血清学检测和抗原检测。