真菌吸附金属离子

表面活性剂处理过的真菌吸附水溶液中重金属离子1. 实验背景和目标近年来,生物吸附重金属的方法以其材料来源广泛、成本低、吸附速度快、吸附量大、选择性高、易回收等特点,引起了国内外的广泛关注.很多研究表明：黄孢原毛平革菌和简青霉对水溶液中金属离子（Pb2+，Cr6+…）具有良好吸附作用。

由于细胞表面的衣鞘（分泌的胞外聚合物等组成），细胞壁，细胞膜上以及细胞内有很多能吸附重金属离子阳离子的阴性基团。

死菌也可以吸附重金属，甚至比活菌的吸附效率更高，同时还避免了由于重金属离子对活体细胞的毒性而使其应用受到限制的问题，因此，其操作更容易和应用更广泛。

死菌吸附主要是由于细胞壁表面一些化学基团的络合、配位作用与金属离子形成离子键、共价键。

一般认为，表面活性剂与细胞膜中的脂质和蛋白质相互作用，引起细胞膜通透性的增加,促进细胞内次生代谢物的释放，一方面能降低次生代谢物对其自身合成的反馈抑制，提高产量，另一方面有利于产物的分离纯化和连续生产，提高生产效率，降低成本。

研究表明：185～190 mg/L 的Triton X - 100 可使细胞膜和液泡膜渗透率均提高90 % ，但对细胞生长有一定影响。

Tween - 20 为非离子型表面活性剂，对悬浮培养的细胞作用比较温和，其分子上的聚氧乙烯基能够与极性分子(如紫草宁) 结合,起到增溶作用；同时，Tween 20 的亲水亲油平衡值高于吐温其它类型，其亲水性较强，增溶效果更明显，因而应用广泛。

此外，吐温还可能有利于提高某些酶的稳定性和催化能力，但高浓度的吐温对细胞活力有很大影响，因此要注意表面活性剂的添加浓度和添加时间。

还发现使用适当浓度的二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide) 显著促进次生代谢物从细胞的释放，或者促进次生代谢物合成。

用Tween - 20 和Triton X- 100 处理野葛悬浮细胞能够显著提高细胞培养物的生物量，随着处理浓度加大,提高生物量的作用增强。

而浓度为1 %～5 %的Tween - 20 和Triton X - 100 分别处理野葛悬浮细胞3d后，细胞和培养液的颜色逐渐深于对照，培养物研磨后粉末粘连呈絮状，不易过筛，可能对细胞有伤害。

抑制作用。

本研究的目的是确定表面活性剂对真菌生长代谢的影响，并对其机理进行探讨。

重金属的吸附实验是为了使这种影响具体化。

2. 实验准备2.1 实验须知：三种ST的CMC：CMC-Triton X-100=0.31mM=（0.31×646.86）=200.5 mg/l＝0.02％；CMC-SDS＝8.0 mM＝（8.0×288.38）＝2307.4 mg/l＝0.023％；CMC-Tween-80＝0.011 mM＝（0.011×1310）＝14.41 mg/l＝0.0014％；2.2 Cd，Zn，Pb标准曲线Cd（0.05-1 mg/l，0.44-8.9 μM）在用原子吸收分光光度法测试样品中Cd2+浓度以前，先测定Cd2+的原子吸收标准曲线。

具体做法是：Cd2+标准储备液（1.0000mg/mL）：称取0.2000g(精确至0.0002g)金属铅粉（光谱纯）于50mL烧杯中，溶于10mL （20 mL）优级纯HNO3中，微热溶解，溶解的时间比较长，放置几个小时，会自然溶解。

冷却，移入200mL容量瓶中，用超纯水稀释并定容。

此溶液含1mg/mL的镉。

Cd 2+标准使用液（10 mg/L）：取1.0mL Pb标准储备液溶于100mL容量瓶中定容。

吸取镉标准使用液0、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0mL分别于6个100mL容量瓶中，用0.2% HNO3溶液定容（取2.2mL优级纯硝酸，加纯水定容至1000mL）、摇匀。

此标准系列分别含镉0、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0mg/L。

用原子吸收分光光度法测其吸光度，重金属离子浓度为x轴，平均值为y轴，方程为y＝__________________，相关系R2=__________Zn（0.05-1 mg/l，0.77-15.38 μM）在用原子吸收分光光度法测试样品中Zn2+浓度以前，先测定Zn2+的原子吸收标准曲线。

具体做法是：Zn2+标准储备液（1.0000mg/mL）：称取0.2000g(精确至0.0002g)金属锌粉（光谱纯）于50mL烧杯中，溶于20mL HNO3中（（1+5）的HNO3），微热溶解，溶解的时间比较长，放置几个小时，会自然溶解。

冷却，移入200mL容量瓶中，用超纯水稀释并定容。

此溶液含1mg/mL的铅。

Zn2+标准使用液（10 mg/L）：取1.0mL 锌标准储备液溶于100mL容量瓶中定容。

吸取锌标准使用液0、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0mL分别于6个100mL容量瓶中，用0.2%HNO3溶液定容（取2.2mL优级纯硝酸，加纯水定容至1000mL）、摇匀。

此标准系列分别含锌0、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0mg/L。

用原子吸收分光光度法测其吸光度，重金属离子浓度为x轴，平均值为y轴，方程为y＝__________________，相关系R2=__________Pb（0.2-10 mg/l，0.97-48.26 μM）Pb 2+标准储备液（1.0000mg/mL）：称取0.2000g(精确至0.0002g)金属锌粉（光谱纯）于50mL烧杯中，溶于20mL HNO3（优级纯）中（（1+5）的HNO3），微热溶解，溶解的时间比较长，放置几个小时，会自然溶解。

冷却，移入200mL 容量瓶中，用超纯水稀释并定容。

此溶液含1mg/mL的铅。

Pb 2+标准使用液（50 mg/L）：取5.0mL Pb标准储备液溶于100mL容量瓶中定容。

吸取锌标准使用液0、1.0、2.0，6.0、10.0、20.0mL分别于6个100mL容量瓶中，用0.2% HNO3溶液定容（取2.2mL优级纯硝酸，加纯水定容至1000mL）、摇匀。

此标准系列分别含铅0、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0mg/L。

用原子吸收分光光度法测其吸光度，重金属离子浓度为x轴，平均值为y轴，方程为y＝__________________，相关系R2=__________3. 实验部分3.1菌种的培养（简青霉Penicillium simplicissimum和黄孢原毛平革菌phanerochaete chrysosporium）[1, 2]3.1.1 培养基固体培养基:采用马铃薯葡萄糖培养基。

培养基pH值为自然pH值，在生化培养箱于30 ℃的条件下划线培养5d，然后冰箱4 ℃保藏。

具体做法：200 g马铃薯放入1000 mL蒸馏水中煮，煮沸开始计时，30 min后，用8层纱布过滤。

再加20 g葡萄糖和20 g琼脂。

然后转移到锥形瓶中，灭菌。

100 mL 溶液可放6个一般大小的培养皿。

按需要制备。

液体培养基[3]无机盐溶液（MSM）3.1.2 菌种培养取500 mL锥形瓶中装液体培养基200 mL，于115 ℃条件下灭菌30 min。

灭菌后并冷却，每100 mL 液体培养基分别接种1.0 mL浓度为1. 0 ×106个·mL– 1的真菌悬浮菌液，（将平板上的真菌孢子刮入无菌水中, 形成孢子悬液，用浊度仪确定孢子液的浓度），于30 ℃、150 rpm的条件下振荡培养2d。

[3]液体培养中，向培养基中分别加入一定量的表面活性剂（Tween-80、SDS、Triton X-100，saponin和RL），与不添加表面活性剂的空白培养作对照。

取500 mL的锥形瓶，按上述培养要求加入相应的试剂进行培养。

培养2d后，离心发酵液来收集菌体（10733×g，10 min）。

收集的菌体再用MSM清洗2遍。

[3]由于对培养时间没有经验，所以如果第2 d的菌体量不是很大，可以延长至第3或4 d。

3.2 探测实验具体做法：按3.1.2的方法培养菌体，其中表面活性剂的浓度为0.05％。

经过MSM清洗后的菌体分成2部分，一部分在60℃下烘大于24 h（至恒重），另一部分冷冻干燥（至恒重），然后分别将其研磨成粉末状，过筛180目筛，标记，得到制成颗粒状的生物吸附剂，放置干燥器中保存备用。

[4]用0.001M NaCl 配置1.0 g/L的生物吸附剂，测定该溶液的zeta potential。

在50 mL锥形瓶的20 mL溶液反应体系中，测定1.0 g/L的生物吸附剂对Cd，Zn 和Cu的吸附效果。

各金属溶液的初始浓度均为20.0 mg/L，pH4（用0.1M NaOH or HNO3调节pH值），转速120 rpm，温度28℃，吸附时间t＝4 h。

吸附结束后离心反应液（10733×g，10 min），取上清液稀释到标准曲线的范围内用原子吸收分光光度计测剩余金属离子的质量浓度。

做3个平行样。

[3]后续实验可改用发酵罐大批量发酵制取菌体。

3.3 表面活性剂浓度的影响经过3.2的吸附实验后，选出有显著性差异效果的表面活性剂，在培养基中加入不同浓度的该表面活性剂进行培养。

浓度设计为0，0.005, 0.01，0.05，0.1，0.2 %。

结论在试验3.2和3.3探测试验（关于简青霉）的基础上（具体数据见文件夹《20100514预试验和结论-简青霉》），分别选择以下活性剂对应的浓度对菌体生长进行影响：Saponin (%): 0.005，0.025，0.1 （设计梯度为：1/5/20）；RL (%): 0.005，0.025，0.05（设计梯度为：1/5/10）；SDS (%): 0.001，0.005，0.01（设计梯度为：1/5/10）；Triton X-100 (%): 0.05，0.2，0.5（设计梯度为：1/4/10）；对Triton X-100 在0.5的浓度先发酵少量的，对一种重金属做三个平行样吸附试验的试探，如果效果好再大批量发酵.在探测试验中，Saponin和RL影响下简青霉对Cu的吸附率为98％左右，其余的吸附情况为70％左右。

说明：以上四种surfactant在系列浓度影响下的黄孢菌体生长量不理想，没有进行探测试验3.4 吸附实验3.4.1 处理过的吸附剂用量对吸附的影响（简青霉）在50 mL锥形瓶的20 mL溶液反应体系中，测定各种不同浓度的的生物吸附剂对Cd，Zn和Cu的吸附效果。

各金属溶液的初始浓度均为20.0 mg/L，pH4（用0.1M NaOH or HNO3调节pH值），转速120 rpm，温度28 ℃，吸附时间t＝4 h。

吸附结束后离心反应液（10733×g，10 min），取上清液稀释到标准曲线的范围内用原子吸收分光光度计测剩余金属离子的质量浓度。