乳酸菌的筛选及生物学特性的研究
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镜检细胞形态 ,大小 ,排列方式及革兰氏染色 ,结果见表 2. 表 2 5 株菌的形态特征
Table 2 Morphology and size of 5 strains
编号 A-1
A-2 B-1 B-2 B-3
染色
G G G G G
+ + + + +
μm 大小 / d =1 - 2 ( 0. 5 ～1 ) ×( 2 ～3 ) ( 0. 5 ～1 ) ×( 2 ～3 ) ( 0. 5 ～1 ) ×( 1. 5 ～2 ) (0. 5 ～1) ×(2. 5 ～3. 5)
1. 4. 7 产葡聚糖试验
将菌种接种于葡聚糖试验培养基中 , 37 ℃ 培养 48 ～96 h,若斜面培养物形成粘稠状菌苔 ,表明该菌株产生葡聚糖 , 为阳 性.
1. 4. 8 葡萄糖产酸产气试验
在改良的 PY基础培养基中加入 30 g葡萄糖 , 0. 5 mL 吐温 80, 0. 5%琼脂 , 1. 6%溴甲酚紫适量 ,分装试管高度为 4 ～5 cm ,
Screen in g and study in g on b iolog ica l character istics of lactic ac id bacter ia WANG L i, L I U Xiu 2hua, L I U Yan 2ya
(Departm ent of L ife Science, Shangqiu Teachers University, Shangqiu 476000, China)
012 g, M gSO4 ・7H2 O 0. 48 g, K2 HPO4 1. 0 g, KH2 PO4 1. 0 g, NaHCO3 10. 0 g, NaCl 2. 0 g ) ,蒸馏水 100 mL. MRS液体培养基 (L ) : 蛋白胨 10. 0 g, 牛肉膏 10. 0 g, 酵母提取物 5. 0 g, K2 HPO4 2. 0 g, 柠檬酸三铵 2. 0 g, 乙酸钠 5. 0 g, 葡萄糖 20. 0 g, 吐温 80 1. 0 mL , M gSO4 ・7H2 O 0. 5 g, M nSO4 ・4H2 O 0. 25 g, 调 pH 至 6. 2 ～6. 4, 115 ℃ 灭菌 25 m in.
18. 0 g, 吐温 80 0. 5 mL , 蒸馏水 900 mL , 调 pH 至 7. 0, 115 ℃ 灭菌 25 m in .
[8 ]
改良的 PY基础培养基 : 蛋白胨 0. 5 g, 胰蛋白胨 0. 5 g, 酵母提取物 1. 0 g, 盐溶液 4. 0 mL (盐溶液成分 ( L ) : 无水 CaCl2
1. 4. 6 V - P试验
将试验菌接种于改良的 PY基础液体培养基中 , 37 ℃ 恒温培养 24 h、 96 h、 144 h,向培养物中加入 10 ～20 滴 40% NaOH, 再加入 0. 5 ～1 mg肌酸 ,用力振荡 ,置于室温 30 ～60 m in,若培养物呈红色者为 V - P阳性 .
摘 要 : 从酸奶样品中分离 、 筛选出 5 株乳酸菌 ,经过形态学测试及生理生化反应试验 , 最后确定其中 2 株为 嗜热链球菌 . 关键词 : 乳酸菌 ; 筛选 ; 生物学特性 中图分类号 : Q939111 + 7 文献标识码 : A 文章编号 : 1672 - 3600 ( 2008 ) 12 - 0098 - 04
明胶基础培养基 ( 100 mL ) : 明胶 12. 0 g, 蛋白胨 1. 0 g, 酵母提取物 1. 0 g, 葡萄糖 0. 1 g, 盐溶液 4. 0 mL (与 PY基础培养 基相同 ) , 115 ℃ 灭菌 25 m in. 收稿日期 : 2008 - 06 - 24; 修回日期 : 2008 - 09 - 24 基金项目 : 河南省科技攻关项目 (0424240005) 作者简介 : 王莉 ( 1978 - ) ,女 ,辽宁抚顺人 ,商丘师范学院助教 ,硕士 ,主要从事微生物代谢控制发酵的研究 . © 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
第 12 期 王莉 ,等 : 乳酸菌的筛选及生物学特性的研究
99
产葡聚糖试验培养基 (L ) : 胰蛋白胨 10. 0 g, K2 HPO4 5. 0 g, 酵母提取物 5. 0 g, 柠檬酸三铵 5. 0 g, 蔗糖 50. 0 g, 琼脂
1510 g, 115 ℃ 灭菌 25 m in.
边缘 完整 完整 完整 完整 波状
颜色 乳白 乳白 乳白 乳白 微黄
由表 1 可见 , A - 1、 A - 2、 B - 1、 B - 2、 B - 3 的菌落呈乳白色或略显黄色 ,形状均为圆形 ; 菌落由透明到不透明 ,边缘整齐 或呈波状 ; 其中 B - 1 菌落表面粗糙 .
2. 2 细胞形态检测结果
Table 1 Morphology and size of colonies
编号 A-1
A-2 B-1 B-2 B-3
形状 圆形 圆形 圆形 圆形 圆形
大小 1 mm
2 cm 5 - 6 cm 1 cm 2 - 3 cm
表面 光滑 光滑 粗糙 光滑 光滑
隆起 垫状 扁平 突起 凸透镜状 突起
透明度 稍透明 较透明 不透明 稍透明 不透明
可溶性淀粉培养基 : 向 PY基础培养基中加入 0. 5%的可溶性淀粉 .
1. 3 样品中乳酸菌的分离和纯化
-5 -6 在超净工作台上取酸奶样品 1 mL ,用无菌水分别稀释为 10 - 4 、 10 、 10 3 个稀释度 ,然后分别取 0. 2 mL ,涂布于西红柿
汁培养基平板上 , 37 ℃ 恒温培养 48 h. 对所有不同菌落进行编号 ,并划线分离 3 ～4 次 ,最后选择单菌落 ,观察菌落特征 ,镜检确认为纯培养 ,采用革兰氏染色法 观察其细胞形态 .
形态 卵圆形 长杆 长杆 短杆似球 长杆
排列方式 成对或呈链球状 单个无规则排列 单个无规则排列 单个或呈链球状 单个无规则排列
由表 2 可以看出 ,从酸奶中分离的 5 株菌均为 G + ,菌体呈杆状或链球状 . 根据陈晓平 、 肖静等人 [ 6, 10 ]的研究 ,综合表 1、 表 2 结果可知 , A - 1、 B - 2 具有链球菌的形态学特征 ; A - 2、 B - 3 具有乳杆 菌的形态学特征 ; B - 1 因菌落表面粗糙 ,不符合乳酸菌的特征 .
112 ℃ 灭菌 25 m in备用 .
用较大量的新鲜活力强的菌种进行穿刺接种 ,若指示剂变黄表示产酸 ,软琼脂柱内产生气泡表示产气 .
1. 4. 9 碳水化合物发酵产酸试验
在改良的 PY基础培养基中分别加入碳水化合物至最终浓度为 1% ,分装试管 ,高度为 4 ～5 cm ,灭菌后接种 , 37 ℃ 培养 48
1. 4. 4 运动性试验
用直针穿刺接种于半固体培养基中 ,置 37 ℃ 培养 48 ～72 h,若培养物只生长在接种的穿刺线上 ,边缘十分清晰 ,则表明试 验菌无运动性 ; 若培养物生长由穿刺线向四周呈云雾状扩散 ,其边缘模糊 ,则表明试验菌有运动性 .
1. 4. 5 明胶液化试验
试验菌接种于明胶基础培养基后 37 ℃ 培养 ,观察时低温处理 ,如对照管 (未接菌 )凝固而接种管液化为阳性 ,同时凝固为 阴性 .
h,取未加碳水化合物的 PY基础培养基做对照 ,使用 BTB - MR 试剂指示产酸程度
[ 9～12 ]
.
1. 5 菌种的保存
采用定期移植保存法 ,在培养基中加入 1% CaCO3 ,有利于保存 , 2 个月移植一次 [ 9 , 12 ] .
2 结果与讨论
2. 1 菌萿形态检验结果
从 2 个待分离样品中筛选出 5 株菌种 . 菌种编号分别为 : 伊利酸奶 A - 1、 A - 2,蒙牛酸奶 B - 1、 B - 2、 B - 3,结果如表 1 所 示.
1. 4 生理生化试验 1. 4. 1 接触酶检测
取 1 ～2 环斜面培养物 (培养基中至少含有 1%的葡萄糖 ) ,涂于干净的载玻片上 ,然后在其上滴加 15%的 H2 O2. 若有气 泡产生为阳性反应 ,无气泡为阴性反应 .
Leabharlann Baidu
1. 4. 2 KOH 试验
用灭菌的接种环加 1 ～2 环 5% KOH 溶液于干净的载玻片上 ,挑菌于溶液中 ,用接种环将其混合搅匀 ,短时间内 KOH 试 验阳性菌会越搅越稠 ,抬起接种环会有拉丝现象 ,而 KOH 试验菌阴性则无拉丝现象 .
1 材料与方法
1. 1 样品来源
酸奶 : 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 ,内蒙古蒙牛乳业 (集团 )股份有限公司
1. 2 培养基
西红柿汁培养基 : 酵母膏 7. 5 g, 蛋白胨 7. 5 g, 葡萄糖 10. 0 g, 西红柿汁 100 mL , K2 HPO4 2. 0 g, CaCO3 3. 0 g, 琼脂粉
Abstract: In this paper, we isolated and screened lactic acid bacteria from acidophilus m ilk. Based on the morphol2 ogy and a series of physiological and biochem ical test, 2 of 5 strains were identified as S. ther m oph ilus . Key words: lactic acid bacteria; screening; biological characteristics
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
http://www.cnki.net
100
商 丘 师 范 学 院 学 报 2008 年 表 1 菌落形态特征
第 24 卷第 12 期 2008 年 12 月
商丘师范学院学报
JOURNAL OF SHANGQ I U TEACHERS COLLEGE
Vol . 24 No. 12 Dec. 2008
乳酸菌的筛选及生物学特性的研究
王莉 ,刘秀花 ,刘燕雅
(商丘师范学院 生命科学系 ,河南 商丘 476000 )
乳酸菌是一类能在可利用的碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌 . 这类细菌广泛存在于土壤 、 植物根 、 茎、 湖泊及 人与动物的体内 . 乳酸菌从形态上可以分为球状 、 类球状 、 短杆或杆状 ,绝大多数为在缺少氧气的环境中生长良好的兼性厌氧 菌或厌氧性细菌 [ 1 ] . 乳酸菌在食品生物技术领域具有重要的作用 ,目前 , 应用于很多发酵食品的生产中 , 如奶酪 、 干制发酵香肠 、 酸面团面包 等 . 乳酸菌作为一种益生菌 ,不仅具有提高食品的营养价值 , 改善食品风味 , 延长食品保存时间的功能 , 而且对人体有多方面 的保健作用 ,如能调节肠道菌群 、 维持体内生态平衡 ,抑制肠道内腐败菌的生长繁殖 , 消除体内有毒物质的产生 , 降低胆固醇 水平 ,帮助消化 ,防止便秘 ,抗肿瘤等 [ 2 - 7 ] . 本文就市售酸奶中的乳酸菌进行了分离筛选 ,并进行了菌种鉴定 ,对其生物学特性 进行了初步探讨 ,为进一步研究开发新型乳酸菌剂奠定基础 .
1. 4. 3 需氧试验
将分离纯化后的各种菌株分别接种于高层 MRS液体培养基中 , 37 ℃ 静置培养 48 h 后 ,观察生长情况 , 初步判明 : 凡发酵 液清亮 ,底部有大量沉淀为厌氧菌 ; 凡发酵液均匀浑浊为耐氧菌 ; 凡发酵液上层清亮 (约 1 ～2 cm ) ,下层浑浊 ,为微好氧菌 ; 凡 发酵液上层较浑浊 ,而下层相对较清亮为兼性厌氧菌 ; 凡发酵液液体清亮 ,液面有菌膜 、 菌环 ,为好氧菌 .
Table 2 Morphology and size of 5 strains
编号 A-1
A-2 B-1 B-2 B-3
染色
G G G G G
+ + + + +
μm 大小 / d =1 - 2 ( 0. 5 ～1 ) ×( 2 ～3 ) ( 0. 5 ～1 ) ×( 2 ～3 ) ( 0. 5 ～1 ) ×( 1. 5 ～2 ) (0. 5 ～1) ×(2. 5 ～3. 5)
1. 4. 7 产葡聚糖试验
将菌种接种于葡聚糖试验培养基中 , 37 ℃ 培养 48 ～96 h,若斜面培养物形成粘稠状菌苔 ,表明该菌株产生葡聚糖 , 为阳 性.
1. 4. 8 葡萄糖产酸产气试验
在改良的 PY基础培养基中加入 30 g葡萄糖 , 0. 5 mL 吐温 80, 0. 5%琼脂 , 1. 6%溴甲酚紫适量 ,分装试管高度为 4 ～5 cm ,
Screen in g and study in g on b iolog ica l character istics of lactic ac id bacter ia WANG L i, L I U Xiu 2hua, L I U Yan 2ya
(Departm ent of L ife Science, Shangqiu Teachers University, Shangqiu 476000, China)
012 g, M gSO4 ・7H2 O 0. 48 g, K2 HPO4 1. 0 g, KH2 PO4 1. 0 g, NaHCO3 10. 0 g, NaCl 2. 0 g ) ,蒸馏水 100 mL. MRS液体培养基 (L ) : 蛋白胨 10. 0 g, 牛肉膏 10. 0 g, 酵母提取物 5. 0 g, K2 HPO4 2. 0 g, 柠檬酸三铵 2. 0 g, 乙酸钠 5. 0 g, 葡萄糖 20. 0 g, 吐温 80 1. 0 mL , M gSO4 ・7H2 O 0. 5 g, M nSO4 ・4H2 O 0. 25 g, 调 pH 至 6. 2 ～6. 4, 115 ℃ 灭菌 25 m in.
18. 0 g, 吐温 80 0. 5 mL , 蒸馏水 900 mL , 调 pH 至 7. 0, 115 ℃ 灭菌 25 m in .
[8 ]
改良的 PY基础培养基 : 蛋白胨 0. 5 g, 胰蛋白胨 0. 5 g, 酵母提取物 1. 0 g, 盐溶液 4. 0 mL (盐溶液成分 ( L ) : 无水 CaCl2
1. 4. 6 V - P试验
将试验菌接种于改良的 PY基础液体培养基中 , 37 ℃ 恒温培养 24 h、 96 h、 144 h,向培养物中加入 10 ～20 滴 40% NaOH, 再加入 0. 5 ～1 mg肌酸 ,用力振荡 ,置于室温 30 ～60 m in,若培养物呈红色者为 V - P阳性 .
摘 要 : 从酸奶样品中分离 、 筛选出 5 株乳酸菌 ,经过形态学测试及生理生化反应试验 , 最后确定其中 2 株为 嗜热链球菌 . 关键词 : 乳酸菌 ; 筛选 ; 生物学特性 中图分类号 : Q939111 + 7 文献标识码 : A 文章编号 : 1672 - 3600 ( 2008 ) 12 - 0098 - 04
明胶基础培养基 ( 100 mL ) : 明胶 12. 0 g, 蛋白胨 1. 0 g, 酵母提取物 1. 0 g, 葡萄糖 0. 1 g, 盐溶液 4. 0 mL (与 PY基础培养 基相同 ) , 115 ℃ 灭菌 25 m in. 收稿日期 : 2008 - 06 - 24; 修回日期 : 2008 - 09 - 24 基金项目 : 河南省科技攻关项目 (0424240005) 作者简介 : 王莉 ( 1978 - ) ,女 ,辽宁抚顺人 ,商丘师范学院助教 ,硕士 ,主要从事微生物代谢控制发酵的研究 . © 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
第 12 期 王莉 ,等 : 乳酸菌的筛选及生物学特性的研究
99
产葡聚糖试验培养基 (L ) : 胰蛋白胨 10. 0 g, K2 HPO4 5. 0 g, 酵母提取物 5. 0 g, 柠檬酸三铵 5. 0 g, 蔗糖 50. 0 g, 琼脂
1510 g, 115 ℃ 灭菌 25 m in.
边缘 完整 完整 完整 完整 波状
颜色 乳白 乳白 乳白 乳白 微黄
由表 1 可见 , A - 1、 A - 2、 B - 1、 B - 2、 B - 3 的菌落呈乳白色或略显黄色 ,形状均为圆形 ; 菌落由透明到不透明 ,边缘整齐 或呈波状 ; 其中 B - 1 菌落表面粗糙 .
2. 2 细胞形态检测结果
Table 1 Morphology and size of colonies
编号 A-1
A-2 B-1 B-2 B-3
形状 圆形 圆形 圆形 圆形 圆形
大小 1 mm
2 cm 5 - 6 cm 1 cm 2 - 3 cm
表面 光滑 光滑 粗糙 光滑 光滑
隆起 垫状 扁平 突起 凸透镜状 突起
透明度 稍透明 较透明 不透明 稍透明 不透明
可溶性淀粉培养基 : 向 PY基础培养基中加入 0. 5%的可溶性淀粉 .
1. 3 样品中乳酸菌的分离和纯化
-5 -6 在超净工作台上取酸奶样品 1 mL ,用无菌水分别稀释为 10 - 4 、 10 、 10 3 个稀释度 ,然后分别取 0. 2 mL ,涂布于西红柿
汁培养基平板上 , 37 ℃ 恒温培养 48 h. 对所有不同菌落进行编号 ,并划线分离 3 ～4 次 ,最后选择单菌落 ,观察菌落特征 ,镜检确认为纯培养 ,采用革兰氏染色法 观察其细胞形态 .
形态 卵圆形 长杆 长杆 短杆似球 长杆
排列方式 成对或呈链球状 单个无规则排列 单个无规则排列 单个或呈链球状 单个无规则排列
由表 2 可以看出 ,从酸奶中分离的 5 株菌均为 G + ,菌体呈杆状或链球状 . 根据陈晓平 、 肖静等人 [ 6, 10 ]的研究 ,综合表 1、 表 2 结果可知 , A - 1、 B - 2 具有链球菌的形态学特征 ; A - 2、 B - 3 具有乳杆 菌的形态学特征 ; B - 1 因菌落表面粗糙 ,不符合乳酸菌的特征 .
112 ℃ 灭菌 25 m in备用 .
用较大量的新鲜活力强的菌种进行穿刺接种 ,若指示剂变黄表示产酸 ,软琼脂柱内产生气泡表示产气 .
1. 4. 9 碳水化合物发酵产酸试验
在改良的 PY基础培养基中分别加入碳水化合物至最终浓度为 1% ,分装试管 ,高度为 4 ～5 cm ,灭菌后接种 , 37 ℃ 培养 48
1. 4. 4 运动性试验
用直针穿刺接种于半固体培养基中 ,置 37 ℃ 培养 48 ～72 h,若培养物只生长在接种的穿刺线上 ,边缘十分清晰 ,则表明试 验菌无运动性 ; 若培养物生长由穿刺线向四周呈云雾状扩散 ,其边缘模糊 ,则表明试验菌有运动性 .
1. 4. 5 明胶液化试验
试验菌接种于明胶基础培养基后 37 ℃ 培养 ,观察时低温处理 ,如对照管 (未接菌 )凝固而接种管液化为阳性 ,同时凝固为 阴性 .
h,取未加碳水化合物的 PY基础培养基做对照 ,使用 BTB - MR 试剂指示产酸程度
[ 9～12 ]
.
1. 5 菌种的保存
采用定期移植保存法 ,在培养基中加入 1% CaCO3 ,有利于保存 , 2 个月移植一次 [ 9 , 12 ] .
2 结果与讨论
2. 1 菌萿形态检验结果
从 2 个待分离样品中筛选出 5 株菌种 . 菌种编号分别为 : 伊利酸奶 A - 1、 A - 2,蒙牛酸奶 B - 1、 B - 2、 B - 3,结果如表 1 所 示.
1. 4 生理生化试验 1. 4. 1 接触酶检测
取 1 ～2 环斜面培养物 (培养基中至少含有 1%的葡萄糖 ) ,涂于干净的载玻片上 ,然后在其上滴加 15%的 H2 O2. 若有气 泡产生为阳性反应 ,无气泡为阴性反应 .
Leabharlann Baidu
1. 4. 2 KOH 试验
用灭菌的接种环加 1 ～2 环 5% KOH 溶液于干净的载玻片上 ,挑菌于溶液中 ,用接种环将其混合搅匀 ,短时间内 KOH 试 验阳性菌会越搅越稠 ,抬起接种环会有拉丝现象 ,而 KOH 试验菌阴性则无拉丝现象 .
1 材料与方法
1. 1 样品来源
酸奶 : 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 ,内蒙古蒙牛乳业 (集团 )股份有限公司
1. 2 培养基
西红柿汁培养基 : 酵母膏 7. 5 g, 蛋白胨 7. 5 g, 葡萄糖 10. 0 g, 西红柿汁 100 mL , K2 HPO4 2. 0 g, CaCO3 3. 0 g, 琼脂粉
Abstract: In this paper, we isolated and screened lactic acid bacteria from acidophilus m ilk. Based on the morphol2 ogy and a series of physiological and biochem ical test, 2 of 5 strains were identified as S. ther m oph ilus . Key words: lactic acid bacteria; screening; biological characteristics
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
http://www.cnki.net
100
商 丘 师 范 学 院 学 报 2008 年 表 1 菌落形态特征
第 24 卷第 12 期 2008 年 12 月
商丘师范学院学报
JOURNAL OF SHANGQ I U TEACHERS COLLEGE
Vol . 24 No. 12 Dec. 2008
乳酸菌的筛选及生物学特性的研究
王莉 ,刘秀花 ,刘燕雅
(商丘师范学院 生命科学系 ,河南 商丘 476000 )
乳酸菌是一类能在可利用的碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌 . 这类细菌广泛存在于土壤 、 植物根 、 茎、 湖泊及 人与动物的体内 . 乳酸菌从形态上可以分为球状 、 类球状 、 短杆或杆状 ,绝大多数为在缺少氧气的环境中生长良好的兼性厌氧 菌或厌氧性细菌 [ 1 ] . 乳酸菌在食品生物技术领域具有重要的作用 ,目前 , 应用于很多发酵食品的生产中 , 如奶酪 、 干制发酵香肠 、 酸面团面包 等 . 乳酸菌作为一种益生菌 ,不仅具有提高食品的营养价值 , 改善食品风味 , 延长食品保存时间的功能 , 而且对人体有多方面 的保健作用 ,如能调节肠道菌群 、 维持体内生态平衡 ,抑制肠道内腐败菌的生长繁殖 , 消除体内有毒物质的产生 , 降低胆固醇 水平 ,帮助消化 ,防止便秘 ,抗肿瘤等 [ 2 - 7 ] . 本文就市售酸奶中的乳酸菌进行了分离筛选 ,并进行了菌种鉴定 ,对其生物学特性 进行了初步探讨 ,为进一步研究开发新型乳酸菌剂奠定基础 .
1. 4. 3 需氧试验
将分离纯化后的各种菌株分别接种于高层 MRS液体培养基中 , 37 ℃ 静置培养 48 h 后 ,观察生长情况 , 初步判明 : 凡发酵 液清亮 ,底部有大量沉淀为厌氧菌 ; 凡发酵液均匀浑浊为耐氧菌 ; 凡发酵液上层清亮 (约 1 ～2 cm ) ,下层浑浊 ,为微好氧菌 ; 凡 发酵液上层较浑浊 ,而下层相对较清亮为兼性厌氧菌 ; 凡发酵液液体清亮 ,液面有菌膜 、 菌环 ,为好氧菌 .