原代细胞培养实验汇总
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原代细胞培养实验
2005年5月
指导教师：费晓方
实验目的和要求：
掌握无菌操作技术。 了解小鼠解剖操作技术。 了解原代细胞培养的一般方法与步骤。 了解培养细胞的消化分散。 了解细胞计数方法。 了解倒置显微镜的使用。
实验原理：
原代细胞培养
是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在 人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的 方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、 细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生 命现象。
Βιβλιοθήκη Baidu
6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组 织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。 7)离心混合的细胞悬液，1200r／rain，5分钟，弃上清。 8)用新鲜的无菌PBS重悬沉淀的细胞，按步骤7再次离心。 9)用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。 10)用含有10％牛血清和抗生素(如青霉素、链霉素)的 DMEM(GIBCO／BRL)lOml再悬沉淀，并使终体积为20ml。 11)让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。可采 用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。 12)为确定现有细胞浓度，加入0.2ml细胞悬液于1.8ml 1％ 醋酸溶液中以裂解红细胞，用血细胞计数器进行细胞计数。 13)按每细胞瓶I x 106细胞的数量接种于10ml组织培养液中， 在饱和湿度的37°C C02培养箱中孵育直至细胞铺满。
2)将1－2个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的 无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用PBS漂洗。 3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 的无菌离 心筒中, 加入40ml 0.25％的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻 搅动 。 4)在温暖的环境中或置于37 °C培养箱中轻轻摇动15分 钟。 5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮 细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照 每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活, 胰蛋白酶。
实验内容：
动物的选择： 选择大约一半足孕时间的胚胎，10－13 天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞， 成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。 每组小鼠胚胎1个
实验材料：
每组的超净台中有以下物品： 1. 50ml 配制好的RPMI1640培养液1瓶；8ml小牛 血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶； PBS(-)1 瓶 2. 100ml灭菌烧杯2个； 3、50ml离心筒2个 4、灭菌培养皿1个，细胞培养瓶1个 4、1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌 玻璃搅拌棒1个 5、细胞计数板1块； 6、灭好菌的镊子1把，剪刀1把； 7、酒精灯1台；
试验操作步骤：
1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠) a．采用认可的方案处死啮齿动物。 b．立即在无菌超净台内用70％乙醇擦洗整个动物。 c．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用 无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的 子宫，置于无菌的培养皿上。 e．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌 PBS的100ml烧杯中。 f．漂洗胚胎，去掉PBS。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗 液清亮为止。
2005年5月
指导教师：费晓方
实验目的和要求：
掌握无菌操作技术。 了解小鼠解剖操作技术。 了解原代细胞培养的一般方法与步骤。 了解培养细胞的消化分散。 了解细胞计数方法。 了解倒置显微镜的使用。
实验原理：
原代细胞培养
是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在 人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的 方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、 细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生 命现象。
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6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组 织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。 7)离心混合的细胞悬液，1200r／rain，5分钟，弃上清。 8)用新鲜的无菌PBS重悬沉淀的细胞，按步骤7再次离心。 9)用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。 10)用含有10％牛血清和抗生素(如青霉素、链霉素)的 DMEM(GIBCO／BRL)lOml再悬沉淀，并使终体积为20ml。 11)让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。可采 用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。 12)为确定现有细胞浓度，加入0.2ml细胞悬液于1.8ml 1％ 醋酸溶液中以裂解红细胞，用血细胞计数器进行细胞计数。 13)按每细胞瓶I x 106细胞的数量接种于10ml组织培养液中， 在饱和湿度的37°C C02培养箱中孵育直至细胞铺满。
2)将1－2个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的 无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用PBS漂洗。 3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 的无菌离 心筒中, 加入40ml 0.25％的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻 搅动 。 4)在温暖的环境中或置于37 °C培养箱中轻轻摇动15分 钟。 5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮 细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照 每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活, 胰蛋白酶。
实验内容：
动物的选择： 选择大约一半足孕时间的胚胎，10－13 天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞， 成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。 每组小鼠胚胎1个
实验材料：
每组的超净台中有以下物品： 1. 50ml 配制好的RPMI1640培养液1瓶；8ml小牛 血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶； PBS(-)1 瓶 2. 100ml灭菌烧杯2个； 3、50ml离心筒2个 4、灭菌培养皿1个，细胞培养瓶1个 4、1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌 玻璃搅拌棒1个 5、细胞计数板1块； 6、灭好菌的镊子1把，剪刀1把； 7、酒精灯1台；
试验操作步骤：
1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠) a．采用认可的方案处死啮齿动物。 b．立即在无菌超净台内用70％乙醇擦洗整个动物。 c．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用 无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的 子宫，置于无菌的培养皿上。 e．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌 PBS的100ml烧杯中。 f．漂洗胚胎，去掉PBS。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗 液清亮为止。