InFusion克隆技术介绍
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In-Fusion专利酶
【结果】
In-Fusion 连接反应 50 ℃ 15 min
反应液 直接转化
20
8/16/2020
•
引物设计原则
引物的5’末端必须包含与载体末端相同的15个碱基序列 引物的3’末端必须包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列
21
8/16/2020
•
引物设计原则
22
8/16/2020
选择插入位点 PCR扩增
表达载体
目的DNA片段 纯化
混合
引物设计 PCR扩增
重组载体
In-Fusion克隆不受限制性内切酶酶切位点的限制: • 在cDNA序列中插入内含子,荧光蛋白基因 • 在cDNA序列添加UTRs • 转换纯化标签例如Myc 转换为His • 缺失蛋白表达区域…
13
8/16/2020
Q3.载体和插入的DNA片段的长度有限制吗？
A3.没有特别的限制。载体和插入的DNA片段即使超过10 kb也可以进 行连接反应，只是连接效率会有所降低。插入的DNA片段只要不少 于50 bp就可进行有效的连接反应。
Q4.线性化载体末端是否需要进行去磷酸化处理？
A4.线性化载体末端磷酸基团的存在与否不会影响In-Fusion连接效率。 因此，不需要对线性化载体进行去磷酸化处理。
8
8/16/2020
•
In-Fusion®克隆技术的优点
1 简便、快速、高效的克隆技术 2 不附加任何多余序列 3 不受限制性内切酶酶切位点的限制 4 可同时克隆两个或多个DNA片段
9
8/16/2020
•
简便、快速、高效的克隆技术
10
8/16/2020
•
简便、快速、高效的克隆技术
In-Fusion HD无论是克隆长基因片段还是克 隆多个基因片段都能保持较高的克隆效率。
In-Fusion不受限制性酶切位点的限制，因此在目的 片段及使用的载体中是否存在合适的酶切位点并不妨 碍克隆。
In-Fusion能够在一次反应中同时克隆多个片段，无 需进行亚克隆。
In-Fusion系统能够高效克隆0.05-15 kb DNA片段。
In-Fusion是基因定向克隆技术，因此无需进行目的 基因片段正确插入的克隆的筛选。
源自文库
27
8/16/2020
•
Cloning Enhancer的实用例
未经处理
Up to 5X Higher Efficiency
Cloning Enhancer处理
28
8/16/2020
•
主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答
【方法】使用TaKaRa高品质PCR酶分别扩增1 kb、2 kb、3 kb的目的DNA片段 和2.7 kb的载体，并将扩增产物混合，使用In-Fusion® HD试剂盒完成 克隆。利用高效率的感受态细胞StellarTM Competent Cells（产品编 号：636763）转化并进行蓝/白斑筛选。
25
8/16/2020
•
基础款相关产品
In-Fusion® HD Cloning Kit（ 639648/49/50)
组分
5X In-Fusion HD Enzyme Premix pUC19 Control Vector, linearized (50 ng / μl) 2 kb Control Insert (40 ng / μl)
30
8/16/2020
•
技术支持
：800-810-6261；010-80720985 / 86
：
service@takarabiomed.com. cn
： www.clontech.com
我们将竭诚为您服务！
31
8/16/2020
•
Thank You ！
3Q！！！！
32
8/16/2020
•
这是一款让您随心所欲地实现基因定向克隆的产品！
3
8/16/2020
•
In-Fusion®基因克隆特点
4
•
主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答
5
8/16/2020
•
主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答
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8/16/2020
•
In-Fusion Kit 常见问答
Q1.如何选择PCR酶？ A1.可以使用任何PCR酶。由于科研人员进行克隆表达的实验较多，我
们推荐使用高保真的PCR酶。
Q2.载体和插入的DNA片段末端结构有限制吗？ A2.没有特别的限制。无论是平滑末端、粘性末端或者末端有无A尾均可
进行有效的连接反应。
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8/16/2020
•
附带Cloning Enhancer的相关产品
In-Fusion® HD Cloning Kit w/ Cloning Enhancer (639633/34/35)
Cloning Enhancer的作用：
消除PCR反应液中的引物二聚体和dNTP等的影响 无需对PCR产物进行胶纯化 操作简单
In-Fusion是无缝克隆：不附加任何多余碱基序列。 In-Fusion技术已经成功用于多项高通量克隆工程。
15
8/16/2020
•
In-Fusion®克隆技术的应用
多片段克隆 插入突变位点
构建载体模型 高通量克隆
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8/16/2020
•
应用实例
实例：多个DNA片段（1 kb, 2 kb, 3 kb)同时克隆
6
8/16/2020
•
In-Fusion®基因克隆技术原理示意图
50 ℃，15 min单管反应
In-Fusion专利酶
In-Fusion是一种快速、简单、高效的基因克隆技术！
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•
主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答
•
引物设计网络工具
在线支持工具
http://bioinfo.clontech.com/infusion
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8/16/2020
•
主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答
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•
产品列表
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•
引物设计及目的基因片段扩增
引物的5’末端必须包含与载体末端相同的15个碱基序列 引物的3’末端必须包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列
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•
载体线性化
PCR扩增
酶切处理
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•
In-Fusion连接反应
线性化载体
目的基因片段
Cloning Enhancer处理，37 ℃ 15 min， 80 ℃ 15 min
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•
不附加任何多余序列
A 克隆位点
C
任意载体
线性化载体
B 目的DNA片段
不需要的碱基序列
PCR扩增
引物设计
与载体相同的 15 个碱基 序列
不附加任何多余序列 的重组载体
In-Fusion 连接反应15 min
无缝克隆： 不附加任何多余序列
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•
不受限制性内切酶酶切位点的限制
•
可同时克隆两个或多个DNA片段
Step 1: 制备线性化载体
片段1 片段2片段3
线性化载体
Step 2: 目的DNA片段扩增 重组载体 Step 3: 一次In-Fusion连接反应
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•
克服传统克隆技术的限制
克服其它克隆技术的限制
其它克隆技术的限制
•载体的限制 •不同克隆试剂盒都需要与之匹配的载体 •必须使用提供的载体
•必须进行限制性内切酶酶切和连接 •需要独一无二、兼容的酶切位点 •极少的合适酶切位点
•亚克隆繁琐 •多片段不能同时克隆
•对于大片段克隆效率较低 •对于插入片段有限制
•非定向克隆需要筛选目的片段插入方向 正确的克隆
•会附加多余碱基序列
•不适合中型和大规模克隆工程
In-Fusion解决方案
只要载体末端和插入片段末端具有15个同源碱基， In-Fusion就可以将任意PCR片段插入任意线性化载 体中。
In-Fusion
克隆技术介绍
• 宝日医生物技术（北京）有 限公司
8/16/2020
•
基因克隆背景简介
TA克隆 限制性酶切克隆
平滑末端克隆
缺点：连接效率低 耗时较长 需要特定限制性酶切位点
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8/16/2020
•
In-Fusion克隆产品
In-Fusion® HD Cloning System
任意载体 任意基因片段
【结果】
In-Fusion 连接反应 50 ℃ 15 min
反应液 直接转化
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引物设计原则
引物的5’末端必须包含与载体末端相同的15个碱基序列 引物的3’末端必须包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列
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引物设计原则
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8/16/2020
选择插入位点 PCR扩增
表达载体
目的DNA片段 纯化
混合
引物设计 PCR扩增
重组载体
In-Fusion克隆不受限制性内切酶酶切位点的限制: • 在cDNA序列中插入内含子,荧光蛋白基因 • 在cDNA序列添加UTRs • 转换纯化标签例如Myc 转换为His • 缺失蛋白表达区域…
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Q3.载体和插入的DNA片段的长度有限制吗？
A3.没有特别的限制。载体和插入的DNA片段即使超过10 kb也可以进 行连接反应，只是连接效率会有所降低。插入的DNA片段只要不少 于50 bp就可进行有效的连接反应。
Q4.线性化载体末端是否需要进行去磷酸化处理？
A4.线性化载体末端磷酸基团的存在与否不会影响In-Fusion连接效率。 因此，不需要对线性化载体进行去磷酸化处理。
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In-Fusion®克隆技术的优点
1 简便、快速、高效的克隆技术 2 不附加任何多余序列 3 不受限制性内切酶酶切位点的限制 4 可同时克隆两个或多个DNA片段
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简便、快速、高效的克隆技术
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简便、快速、高效的克隆技术
In-Fusion HD无论是克隆长基因片段还是克 隆多个基因片段都能保持较高的克隆效率。
In-Fusion不受限制性酶切位点的限制，因此在目的 片段及使用的载体中是否存在合适的酶切位点并不妨 碍克隆。
In-Fusion能够在一次反应中同时克隆多个片段，无 需进行亚克隆。
In-Fusion系统能够高效克隆0.05-15 kb DNA片段。
In-Fusion是基因定向克隆技术，因此无需进行目的 基因片段正确插入的克隆的筛选。
源自文库
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Cloning Enhancer的实用例
未经处理
Up to 5X Higher Efficiency
Cloning Enhancer处理
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8/16/2020
•
主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答
【方法】使用TaKaRa高品质PCR酶分别扩增1 kb、2 kb、3 kb的目的DNA片段 和2.7 kb的载体，并将扩增产物混合，使用In-Fusion® HD试剂盒完成 克隆。利用高效率的感受态细胞StellarTM Competent Cells（产品编 号：636763）转化并进行蓝/白斑筛选。
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基础款相关产品
In-Fusion® HD Cloning Kit（ 639648/49/50)
组分
5X In-Fusion HD Enzyme Premix pUC19 Control Vector, linearized (50 ng / μl) 2 kb Control Insert (40 ng / μl)
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8/16/2020
•
技术支持
：800-810-6261；010-80720985 / 86
：
service@takarabiomed.com. cn
： www.clontech.com
我们将竭诚为您服务！
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Thank You ！
3Q！！！！
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这是一款让您随心所欲地实现基因定向克隆的产品！
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In-Fusion®基因克隆特点
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主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答
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主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答
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In-Fusion Kit 常见问答
Q1.如何选择PCR酶？ A1.可以使用任何PCR酶。由于科研人员进行克隆表达的实验较多，我
们推荐使用高保真的PCR酶。
Q2.载体和插入的DNA片段末端结构有限制吗？ A2.没有特别的限制。无论是平滑末端、粘性末端或者末端有无A尾均可
进行有效的连接反应。
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附带Cloning Enhancer的相关产品
In-Fusion® HD Cloning Kit w/ Cloning Enhancer (639633/34/35)
Cloning Enhancer的作用：
消除PCR反应液中的引物二聚体和dNTP等的影响 无需对PCR产物进行胶纯化 操作简单
In-Fusion是无缝克隆：不附加任何多余碱基序列。 In-Fusion技术已经成功用于多项高通量克隆工程。
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In-Fusion®克隆技术的应用
多片段克隆 插入突变位点
构建载体模型 高通量克隆
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应用实例
实例：多个DNA片段（1 kb, 2 kb, 3 kb)同时克隆
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In-Fusion®基因克隆技术原理示意图
50 ℃，15 min单管反应
In-Fusion专利酶
In-Fusion是一种快速、简单、高效的基因克隆技术！
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主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答
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引物设计网络工具
在线支持工具
http://bioinfo.clontech.com/infusion
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主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答
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产品列表
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引物设计及目的基因片段扩增
引物的5’末端必须包含与载体末端相同的15个碱基序列 引物的3’末端必须包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列
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载体线性化
PCR扩增
酶切处理
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In-Fusion连接反应
线性化载体
目的基因片段
Cloning Enhancer处理，37 ℃ 15 min， 80 ℃ 15 min
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不附加任何多余序列
A 克隆位点
C
任意载体
线性化载体
B 目的DNA片段
不需要的碱基序列
PCR扩增
引物设计
与载体相同的 15 个碱基 序列
不附加任何多余序列 的重组载体
In-Fusion 连接反应15 min
无缝克隆： 不附加任何多余序列
12
8/16/2020
•
不受限制性内切酶酶切位点的限制
•
可同时克隆两个或多个DNA片段
Step 1: 制备线性化载体
片段1 片段2片段3
线性化载体
Step 2: 目的DNA片段扩增 重组载体 Step 3: 一次In-Fusion连接反应
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克服传统克隆技术的限制
克服其它克隆技术的限制
其它克隆技术的限制
•载体的限制 •不同克隆试剂盒都需要与之匹配的载体 •必须使用提供的载体
•必须进行限制性内切酶酶切和连接 •需要独一无二、兼容的酶切位点 •极少的合适酶切位点
•亚克隆繁琐 •多片段不能同时克隆
•对于大片段克隆效率较低 •对于插入片段有限制
•非定向克隆需要筛选目的片段插入方向 正确的克隆
•会附加多余碱基序列
•不适合中型和大规模克隆工程
In-Fusion解决方案
只要载体末端和插入片段末端具有15个同源碱基， In-Fusion就可以将任意PCR片段插入任意线性化载 体中。
In-Fusion
克隆技术介绍
• 宝日医生物技术（北京）有 限公司
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基因克隆背景简介
TA克隆 限制性酶切克隆
平滑末端克隆
缺点：连接效率低 耗时较长 需要特定限制性酶切位点
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In-Fusion克隆产品
In-Fusion® HD Cloning System
任意载体 任意基因片段