2发酵工业菌种
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? 寻找新的发酵产品的产生菌； ? 寻找老产品的新的优良菌株。
? 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 经济性 指导性
设计筛选方案时必须考虑两个要点
?选择性 ?灵敏度
3. 新种分离与筛选的步骤
调查研究（包括资料查阅）
试验方案设计
含微生物样品的采集 （如何使样品中所含微 生物的可能性大？）
样品预处理 （如何在后续的操作中使这种可 能性实现）
第二章 发酵工业菌种
一、常用的工业微生物 二、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术 三、发酵工业菌种改良
最常用的工业微生物
? 细菌
? 醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌 ? 乳酸杆菌 ? 枯草杆菌 ? 丙酮丁醇梭菌 ? 大肠杆菌 ? 谷氨酸棒状杆菌
最常用的工业微生物
? 酵母菌
? 酿酒酵母 ? 假丝酵母属
? 产朊假丝酵母、解脂假丝酵母、热带假丝酵母
? 毕赤酵母属、汉逊酵母属
最常用的工业微生物
? 霉菌 ? 曲霉属 ? 米曲霉 ? 黑曲霉 ? 青霉属 ? 青霉菌：点青霉、产黄青霉 ? 桔青霉 ? 根霉属 ? 德氏根霉 ? 米根霉、小麦曲根霉 ? 红曲霉属 ? 紫红曲霉
最常用的工业微生物
? 放线菌
? 链霉菌属 ? 小单孢菌属 ? 地中海诺卡氏菌 ? 米苏里游动放线菌
? 连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选
A
μ
B
S0 基质浓度对A、B 两种菌的比生长速率（μ）的影响
当S<S0时，富集什么菌株？ 当S>S0时，富集什么菌株？
连续富集培养技术分离菌株的优点
? 分离的菌株特别适合连续发酵生产过程 ? 有利于分离具有某种工业生产特性的菌株 ? 可以筛选出能共生的稳定混合培养物
含微生物样品的采集
? 采样时应注意的问题: ? 土壤微生物的分布 ? 采土深度 ? 土壤植被情况 ? 采样季节 ? 土壤的酸碱度
? 对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准： ? 土壤来源广泛 ? 在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新 菌种
样品的预处理
? 目的：提高分离效率 ? 方法：
? 物理方法：热处理；膜过滤法；离心法 ? 化学方法 ? 诱饵法
分离方法的选择
? 根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法
? 菌种的营养特征独特 ? 生长特征独特
选择性分离
? 无选择性特征 根据产物的特征进行
随机分离
? 选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控 制，从而实现定向富集筛选。
选择性分离原理和技术
? 生长条件的选择与控制原理 ? 控制营养成分 ? 控制培养基酸碱度 ? 添加抑制剂 ? 控制培养温度 ? 控制通气条件
高产培养基设计的几个原则
? 制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素；
? 使用一聚合或复合形式的生长限制养分； ? 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物
阻遏； ? 确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn 2+,Fe2+）； ? 使用pH 缓冲剂以减少pH 变化； ? 前体、促进剂及抑制剂的采用。
菌种分离
根据目的菌株及其产物特点分
选择性分离方法
(定向筛选←选择压力)
随机分离方法
(用筛选方案- 检测系统进行间接分离）
富集液体培养 固体培养基条件培养 (初筛)
菌种纯化
复筛
菌种纯化
初步工艺条件摸索 再复筛 生产性能测试
较优菌株1-3株
保藏及进一步做生产试验 或作为育种的出发菌株
某些必要试验和 毒性试验等
1. 菌种选择的总趋势
? 野生菌→变异菌 ? 自然选育→代谢控制育种 ? 诱发基因突变→基因重组的定向育种
2. 菌种选择的要求
? 能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成 的目的产物产量高、易于回收；
? 生长速度和反应速度较快，发酵周期较短； ? 培养条件易于控制； ? 抗噬菌体及杂菌污染的能力强；
抗生素产生菌的筛选
? 筛选模型：试验菌 ? 筛选方法：
?固体培养筛选 铺菌法 复印平板法
? 液体培养筛选
wk.baidu.com
? 抗药性筛选
筛选模型：氨苄青霉素和β -内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同
I
II
无试样时（不含棒酸时）， I对II菌作用不大
? 选择性分离技术 ? 富集液体培养技术 施加选择压力，进行定向筛选 ? 固体培养技术
A.富集液体培养
? 增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 ? 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长
或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 ? 培养方式
? 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax ）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题
2. 菌种选择的要求（续）
? 菌种不易变异退化； ? 对放大设备的适应性强； ? 菌种不是病原菌，不产生任何有害的生
物活性物质和毒素。
（二）分离筛选原理与技术
1. 筛选的指导思想 2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面 3. 新种分离筛选原理与技术
1. 筛选的两种指导思想
? 先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。 ? 分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。
结果有两种可能：
?获得适于工业发酵菌株 ?只获得选育所需的出发菌株
2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面
? 从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； ? 生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ； ? 从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目
的的优良菌株 ； ? 从已知菌种和大自然中分离新菌株
未培养微生物
? 定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养 方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微 生物群落中占有非常高的比例，约为 99％。
? 研究方法 模拟自然培养法 : 原位培养、培养条件优化、单 细胞操作 宏基因组分析法
二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术
（一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 （二）分离筛选原理与技术 （三）应用举例
B. 固体培养技术
? 常用于分离某些酶产生菌 ? 选择压力：在选择培养基中加入所需酶
的基质
随机分离原理与技术
? 从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速 灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛 选出所需的目的菌。
? 技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应 筛选方法的确定。
? 随机分离技术举例 ? 抗生素产生菌的筛选 ? 药理活性化合物产生菌的筛选 ? 生长因子产生菌的筛选 ? 多糖产生菌的筛选
? 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 经济性 指导性
设计筛选方案时必须考虑两个要点
?选择性 ?灵敏度
3. 新种分离与筛选的步骤
调查研究（包括资料查阅）
试验方案设计
含微生物样品的采集 （如何使样品中所含微 生物的可能性大？）
样品预处理 （如何在后续的操作中使这种可 能性实现）
第二章 发酵工业菌种
一、常用的工业微生物 二、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术 三、发酵工业菌种改良
最常用的工业微生物
? 细菌
? 醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌 ? 乳酸杆菌 ? 枯草杆菌 ? 丙酮丁醇梭菌 ? 大肠杆菌 ? 谷氨酸棒状杆菌
最常用的工业微生物
? 酵母菌
? 酿酒酵母 ? 假丝酵母属
? 产朊假丝酵母、解脂假丝酵母、热带假丝酵母
? 毕赤酵母属、汉逊酵母属
最常用的工业微生物
? 霉菌 ? 曲霉属 ? 米曲霉 ? 黑曲霉 ? 青霉属 ? 青霉菌：点青霉、产黄青霉 ? 桔青霉 ? 根霉属 ? 德氏根霉 ? 米根霉、小麦曲根霉 ? 红曲霉属 ? 紫红曲霉
最常用的工业微生物
? 放线菌
? 链霉菌属 ? 小单孢菌属 ? 地中海诺卡氏菌 ? 米苏里游动放线菌
? 连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选
A
μ
B
S0 基质浓度对A、B 两种菌的比生长速率（μ）的影响
当S<S0时，富集什么菌株？ 当S>S0时，富集什么菌株？
连续富集培养技术分离菌株的优点
? 分离的菌株特别适合连续发酵生产过程 ? 有利于分离具有某种工业生产特性的菌株 ? 可以筛选出能共生的稳定混合培养物
含微生物样品的采集
? 采样时应注意的问题: ? 土壤微生物的分布 ? 采土深度 ? 土壤植被情况 ? 采样季节 ? 土壤的酸碱度
? 对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准： ? 土壤来源广泛 ? 在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新 菌种
样品的预处理
? 目的：提高分离效率 ? 方法：
? 物理方法：热处理；膜过滤法；离心法 ? 化学方法 ? 诱饵法
分离方法的选择
? 根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法
? 菌种的营养特征独特 ? 生长特征独特
选择性分离
? 无选择性特征 根据产物的特征进行
随机分离
? 选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控 制，从而实现定向富集筛选。
选择性分离原理和技术
? 生长条件的选择与控制原理 ? 控制营养成分 ? 控制培养基酸碱度 ? 添加抑制剂 ? 控制培养温度 ? 控制通气条件
高产培养基设计的几个原则
? 制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素；
? 使用一聚合或复合形式的生长限制养分； ? 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物
阻遏； ? 确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn 2+,Fe2+）； ? 使用pH 缓冲剂以减少pH 变化； ? 前体、促进剂及抑制剂的采用。
菌种分离
根据目的菌株及其产物特点分
选择性分离方法
(定向筛选←选择压力)
随机分离方法
(用筛选方案- 检测系统进行间接分离）
富集液体培养 固体培养基条件培养 (初筛)
菌种纯化
复筛
菌种纯化
初步工艺条件摸索 再复筛 生产性能测试
较优菌株1-3株
保藏及进一步做生产试验 或作为育种的出发菌株
某些必要试验和 毒性试验等
1. 菌种选择的总趋势
? 野生菌→变异菌 ? 自然选育→代谢控制育种 ? 诱发基因突变→基因重组的定向育种
2. 菌种选择的要求
? 能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成 的目的产物产量高、易于回收；
? 生长速度和反应速度较快，发酵周期较短； ? 培养条件易于控制； ? 抗噬菌体及杂菌污染的能力强；
抗生素产生菌的筛选
? 筛选模型：试验菌 ? 筛选方法：
?固体培养筛选 铺菌法 复印平板法
? 液体培养筛选
wk.baidu.com
? 抗药性筛选
筛选模型：氨苄青霉素和β -内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同
I
II
无试样时（不含棒酸时）， I对II菌作用不大
? 选择性分离技术 ? 富集液体培养技术 施加选择压力，进行定向筛选 ? 固体培养技术
A.富集液体培养
? 增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 ? 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长
或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 ? 培养方式
? 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax ）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题
2. 菌种选择的要求（续）
? 菌种不易变异退化； ? 对放大设备的适应性强； ? 菌种不是病原菌，不产生任何有害的生
物活性物质和毒素。
（二）分离筛选原理与技术
1. 筛选的指导思想 2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面 3. 新种分离筛选原理与技术
1. 筛选的两种指导思想
? 先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。 ? 分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。
结果有两种可能：
?获得适于工业发酵菌株 ?只获得选育所需的出发菌株
2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面
? 从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； ? 生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ； ? 从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目
的的优良菌株 ； ? 从已知菌种和大自然中分离新菌株
未培养微生物
? 定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养 方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微 生物群落中占有非常高的比例，约为 99％。
? 研究方法 模拟自然培养法 : 原位培养、培养条件优化、单 细胞操作 宏基因组分析法
二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术
（一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 （二）分离筛选原理与技术 （三）应用举例
B. 固体培养技术
? 常用于分离某些酶产生菌 ? 选择压力：在选择培养基中加入所需酶
的基质
随机分离原理与技术
? 从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速 灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛 选出所需的目的菌。
? 技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应 筛选方法的确定。
? 随机分离技术举例 ? 抗生素产生菌的筛选 ? 药理活性化合物产生菌的筛选 ? 生长因子产生菌的筛选 ? 多糖产生菌的筛选