2发酵工业菌种

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发酵工艺第2章发酵工业微生物菌种制备原理和技术

微生物菌种保藏机构名称和缩写
中国缩写
ACCC
SH IA CCGMC AS-IV
CAF
IFFI
ID IV CIVBP
名称中国农业微生物菌种保藏管理中心上海市农业科学院食用菌研究所中国医学科学院抗菌素研究所普通微生物菌种保藏管理中心中国科学院武汉病毒研究所中国林业科学院菌种保藏管理中心轻工业部食品发酵工业科学研究所中国医学科学院皮肤病研究所中国医学科学院病毒研究所中国兽医药品监察所
最常用的工业微生物
放线菌
– 链霉菌属 – 小单孢菌属 – 地中海诺卡氏菌 – 米苏里游动放线菌
藻类
藻类包括数种不同类以光合作用产生能量的生物。它们一般被认为是简单的植物，并且一些藻类与比较高等的植物有关。虽然其它藻类看似从蓝绿藻得到光合作用的能力，但是在演化上有独立的分支。所有藻类缺乏真的根、茎、叶和其它可在高等植物上发现的组织构造。藻类与细菌和原生动物不同之处，是藻类产生能量的方式为光合自营性；琼脂（棕藻）
国外重要菌种保藏机构
1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心 2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部 3、CSH：美国冷泉港研究所 4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所 5、IFO：日本发酵研究所（大阪） 6、NCTC：英国国立标准菌种收藏所 7、CBS：荷兰真菌中心保藏所
三、生产中常用菌种的分离、选育（screening ）
（一）微生物菌种的分离四步骤：样品采集增值培养纯种分离生产性能的测定
1.施加选择压力分离法
施加选择性压力分离法
主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势．而得以快速分离纯化的目的。如可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。

发酵工程(2)第二章工业微生物菌种的选育与扩大培养

淀粉酶活力极强，多作糖化酶使用；具有较强的蛋白质分解能力，可用于制造腐乳。
华根霉 ( Rhizopus chinentis )
酿酒所必须的重要霉菌，也是酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌种。
2、毛霉 ( Mucor )
鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
5、假丝酵母 (Candida)
➢能形成假丝，液体培养时能形成浮膜。 ➢可生产SCP、甘油、脂肪酶。
6、红酵母 (Rhodotorula)
➢有明显的红色或黄色色素，很多种因生荚膜而形成粘质状菌落。 ➢可由菌体提取大量脂肪、 -胡萝卜素。
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵棉子糖和蜜二糖。
3、汉逊酵母 (Hansenula)
此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香味，可用于酿酒和食品工业。
4、球拟酵母 (Toruiopsis)
此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。
复筛不纯第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛

发酵工程第二章发酵工业微生物菌种制备原理和技术讲解

的水生环境中生长
种类：分属于子囊菌纲、担子菌纲及半知菌类，目前已知的酵母菌有56属，大约500多种，与其他类群比，种类要少得多。
分布：酵母菌主要分布在含糖质较高的偏酸性环境，诸如果品、蔬菜、花蜜和植物叶子上，特别是葡萄园和果园的土壤中，因而称为糖菌（Sugar fungus）。
裂殖酵母
5. 担子菌——蘑菇（mushroom）
6. 藻类
许多国家已把藻类作为人类保健食品和饲料。螺旋藻
可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻类农场”获得氢能的报道。
三、工业微生物的来源
根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买从发酵制品中分离目的菌株自然界中分离筛选新的微生物菌种菌种选育：自然选育、人工诱变、原生质体融合、基因工程改造
第一节发酵工业常用的微生物菌种
我们的周围存在着多种多样的微生物，它们和我们的生活密切相关。
目前已知微生物约有10万种，分布在以下各界中：
原核生物界：例如细菌、蓝藻真菌界：例如酵母菌原生生物界：例如草履虫、变形虫病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒
发酵工业对菌种的要求
能在廉价培养基上迅速生长，目的代谢产物产量高培养条件易于控制生长速度和反应速度快，发酵周期短满足代谢控制的要求抗噬菌体和杂菌的能力强遗传性状稳定，菌种不易变异退化发酵过程产生泡沫少对前体物质有耐受能力，不作为碳源利用不是病原菌，不产生有害的生物活性物质
如何在后续的操作中使这种可能性实现？
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。
在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之微生物相适应。

发酵学第2章工业微生物菌种选育

4、从突变到突变型
表型迟延：表型的改变落后于基因型的改变分离型迟延 (基因杂合)
经诱变处理后，细胞中的基因处于不纯的状态，突变型基因由于属于隐性基因而暂时得不到表达，需经过复制、分离，在细胞中处于纯的状态时，其性状才得以表达。
生理性迟延
新的表型必须等到原有基因的产物稀释到某一程度后才能表现出来。
第一节概述第二节自然选育第三节诱变育种第四节杂交育种
第一节概述
一、工业微生物二、发酵工业对菌种的要求三、菌种选育的目的四、菌种选育的基本理论五、菌种来源
第一节概述
一、工业微生物 1.细菌
2.放线菌（单细胞原核微生物）
链霉菌属小单孢菌属地中海诺卡氏菌米苏里游动放线菌
(CGMCC)
中国微生物菌种保藏管理委员会 CCCCM——管理机构
订购程序
申请生物安全性说明确认订货
第二节自然选育
一、定义二、方法三、特点及应用
第二节自然选育
一、定义
自然选育：在生产过程中，不经过人工诱变处理，
根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程。
自发突变：就是指某些微生物在没有人工参与下
第三节诱变育种
三、诱变育种的主要环节
1.出发菌株的选择 2.诱变处理举例 3.筛选 4.突变菌株高产基因的表达
1.出发菌株的选择
选择纯种菌株（排除异核体）优良性状的菌株（产生孢子、生长速度）对诱变剂敏感的菌株同时选择几株不同的优良菌株
2.诱变处理
1）诱变剂的选择
2、菌种遗传特性的改变
1）异核现象--导致菌种这一微生物群体发生同
菌种遗传特性发生改变

第二章发酵工业微生物菌种制备原理和技术-PPT

筛选一些具有特殊性质得微生物时,需根据该微生物独特得生理特性到相应得地点采样(极端环境)。如:
高温酶产生菌:温度较高得南方,或温泉、火山爆发处及北方得堆肥中采集样品;
低温酶产生菌:寒冷得地方,如南北极地区、冰窖、深海中采样;
耐压菌:海洋底部采样。耐高渗透压酵母菌:通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处
菌种纯化就是指在特定环境中只让1种来自同一祖先得微生物群体生存得技术。
菌株分离、筛选虽为两个环节,但却不能绝然分开,因为分离中得一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌得筛选一般包括两大部分:一就是从自然界分离所需要得菌株,二就是把分离到得野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。
3、分离思路
从自然界筛选
B、采样季节:以温度适中,雨量不多得秋初为好。
C、采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5-15cm处得土约10g,盛入清洁得牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等, 以备查考。为了使土样中微生物得数量与类型尽少变化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离。
别出来。
抗生素筛选
6、生产性能得测定
由于纯种分离后,得到得菌株数量非常大,如果对每一菌株都作全面或精确得性能测定,工作量十分巨大, 而且就是不必要得。一般采用两步法,即初筛与复筛, 经过多次重复筛选,直到获得1～3株较好得菌株,供发酵条件得摸索与生产试验,进而作为育种得出发菌株。这种直接从自然界分离得到得菌株称为野生型菌株,以区别于用人工育种方法得到得变异菌株(亦称突变株)。
采样。如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖得耐高渗透压得酵母菌。
(3)含微生物样品得富集培养(优化得过程) ----施加选择性压力分离法

发酵原理第二章发酵工业菌

• 营养菌丝
生长于培养基内，生长于培养基内，具有吸收营养的功能
• 气生菌丝
（长在空气中）营养菌丝长到一定程度长长在空气中）出培养基
• 孢子丝（繁殖菌丝）孢子丝（繁殖菌丝）
气生菌丝发育到一定程度，气生菌丝发育到一定程度，上端分化成产生孢子的菌丝
酵母菌
形态结构
单细胞真核生物，单细胞真核生物，无鞭毛，无鞭毛，有一定形态大小，态大小，随菌龄和环境条件的变化而一般为圆形、异，一般为圆形、椭圆形、卵圆形、椭圆形、卵圆形、柠檬形等，柠檬形等，有的可形成假菌丝
方法的选择性和灵敏度注意
发酵工业对菌种的要求
• 在廉价原料制成培养基上生长，目在廉价原料制成培养基上生长，的产物产量高，的产物产量高，易回收 • 生长速度快，发酵期短生长速度快， • 培养条件易控制 • 抗噬菌体和杂菌污染能力强
• 稳定的遗传学特性：菌种质量稳定，不易稳定的遗传学特性：菌种质量稳定，变异退化 • 对放大设备的适应性强 • 菌种不是病原菌，无有害的生物活性物质菌种不是病原菌，和毒素产生
未培养微生物 • 概念
未培养微生物：采用现有的微生物纯培养分未培养微生物：离和培养方法还没有获得纯培养的微生物极端微生物：极端微生物：在极端环境下能够生长的微生物 • 研究方法模拟自然培养法和宏基因组分析法
模拟自然培养法模拟微生物生长的自然环境进行可培养研究。研究。集中在原位培养，原位培养，培养条件优化和单细胞操作等方面
从菌种保存机构直接购买
从自然界分离筛选发酵水平的批号中重新分离筛选
符合要求的菌种
采集样品样品处理富集培养菌种初筛菌种复筛性能鉴定菌种保藏

【发酵工艺学总论】第二章_工业发酵菌种

代表微生物类型革兰氏阳性球菌
高产培养基设计的几个原则

制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素；使用一聚合或复合形式的生长限制养分；避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物阻遏；确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；使用pH缓冲剂以减少pH变化；前体、促进剂及抑制剂的采用。

酶发酵生产常用的微生物
微生物
枯草芽孢杆菌大肠杆菌黑曲霉米曲霉青霉木霉根霉
生产的酶类
α -淀粉酶、蛋白酶、β -葡聚糖酶、碱性磷酸酶等谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等糖化酶、 α -淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、脂肪酶、纤维素酶等糖化酶和蛋白酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等葡萄糖氧化酶、果胶酶、纤维素酶、磷酸二酯酶、脂肪酶、凝乳酶、核酸酶等纤维素酶等糖化酶、 α -淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶等

样品的预处理

目的：提高分离效率方法：

物理方法：热处理（减菌）；膜过滤法（浓缩）；离心法（浓缩）化学方法：通过在培养基中添加某些化学成分来增加特
定微生物的数量。
几丁质——放线菌；CaCO3——嗜碱性放线菌

诱饵法
石蜡、花粉、蛇皮、毛发等
分离方法的选择

根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法菌种的营养特征独特选择性分离生长特征独特无选择性特征根据产物的特征进行随机分离

增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件培养方式分批培养方式：以最大比生长速率（μmax）筛选，存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选

发酵工程第二章发酵工业微生物菌种

李先磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发酵工程
Fermentation Engineering
（一）采样
1、采样对象以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。
新种分离与筛选的步骤
（五）毒性试验自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发酵工程
（三）培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂
李先磊
Fermentation Engineering
生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。
李先磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发酵工程
Fermentation Engineering
李先磊
（二）增殖培养为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。

2发酵工业菌种制备原理和技术(2)(精)

作为种子扩大培养的方法： ① 表面培养法 ② 固体培养法 ③液体培养法（三角瓶摇床震荡或转式培养）； ④载体培养法
24
固体培养法（曲法培养）

浅盘固体培养深层固体培养
25

优点：
（1）酶活力高。（2）生产过程中无菌程度要求不很严格。（3）对于固体发酵，由于产物浓度大，易于分离，可以有效的降低产品分离成本。
NICPB 卫生部药品生物制品监察所
IV
CIVBP
中国医学科学院病毒研究所
中国兽医药品监察所
CVCC
YM
兽医微生物菌种保藏管理中心
云南省微生物研究所
10
国外重要菌种保藏机构
1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心
2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部
3、CSH：美国冷泉港研究所
4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所
9
微生物菌种保藏机构名称和缩写
中国缩写 ACCC SH IA CCGMC AS-IV CAF IFFI ID 名称中国农业微生物菌种保藏管理中心上海市农业科学院食用菌研究所中国医学科学院抗菌素研究所普通微生物菌种保藏管理中心中国科学院武汉病毒研究所中国林业科学院菌种保藏管理中心轻工业部食品发酵工业科学研究所中国医学科学院皮肤病研究所缩写 ISF CACC SIA AS CFCC CICC CMCC 名称中国农业科学院土壤肥料研究所抗菌素菌种保藏管理中心四川抗菌素工业研究所中国科学院微生物研究所林业微生物菌种保藏管理中心工业微生物菌种保藏管理中心医学微生物菌种保藏管理中心
22
（5）接种量
移入种子的体积接种量＝ ————————— 接种后培养液的体积

第二章发酵工业微生物菌种ppt课件

2019
-
7
(1) 曲霉属(Asprgillus)：曲霉种类繁多、分布广泛，工业上利用曲霉生产各种酶制剂和有机 (2) 青霉属（Penicillium）：j既是使果实腐酸。如米曲霉（ Asp. oryzae）用于酿酒和L败和实物变坏的有害菌，又是青霉素后葡萄乳酸生产。制酱油用的酱油曲霉以及制造柠檬糖酸的产生菌。酸、草酸、葡萄糖酸和糖化酶、酸性蛋白酶、 (3) 根霉属（Rhizopus）：用于米酒、黄果胶酶、单宁酶等的黑曲霉 (Asp. niger)。酒生产。此外，广泛用作淀粉糖化菌、有机酸发酵以及甾体转化等许多方面。 (4) 毛霉属（Mucor）：产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力。腐乳、酱油、转化甾族化合物。土曲霉：衣康酸
11
连续培养菌种的筛选比生长速率(u):每克菌体每小时增长的菌体量.u=1/XdX/dt.
2019
-
12
比生长速率u
A B
r
2019 -
基质浓度
13
限制性基质
当进行流加时基质浓度<r 时,A菌先被洗出; 当进行流加时基质浓度>r 时,,B菌先被洗出;
培养液
固体培养法
2019 14
2.随机分离方法（1）.抗生素产生菌筛选试验菌的灵敏性，以及与抗生素有关的酶、酶的抑制剂（例如棒酸）、激活剂、抗体等建立起来的高灵敏度、专一的检测技术。（2）.药理活性化合物的筛选（3）.生长因子产生菌的筛选（4）.多糖生产菌的筛选（5）.免疫激活剂产生菌的分离
2019
-
3
(3) 乳酸菌：由糖类生成乳酸的一类细菌总称为乳酸菌，有乳链球菌和乳酸杆菌之分，主要用来制造乳制品。凡发酵产物中只有乳酸者，称为同型乳酸发酵；凡发酵产物中除乳酸外还有乙酸等和 CO2者，称为异型乳酸发酵。肠膜状明串珠菌属于乳酸菌族，是制药工业生产有旋糖酐的重要菌。 (4) 大肠杆菌：工业上利用大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶，进行谷氨酸定量分析。还可以利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸等。医药方面用它制造治疗白血症的天冬酰胺酶。另外，在研究细菌遗传变异方面，以及构建基因工程菌时，大肠杆菌是理想的研究材料。

2.发酵工业菌种

二 ①施加选择性压力
、发
压力的选择营养、环境条件
酵
工 ②随机分离法
业
菌种
抗生素产生菌的分离:如抑菌圈法、稀释法、
的分
扩散法、生物自显影法
离筛
酶抑制剂产生菌的分离体外
选抗病毒药物产生菌的分离噬菌斑
发酵工程 — 菌种
6.发酵性能测定
二、
对筛选出的菌种进行生产性能测定。这些特
发酵工
菌种
须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，
选育
且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其
常敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要
规当心。
育
种
发酵工程 — 菌种
诱变剂的选择
①碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但
三、
很少使用，回复突变率高，效果不大。
优良菌
②亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙
三前体或产品的耐受力。
、优
(4)抑制或消除产品分解酶。
良菌种
(5)改进菌种外泌产品的能力。 (6)消除代谢产品的反馈抑制。
选
育
发酵工程 — 菌种
具体来讲，有以下途径：
㈠提高特定基因的表达水平
三、
(1)引入强转录及翻译信号，可通过在一高效
优良菌
表达载体上克隆靶基因；在靶基因的上游引入强启动子；修改现有表达信号，提高基因
二、发酵工业菌种的分离筛选
二、
典型步骤：样品采集→样品预处理→目标菌富集→初筛→复筛→发酵性能测试→菌种鉴
发酵
定→菌种保藏
工
业菌

《发酵工程》02 工业发酵菌种选育

（2）增殖培养
➢目的：富集目的微生物，让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。
富集方法 1、养分 3、培养时间
2、pH条件 4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。
（３）纯种分离
•
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌植物或动物来源
问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。
例：礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
• 细菌（bacteria）：常用的有枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。
短杆菌：GA、Gln、lys…… 枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温α-淀粉酶) αAmylase 苏云金芽孢杆菌短：杆B菌T生物农药…棒…状杆菌梭状芽孢杆菌：丙酮、丁y酸ea等sts的发酵
啤棒酒状酵杆母菌
• 酵母菌（yeast）：属单细胞真核生物，主要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。
啤酒酵母：酿酒、辅酶类物质的发酵
酒香酵母：酿酒
汉逊酵母：酿酒，用于乙酸乙酯的发酵
假丝酵母：单细胞蛋白生产，石油发酵
霉菌
• 霉菌（mould）：喜偏酸性环境。可用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。
黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业、糖化酶黄曲霉：酱油生产，面酱青霉菌：青霉素的生产红曲霉：红曲制造，南方红曲酒（女儿红）；红色；豆腐乳赤霉菌：赤霉素的生产

【发酵工程】余龙江版-第2章-发酵工业菌种

在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白质等，同样可以促进水中微生物的增殖。
培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如
无菌的植物组织或土壤浸出液。通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、
中温菌和嗜高温菌。
次代培养及纯化步骤
1. 采样
(2) 采样对象
土壤、水、空气及枯枝落叶等，以土壤为主。
从土壤中采样要考虑土壤的以下特点：
① 有机质含量和通风状况
耕地、菜园山坡上的森林
（有机质丰富、通气保水性能好）——细菌、放线菌
（有机质丰富、阴暗潮湿）——霉菌、酵母菌
沙土、无植被土壤、新开垦的生土、贫瘠的土地
——微生物少
② 取样的土层深度：5-25cm
3. 富集培养
富集培养的策略
（2）控制培养条件
➢ 溶氧浓度——好氧/厌氧 ➢ 高温——嗜热微生物 /非嗜热微生物 ➢ PH——嗜酸性/嗜碱性
4. 菌种分离
平板划线分离法稀释分离法毛细管分离法小滴分离法
• 稀释倒平板法
稀释分离法
• 平板涂布法
注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。
1. 采样
③ 土壤的酸碱度
偏碱——细菌、放线菌偏酸——霉菌、酵母菌
④ 土壤的植被状况
葡萄成熟时——根部酵母菌增多
⑤ 地理条件
南方土壤比北方土壤微生物含量多
⑤ 季节条件
秋季菜土样最理想
2.样品的预处理
（1）物理方法
热处理：根据目的菌较非目的菌的耐热性高从而增加目的
菌的比例。
膜过滤法：浓缩水中的微生物细胞。离心法：同上。
植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂布平板。

发酵工业菌种选育自然选育

1、微生物选择性分离原理根据菌种的特性，通过控制营养和培养条件以有利于待分离菌株的生长和抑制非目的微生物的生长，或通过添加显色剂、指示剂以方便待分离菌株的挑选，还有根据目的微生物的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计选择培养基进行分离的方法。
利用平板的生化反应进行分离的方法
变色圈法
在底物平板上加人指示剂或显色剂，由于目的微生物分解底物或代谢产物引起平板上出现变色圈，使所需微生物能够被快速鉴别出来。
2. 工业发酵菌种的选育
2.2.1 自然选育
自然选育的概念
在生产过程中，不经过人工诱变处理，利用菌种的自发突变面进行菌种筛选的过程，称为自然选育或自然分离。
自然选育的步骤
1.采样
• 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。
• 纤维素酶产生菌选择枯枝落叶富含纤维素的森林土；
• 淀粉酶产生菌选择面粉厂、酒厂、糕点厂等场所的土壤；
• 蛋白酶和脂肪酶产生菌可选择肉类加工厂附近污泥等。
自然选育的步骤
从自然界筛选
自然选育的步骤
• 采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 • 采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表
土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。
自然选育的步骤目的微生物富集的一些基本方法
➢富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。 ➢富集的主要方案：定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养。控制营养和培养条件增加目的微生物数量，也可高温高压、加入抗生素等减少非目的微生物的数量长圈法

发酵工程 2 发酵工业菌种

2
思考题
发酵工业菌种
1、常见的工业微生物包括哪些类群？
2、作为工业生产菌株应具备哪些基本特性？ 3、了解发酵工业中的细菌、酵母菌、霉菌、放线菌及其生产的产品。 4、掌握菌种分离筛选的基本过程。
5、诱变育种及其原理。
6、常用的化学诱变剂。
7、菌种退化、原因与防治。
8、菌种保藏的方法。
广义的微生物：
5．其它担子菌：香菇、灵芝等。藻类：螺旋藻、单胞藻等。基因工程菌：基因工程菌在发酵工程已得到广泛应用，如酶制剂、胰岛素、干扰素、生长激素、乙型肝炎病苗等的生产。
二、工业生产对菌种的要求（1）能在廉价原料制成的培养基上生长，且生成的目的产物产量高、易于回收；（2）生长较快，发酵周期短；
挑出高产斜面
1、自然选育不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育（spontaneous
mutation）。
自然选育最为成功的例子是目前被广泛使
用的卡介苗(BCG vaccine)。法国的卡尔密脱
(Calmette)和介林(Guerin)把牛型的结核分枝杆菌接种在牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上，连续传代培养230代，前后经历13年时间，终于在1923年获得显著减毒的结核杆菌----卡介
能力和转化蔗糖的性能，还能产生脂肪酶。能发
酵产生乳酸、反丁烯二酸。
华根霉：华根霉多出现在我国酒药和酒曲中，具较强的耐高温性能（45℃能生长），淀粉酶液化力强，有溶胶性，能产生酒精、芳香脂类、乳酸及反丁烯二酸，能转化甾族化合物。
4）红曲霉属(Monascus) 菌丝呈红色以至紫色，
可由我国南方红曲中分离得到。
一个或少数几个核苷酸的插入或缺失，从而使该部

发酵工程与设备第二章、第二讲发酵工业菌种的分离筛选

透明圈法
在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊；能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌
土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在 pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生一透明圈。
若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈
6、随机分离方法
有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性好处，因此常随机地分离所需菌种，为此发展了一些快速筛选方法并归纳出高产培养基成分的选择准则如下：
1）制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素。
第三次平板分离
第三次原种斜面
复筛不纯第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
种子培养
1株3-5瓶较优菌株
保藏及进一步做生产性能试验或作为育种的出发菌株
某些必要试验和毒性试验
2、分离与筛选的设计要求
在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：
1、菌的营养特征 2、菌的生长温度
但作为初筛的手段是有意义的
变色圈法
对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；
如筛选果胶酶产生菌
用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。