InFusion克隆技术介绍

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无缝克隆说明书+原理+实例

HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒使用说明（基于Gibson Assembly 原理，原理附后）一、产品简介HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA 定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。

HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR 引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25 bp 同源序列（图1，图3）。

将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR 片段按合适比例混合，并加入HB-infusion TM Master mix，通过反应体系中DNA 外切酶、DNA 聚合酶以及连接酶的在50℃反应20 min 即可快速完成定向克隆，阳性率几近100%。

图1. HB-infusion TM 快速克隆试剂盒原理示意图。

1. 线性化目的载体（左上）；2. PCR 获取目的片段。

设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25 bp 的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图3）；3. 按照一定比例把二者混合在HB-infusion TM 的2预混液内，50 C 反应20 min 后直接转化E.coli 即可。

二、HB-infusionTM 试剂盒的优点1. 相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusion TM 试剂盒更高效，操作更简单，只需要一次反应即可完成定向克隆；2. 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；3. 连接片段之间不会引入任何其他序列；4. 可以同时克隆多个片段。

三、产品包装产品组成使用次数体积2 x HB-infusion TM Master mix 20 tests 200 lPositive linearized pUC vector （250 ng） 5 tests 25 lPositive control insert (500 ng) 5 tests 25 l储存条件-20 ℃四、使用说明汉恒生物建议2-3 个片段连接时，DNA 片段的使用总量为0.02~0.5 pmols，4~6 片段连接时加入的DNA 总量为0.2~1.0 pmols。

大连In-Fusion Cloning

In-Fusion反应液是不会将其环化的，除非载体末端带有相同的15 nt同源性碱基。
建立In-Fusion应体系
3.线性化载体的纯化必须胶回收，低电压运行，确保线性分子和环状分子载体彻底分离。
转化感受态细胞插入片段确认
反向PCR扩增
1.当找不到合适的酶切位点，可以采用反向PCR的方法。 2.同时这也是一种突变的方法（缺失，插入，点突变）。 3.引物设计时，15 nt悬挂的同源碱基可以来源于插入片段。 4.为了保证载体骨架完整性，推荐使用高保真酶，如CloneAmp HiFi PCR Premix（639298）。
7
Q2：引物合成的纯化方式和修饰要求？ A2：脱盐处理即可，较长引物可以PAGE纯化。 3’-OH，而5’无需磷酸化处理。
Q4：引物除了15 bp的同源序列和目的基因的特异性序列，还可以包含其它的序列？
A4：可以，在15 bp同源序列之后引入其它适当序列，用于酶切位点构建、读码框的完整性和融合标签。15 bp+其它序列+GSP序列。
规格
10 rxns 50 rxns 100rxns 10 rxns 50 rxns 100rxns
Cloning Enhancer
Nucleo -Spin
Stellar Competent Cells
CloneAMP HiFiPCR Premix
Lyophilized
√ √ √ √ √ √ √ √ √ √
推荐5:1或者10:1；插入片段50-100 bp时，推荐10:1或者 50:1。
A5：50 bp-15 kb，8-15 kb的克隆效率可能会下降。
Q7：PCR产物如何纯化？
A7：如果PCR产物电泳检测显示单一条带，可以采用Cloning Enhancer（639613）处理；小于350 bp的PCR产物，建议采用Cloning Enhancer（639613）处理；如果PCR产物含有非特异性背景，请采用切胶方式分离目的片段回收纯化，推荐NucleoSpin Gel and PCR Clean-up（740609）。

克隆技术的研究与应用

克隆技术的研究与应用近年来，克隆技术作为一种前沿科技，不断引起了人们的关注，同时也在生物学、医学、农业等领域发挥着重要作用。

克隆技术的研究与应用，不仅推动了生命科学的发展，也对社会的进步带来巨大的贡献。

一、克隆技术的定义与原理克隆技术，是指利用人工手段将某一个个体的基因或一组基因复制出来，并转移到另一个宿主细胞中，在宿主细胞中进行复制和生长，从而获得一系列与原基因相同或相似的新个体。

克隆技术的原理主要是利用细胞分裂的能力和基因工程技术，通过对细胞核和DNA进行操作，实现对个体遗传信息的复制和改变。

二、克隆技术在生物学研究中的应用1、基因克隆基因克隆是通过克隆方法得到与原基因相同或相似的基因序列，并进行分析和研究。

基因克隆技术可以用来制备基因库，对基因的结构和功能进行研究，并且可用于制备各种重要蛋白质。

2、细胞克隆细胞克隆是指利用克隆方法获得一组相同或相似的细胞群体，以便进行相关实验和研究。

细胞克隆技术在细胞学研究中发挥着重要作用，为细胞学的进一步研究提供了理论基础和实验手段。

三、克隆技术在医学领域的应用1、组织和器官移植组织和器官移植是利用克隆技术实现的一种医学手段，在多种疾病治疗中发挥着重要作用。

克隆技术可以用于制备人工器官替代病患自身的受损和失效的组织器官，从而恢复其正常功能。

2、药物研发克隆技术可以用于药物研发中，例如以克隆技术获得人体生长激素基因，并进行基因重组，得到大量的生长激素，用于药物制备。

克隆技术可以利用重组技术进行药物靶标的发现和验证，从而为药物研发提供重要的基础研究手段。

四、克隆技术在农业领域的应用1、动植物育种克隆技术可以用于动植物的优良品种育种，在动物育种中，克隆技术可以解决种畜生繁殖率低、死亡率高等问题，从而大幅度提高其繁殖效率和生产水平；在植物育种中，利用克隆技术获得的干细胞可实现对优良品种的无性繁殖，极大地提高了良种的繁殖效率。

2、基因转移克隆技术可以利用基因工程技术，将优良基因或抗病基因移植到其他品种或物种中，从而实现物种间基因的跨越转移和融合，为农业生产提供了重要的技术支撑。

基因克隆实验手册

插入片段线性化载体
推荐使用的试剂盒
产品信息
DNA Ligation Kit <Mighty Mix> P4
Blunting Kination Ligation (BKL) Kit
P6
TaKaRa DNA Ligation Kit LONG P4
Mighty TA-cloning Kit
P6
Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR®
↓ ③42℃反应45秒后，在冰中放置1～2分钟
↓ ④加入已预先37℃保温的SOC培养基，使终体积为1 ml。
↓ ⑤37℃振荡培养1小时（160～225 rpm）
↓ ⑥取适量涂布于LB选择培养基、37℃过夜静置培养
5. PCR扩增确认插入片段DNA 6. 培养、纯化质粒
PCR扩增确认插入片段DNA请参考第5页
TCGA 5’ Hin d Ⅲ
线性化载体 ※
C TAG A G C T
※ 利用限制性内切酶酶将环状载体DNA切断后，切胶回收、或必要时进行去磷酸化反应
转化
·感受态细胞
形成菌落
进行菌落PCR 确认插入片段
·EmeraldAmp® MAX PCR Master Mix等
·电泳相关制品
— 1—
基因克隆实验手册
※ PCR扩增产物是平滑末端时进行dA加尾反应。
【目的DNA片段】带有限制性内切酶的
酶切末端
In-Fusion克隆
5×In-Fusion® HD In-Fusion酶使 Enzyme Premix 末端15个相同
碱基无缝融合
TA克隆
3’ A
A 3’
T载体

infusion克隆原理

infusion克隆原理
Infusion克隆是一种提取特定的基因的过程，它能够让研究人员和其他从事科学研究的人员获得特定细胞识别等基因信息，以用于做
为他们实验或研究。

基因克隆技术通过提取一系列核酸（DNA）和蛋白
质（RNA），以建立某种特定细胞的克隆，以及特定酶的催化。

研究人员在进行Infusion克隆的实验的时候，需要确定提取的
基因的类型，以及确立表达这些基因所需要的诱因。

受克隆的基因被
提取到试管中，使用特定的催化酶。

当所需的蛋白质在细胞中被发现，基因信息将被提取出来，以供下一步实验。

Infusion克隆可以用于从细胞提取DNA，以及提取特定类型细胞
以外物质，例如乳腺母细胞。

同时，研究者也可以将这种克隆技术用
于更进一步的深入的研究和实验，例如分离具有特定遗传序列的基因，作为芯片。

此外，Infusion克隆也为研究人员提供了一个更加容易的方式来分享和传播与特定目标有关的基因研究信息。

总而言之，Infusion克隆技术通过提取一系列基因信息，为研究人员提供了一种工具，作为进行下一步实验，深入研究和分享基因信
息的可靠途径。

此外，流入克隆还可以提供更直观的测定细胞状态的
方法，以及能够将基因提取并传播的一种可靠的方式。

克隆技术的原理及过程

克隆技术的原理及过程
克隆技术是指利用生物学手段产生一种与原始个体基因完全一
致的后代。

克隆技术的原理是利用细胞分裂的能力和基因复制的原理，将一个成熟细胞的基因组复制到一个无性生殖的胚胎中，从而产生一个与原个体基因完全一致的后代。

克隆技术的过程可以分为以下几个步骤：
1.采集供体细胞：从一个生物体中采集一个成熟细胞，通常使用皮肤细胞或血细胞作为供体细胞。

2.细胞核移植：将供体细胞的细胞核移植到一个去核的卵细胞中。

这可以通过使用一个微针将细胞核插入卵细胞内来完成。

3.激活卵细胞：使用化学物质或电脉冲激活卵细胞，使其开始分裂。

4.移植胚胎：将发育良好的克隆胚胎移植到一个代孕母体中。

5.孕育后代：如果胚胎发育成功并且嵌入代孕母体，它将组成一个克隆胎儿并最终出生为克隆后代。

克隆技术具有广泛的应用前景，包括用于动物繁殖、药物开发、疾病治疗和农业生产等领域。

但是，由于克隆技术的伦理和道德问题，以及技术上的一些挑战，它仍然是一个备受争议和受限制的领域。

- 1 -。

4重组表达质粒的构建——基因的克隆

重组表达质粒的构建——基因的克隆长片段基因在大肠杆菌中表达往往比较困难，作为抗原使用的重组蛋白可以考虑选择抗原性好的区段原核表达，前文已作阐述。

对整个蛋白结构研究，必须全长表达该蛋白，此时最好考虑真核表达系统，特别是含有跨膜区的蛋白。

选定要克隆的区段，需先富集纯化之后才方便插入载体，常用的富集方法是PCR或者质粒繁殖复制。

为了防止在PCR扩增过程中引入碱基错误或者碱基缺失，PCR扩增基因时候必须使用高保真Taq酶。

为了满足科研工作者不同实验需求，福因德生物将高保真Taq酶优化为即用型Mix，使用时直接加引物和模板就可以扩增。

除此之外，福因德生物还开发出LA Taq、S-Taq Mix以及SYBR荧光定量PCR Mix(需要更高品质的可选用SYBR PCR SuperMix)。

原核重组表达常用克隆技术主要有以下几种：1）酶切连接这个是目前应用最为广泛的的克隆技术，主要优点是技术稳定；缺点是周期长、步骤多，任何一个环节产生的误差都会影响克隆构建的成败。

如用酶切连接的策略进行载体批量构建，不同载体和不同外源基因尽可能选用相同的上下游酶切位点，比如，批量克隆基因到某个载体上，可一次性大量双酶切将载体线性化后保存备用，每次构建载体只需酶切外源基因片段，载体可直接取用，不必每次都酶切，省时省力（此处需特别留意的是基因内部不能有与上述所用冲突的酶切位点）。

2）TA克隆TA克隆必须使用商业的线性化载体，线性载体3´末端有一个T碱基，与PCR扩增产物3´末端A正好匹配。

这种克隆策略最大的优点是载体使用方便，扩增产物可以直接克隆到载体上，不需要酶切位点等冗余序列；缺点是：必须依赖商业化载体，载体选择受限；扩增外源片段所使用的Taq酶也必须是可以在3´末端加A，这种Taq酶的保真度不高；外源片段插入之后还必须鉴定方向。

目前，这种构建表达载体的策略已经逐渐被淘汰。

3）TOPO克隆TOPO克隆载体利用DNA拓扑异构酶I识别序列中的CCCTT松弛双螺旋并重新连接，同时兼具限制性内切酶和连接酶的功能。

利用In-Fusion技术构建存活素-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体

利用In-Fusion技术构建存活素-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体【摘要】目的：本研究以构建存活素增强型绿色荧光蛋白(survivin ＆efp)融合基因慢病毒表达载体（pcfusurvivin）为例来探讨infusion克隆技术在常规载体构建中的应用价值。

方法：根据infusion技术原理，克隆引物设计时，在survivin 同源序列的两侧分别引入经ae i线性化的载体pcfu两端各15个碱基，将以此引物扩增的聚合酶链式反应（pcr）产物与线性化pcfu用infusion交换酶在室温下作用30min，使survivin特异性扩增产物两端的序列与线性化载体两端的序列发生同源交换，取2μl交换液进行转化，挑取阳性克隆，进行酶切和测序鉴定。

将鉴定正确的阳性克隆瞬时转染293t 细胞，观察survivin ＆efp融合蛋白在293t细胞中的表达。

结果：每2μl克隆交换液获得大约103个克隆数，阳性率达90%以上，瞬时转染pcfusurvivin可获得survivin ＆efp融合蛋白在293t细胞中的表达。

结论：该技术是一种非连接酶依赖性克隆技术，使基因克隆步骤简化并大大节省了实验时间和经费。

关键词】基因；克隆细胞；基因，病毒value of infusion clonin techhique on routine vector construction lin chao ui fan lin chen lian londepartment of cardioloy，union hospital，fujianmedical university，fuzhou，fujian，350001，abstract：objective:to introduce a simple method for the clonin of pcr products.methods:the infusion clonin technique was described by constructin a rebinant lentivirus vector (pcfu) with survivin ＆efp fusion ene as a sample.the survivin cdna was amplified with survivin ene specific primers with 15 bp extensions homoloous to the pcfu ends.by the action of the infusion enzyme at room temperature for 30 minutes，the sinlestranded pcr frament and vector ends were fused due to the 15 bp homoloy.finally，clones derived from transformation were chosen randomly and identified.results:about 103 positive clones for inserts were obtained after transformation with 2 μl of exchanin products，and the ratio of the positive colonies was more than 90%.after 24 h the pcfusurvivin was transfected into 293t eukaryotic cells，the expression of the survivin ＆efp fusion ene can be confirmed with fluorescence microscope.conclusion:the liation independent property makes the infusion pcr clonin technique rapid，reliable and hiher costeffective，avoidin the need for multiple sub clonin steps.key words：enes;clone cells;enes,viral传统的聚合酶链式反应（pcr）产物克隆技术包括补平末端克隆、ta克隆以及连接酶依赖性克隆等。

克隆技术的原理及其应用

克隆技术的原理及其应用克隆技术是指通过人工手段复制一个与原始个体基因完全相同的新个体的一种技术。

它的原理主要是通过将一种生物的细胞或核移植到另一个细胞或胚胎中，然后通过合适的培养环境使其发育成为一个新个体。

1.农业领域：克隆技术可以应用于提高农作物和畜牧业的品质。

通过克隆技术可以复制出高产、高质、抗病的优良品种，提高农产品的产量和质量。

2.医学领域：克隆技术可以用于医学研究和药物开发。

通过克隆技术可以获得更多的实验样本，加快疾病的研究进程，并为新药的研发提供更多的样本。

3.动物保护：克隆技术可以应用于濒危物种的保护和繁育。

通过克隆技术可以复制濒危物种的个体，增加其数量，提高其存活率，从而保护和恢复物种数量。

4.人体器官移植：克隆技术还可以应用于人体器官的移植。

通过克隆技术可以复制出患者自身的器官，避免器官排斥反应，解决器官移植的问题。

尽管克隆技术有着广泛的应用前景，但是它也存在一些伦理、道德和法律方面的问题。

首先，克隆技术可能引发伦理和道德问题。

例如，克隆人类个体可能导致一系列的道德、社会和心理问题，如个人自由、身份认同、隐私等。

其次，克隆技术可能引发法律问题。

一些国家和地区已经颁布了禁止克隆人类的法律，而一些国家则允许在一定条件下进行克隆研究。

另外，克隆技术的应用还面临着技术方面的挑战和难题。

例如，克隆细胞的获取和处理、克隆胚胎的分离和培养以及克隆个体的正常发育等问题需要进一步研究和解决。

总的来说，克隆技术的原理是通过复制生物的细胞或核，培养成为一个新的个体。

它在农业、医学、动物保护和人体器官移植等领域有广泛的应用前景。

然而，克隆技术也面临着伦理、道德和法律等方面的问题，需要社会、科学家和决策者共同努力解决。

克隆技术的原理与应用

克隆技术的原理与应用原理介绍克隆技术是一种基因工程技术，通过复制和粘贴DNA片段来制造相同基因组的个体。

其原理主要包括以下几个步骤：1.DNA提取：从原始细胞中提取DNA，通常使用离心技术将细胞分离并采集DNA。

2.DNA切割：将提取的DNA通过限制酶切割成特定长度的片段，限制酶是一种酶类，具有特异性切割作用。

3.载体制备：选择一个合适的载体，如质粒或病毒，将切割好的DNA片段插入载体中。

4.载体转化：将含有插入DNA片段的载体转化到宿主细胞中，使其成为克隆体，宿主细胞会复制并表达这些外源DNA片段。

5.选择和筛选：利用选择性培养基或标记基因等方法筛选出具有目标基因的克隆体。

应用领域克隆技术在生物医学、农业和工业领域有着广泛的应用。

下面分别介绍其在这些领域的具体应用：生物医学1.基因治疗：克隆技术可以用于将正常的基因导入到患者体内，以治疗某些遗传病或疾病。

2.药物研发：利用克隆技术可以大规模生产具有特定结构和功能的蛋白质，用于药物开发和生产。

3.疫苗研发：克隆技术可以用于制备和生产疫苗，提高疫苗生产效率。

农业1.转基因作物：克隆技术可以将抗病虫害基因导入到作物中，提高作物的产量和抗病能力。

2.物种保护：克隆技术可以用于保护濒危物种，通过克隆繁殖来增加种群数量。

3.高产畜禽：克隆技术可以用于提高畜禽的繁殖效率和品质，提高农业生产效益。

工业1.生物制药：克隆技术可以用于生产各种重要的生物制药品，如胰岛素、乳酸和抗体等。

2.酶工程：通过克隆技术可以改造和优化微生物的代谢途径，生产具有特定功能的酶。

3.生物能源：克隆技术可以用于改造和优化微生物的代谢途径，提高生物质转化为生物能源的效率。

发展趋势克隆技术在近年来取得了快速的发展，不断有新的方法和技术出现。

未来克隆技术的发展趋势主要包括以下几个方面：1.高通量克隆：通过自动化和高通量技术，实现大规模的克隆实验，提高克隆效率和准确性。

2.精准基因编辑：利用CRISPR/Cas9等新技术，可以实现对基因组的精确编辑，开辟了新的克隆应用领域。

什么是克隆技术

什么是克隆技术克隆技术是一种利用生物技术手段复制生物体的过程。

它可以通过不同的方法实现对生物体的复制，包括植物、动物和微生物等各类生物体。

克隆技术的发展给科学研究和应用带来了重大的突破和影响。

下面将对克隆技术的定义、分类、原理和应用等进行详细介绍。

一、克隆技术的定义克隆技术是指通过人为手段，利用生物体的细胞、组织或基因等，复制出与原始生物体具有相同或相似遗传信息的新个体的过程。

克隆技术可以分为两种类型：一是重组克隆，即通过基因工程技术将目标基因导入宿主细胞中，使其表达出目标蛋白；二是整体克隆，即通过核移植或胚胎分裂等方式复制整个生物体。

二、克隆技术的分类根据克隆技术的方法和对象的不同，可以将克隆技术分为以下几类：1. 分子克隆技术：通过DNA重组技术将目标基因导入宿主细胞中，实现对基因的复制和表达。

这种克隆技术被广泛应用于基因工程、药物研发和农业改良等领域，如重组DNA技术、基因克隆和表达等。

2. 细胞克隆技术：通过细胞核移植，将一个细胞的细胞核移植到另一个无细胞核的受体细胞中，使其发育成一个与原始细胞相同或相似的新个体。

这种克隆技术被广泛应用于动物繁殖、干细胞研究和医学治疗等领域，如体细胞核移植、胚胎分裂和体外受精等。

3. 植物克隆技术：通过植物组织培养和植物器官再生等技术手段，将植物的细胞或组织培养并分化成一个与原始植物相同或相似的新个体。

这种克隆技术被广泛应用于植物繁殖、农业生产和园艺育种等领域，如离体培养、植物再生和遗传转化等。

4. 微生物克隆技术：通过微生物的分裂、发酵和复制等过程，复制出与原始微生物具有相同或相似遗传信息的新微生物体。

这种克隆技术被广泛应用于微生物研究、工业生产和环境修复等领域，如微生物发酵、细菌复制和酵母分裂等。

三、克隆技术的原理不同类型的克隆技术有不同的原理和操作步骤，但整体上可以归纳为以下几个关键步骤：1. 获取原始材料：根据克隆的目标和对象，选择合适的细胞、组织或基因等作为原始材料。

In―Fusion克隆技术构建HBV X基因真核表达质粒-8页文档资料

In―Fusion克隆技术构建HBV X基因真核表达质粒慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus， HBV）感染是肝癌发生的主要危险因素之一。

HBV 编码的分子中与肝癌发生关系最密切的是X蛋白质，HBV X基因编码的X蛋白质（the hepatitis B virus X，HBx）具有多种生物学功能，可与宿主细胞多种蛋白质相互作用，调控宿主细胞基因表达，影响宿主细胞的信号转导、细胞增殖与分化等，其对肝细胞周期与凋亡的影响是HBV致肝癌发生的重要机制之一[1-3]。

因此，克隆HBV X基因进行HBx蛋白生物功能研究具有重要意义。

由于血清HBV DNA X基因的特殊结构，使得克隆X基因较为困难。

血清HBV病毒颗粒的基因组长约3.2kb，为带有缺口的双链不完全环形结构DNA，称为松弛环状DNA（rcDNA），而X基因位于HBV基因组的1374bp～1838bp，正位于缺口处，而且该区域为高CG区。

实验发现：当以血清HBV rcDNA为模板时，用普通PCR一次扩增全长X基因，或用PCR分段扩增后再用PCR扩增拼接的X基因，所获得全长X基因扩增片段经常会出现序列缺失现象[4]。

为克服上述问题，我们采用In-Fusion克隆技术，将分段扩增的X基因片段一次连接克隆入真核表达载体中。

In-Fusion克隆技术是利用In-Fusion Enzyme可准确将末端带有15个相互重叠碱基序列的DNA片段融合连接的特性，将一个或多个外源基因片段一次克隆入目的质粒中[5-6]。

目的克隆基因片段末端的15 bp重叠碱基序列，是通过特定设计的In-Fusion引物加到扩增片段的末端。

In-Fusion HD Cloning Kits 试剂盒可快速准确地将一个或多个外源DNA片段克隆到载体任何位置[7-8]。

采用In-Fusion技术，以血清HBV DNA为模板，分段扩增并拼接X基因，将X基因准确地克隆入真核表达载体pcDNA3.0，获得了可表达HBx蛋白质重组真核表达载体。

Infusion技术 ppt课件

In-Fusion专利酶
【结果】
In-Fusion 连接反应 50 ℃ 15 min
反应液直接转化
20
7/21/2020
•
引物设计原则
引物的5’末端必须包含与载体末端相同的15个碱基序列引物的3’末端必须包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列
21
July 21, 2020
•
引物设计原则
22
July 21, 2020
6
July 21, 2020
•
In-Fusion®基因克隆技术原理示意图
50 ℃，15 min单管反应
In-Fusion专利酶
In-Fusion是一种快速、简单、高效的基因克隆技术！
7
•
主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答
11
7/21/2020
•
不附加任何多余序列
A 克隆位点
C
任意载体
线性化载体
B 目的DNA片段
不需要的碱基序列
PCR扩增
引物设计
与载体相同的 15 个碱基序列
不附加任何多余序列的重组载体
In-Fusion 连接反应15 min
无缝克隆：不附加任何多余序列
12
7/21/2020
•
不受限制性内切酶酶切位点的限制
3
7/21/2020
•
In-Fusion®基因克隆特点
4
•
主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答

基因克隆实验手册

※ PCR扩增产物是平滑末端时进行dA加尾反应。
【目的DNA片段】带有限制性内切酶的
酶切末端
In-Fusion克隆
5×In-Fusion® HD In-Fusion酶使 Enzyme Premix 末端15个相同
碱基无缝融合
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
TA克隆
3’ A
A 3’
T载体
T T
限制性内切酶/连接
Bam H Ⅰ
5’ GATC
纯化回收（参考第10页）。
↓ ⑥回收液作为插入DNA片段溶液［A］。
2. 准备载体质粒
①使用限制性内切酶在目的载体质粒（环状）的克隆位点进行酶切反应【载体的线性化】
载体质粒DNA Hin d Ⅲ Bam H Ⅰ 10 × K Buffer 灭菌水
(≤1 μg) 1 μl 1 μl 2 μl
up to 20 μl(轻弹混合)
10,000 U 10,000 U
1.25 U
灭菌水
up to 50 μl (轻弹混合)
94℃ 1 min. ↓ 98℃ 10 sec. 60℃ 15 sec. 68℃ 30 sec./kb
30 cycles
↓
②PCR扩增产物的纯化使用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0等进行PCR扩增产物的纯化（参考第10页）。
利用市面上销售的3’末端附加有 dT的载体。
In-Fusion克隆
利用在引物末端附加与载体末端相同的15个碱基序列进行目的基因的扩增。
可使用任意载体。仅需限制性内切酶处理或PCR扩增使载体线性化。
■ 根据使用目的推荐的克隆用试剂盒
实验目的

In-Fusion克隆技术介绍

In-Fusion专利酶
反应液直接转化
【结果】
In-Fusion 连接反应 50 ℃ 15 min
引物设计原则
引物的5’末端必须包含与载体末端相同的15个碱基序列引物的3’末端必须包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列
引物设计原则
引物设计网络工具
在线支持工具
/infusion
1 简便、快速、高效的克隆技术 2 不附加任何多余序列 3 不受限制性内切酶酶切位点的限制 4 可同时克隆两个或多个DNA片段
简便、快速、高效的克隆技术
简便、快速、高效的克隆技术
In-Fusion HD无论是克隆长基因片段还是克隆多个基因片段都能保持较高的克隆效率。
不附பைடு நூலகம்任何多余序列
A
克隆位点
In-Fusion是无缝克隆：不附加任何多余碱基序列。 In-Fusion技术已经成功用于多项高通量克隆工程。
In-Fusion®克隆技术的应用
多片段克隆插入突变位点
应用
构建载体模型高通量克隆
应用实例
实例：多个DNA片段（1 kb, 2 kb, 3 kb)同时克隆
【方法】使用TaKaRa高品质PCR酶分别扩增1 kb、2 kb、3 kb的目的DNA片段和2.7 kb的载体，并将扩增产物混合，使用In-Fusion® HD试剂盒完成克隆。利用高效率的感受态细胞StellarTM Competent Cells（产品编号：636763）转化并进行蓝/白斑筛选。
Step 2: 目的DNA片段扩增重组载体 Step 3: 一次In-Fusion连接反应
克服传统克隆技术的限制
克服其它克隆技术的限制
其它克隆技术的限制
•载体的限制 •不同克隆试剂盒都需要与之匹配的载体 •必须使用提供的载体

新克隆技术不用酶切位点,直接克隆

17 In-Fusion克隆技术介绍
9/24/2020
•
主要内容
1 In-Fusion®技术原理 2 In-Fusion®实验方法 3 In-Fusion®应用实例 4 In-Fusion®应用文献
18 In-Fusion克隆技术介绍
9/24/2020
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In-Fusion®应用
多片段克隆插入突变
CD101, 2799-bp PCR Product Sense 5′-CAGAGAGAAGTAACAGTTCAGAAA-3′ Antisense 5′-GGCCGAGGAGCAGATCCTGGAA-3′
Murine IgG3 with Overlaps to CD101 and SalI-Digested Vector, 771-bp PCR Product Sense 5′-ATCTGCTCCTCGGCCCCTAGAATACCCAAGCCCAGTACC-3′ Antisense (SalI underlined) 5′-AGTAACGTTAGTCGACTCAGTGTCTTGTAAGACCCGAGGA-3′
x μl**
dH2O μTol tal Volume
x 10 μl
Linearized vector : Purified PCR fragment(摩尔比)=1:2 *<0.5 kb: 10-50 ng, 0.5 to 10 kb: 50-100 ng, >10 kb: 50-200 ng **<10 kb: 50-100 ng, >10 kb: 50-200 ng
24 In-Fusion克隆技术介绍
9/24/2020
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In-Fusion®应用实例---插入突变

克隆技术的原理和应用

汇报人：XXX
细胞核：细胞的控制中心，含有遗传信息 DNA：遗传信息的载体，由碱基对组成染色体：DNA的载体，存在于细胞核中细胞分裂：细胞复制自己的过程，包括有丝分裂和减数分裂遗传信息传递：通过细胞分裂和减数分裂，遗传信息从亲代传递给子代
提取DNA：从供体细胞中提取DNA
构建载体：将DNA插入到载体中
社会接受度：克隆技术可能引发社会接受度问题，如公众对克隆技术的接受程度和态度
科技发展：克隆技术可能引发科技发展问题，如克隆技术对科技发展的影响和推动作用
国际公约：禁止克隆人的研
究和应用
各国法律：对克隆技术的研究和应用有不同的规定和限
制
监管机构：负责监督克隆技术的研究和应用，确保符合伦理和社会要
转化受体细胞：将载体转入受体细胞
筛选和扩增：筛选出含有目的基因的受体细胞，并进行扩增
克隆动物：将含有目的基因的受体细胞注入到卵母细胞中，形成克隆动物
胚胎克隆：通过细胞核移植技术，将供体细胞的核移植到去核的卵细胞中，形成新的胚胎，然后植入母体中发育成新个体。
体细胞克隆：通过细胞核移植技术，将供体细胞的核移植到去核的卵细胞中，形成新的胚胎，然后植入母体中发育成新个体。
汇报人：XXX
克隆技术是一种生物技术，通过复制生物的DNA，制造出与原生物完全相同的复制品。
克隆技术的原理包括细胞核移植、胚胎分割、细胞融合等。
克隆技术可以应用于医学、农业、畜牧业等领域，如治疗疾病、提高农作物产量、改良动物品种等。
克隆技术也存在一定的伦理和法律问题，需要谨慎对待。
保护濒危物种：通过克隆技术，可以保护濒危物种，防止其灭绝。

infusion无缝克隆原理

infusion无缝克隆原理Infusion无缝克隆原理Infusion无缝克隆是一种将物体或者生物复制的技术，它可以在不损坏原始物体的情况下，制作出一个完全相同的复制品。

这种技术在科幻电影中经常出现，给人以想象力的空间。

然而，在现实世界中，无缝克隆仍然是一个具有挑战性的课题。

无缝克隆的原理可以简单地解释为将一个物体或者生物的所有特征和性质复制到另一个物体或者生物上。

这包括了物体或者生物的形态、结构、功能和行为等方面。

为了实现无缝克隆，科学家们需要解决几个关键问题。

无缝克隆需要获取原始物体或者生物的详细信息。

这可以通过对原始物体或者生物进行观察和测量来实现。

科学家们使用各种仪器和技术，如扫描仪、显微镜和遗传测序等，来获取尽可能多的数据。

这些数据包括了物体或者生物的结构、形态和遗传信息等。

科学家们需要找到一种适合的复制方法。

无缝克隆的方法有很多种，如基因克隆、细胞克隆和三维打印等。

每种方法都有自己的优缺点，适用于不同的情况。

科学家们需要根据实际需求选择合适的方法。

然后，无缝克隆还需要解决物体或者生物的复制过程中可能出现的问题。

这些问题包括了复制过程中的变异、损坏和不完整等。

科学家们需要通过优化复制过程和改进技术，来尽可能减少这些问题的发生。

无缝克隆还需要解决物体或者生物的复制品与原始物体或者生物之间的差异。

即使在成功复制了一个物体或者生物之后，复制品与原始物体或者生物之间仍然可能存在差异。

这些差异可能是由于复制过程中的误差或者原始物体或者生物的环境因素导致的。

科学家们需要不断改进技术，提高复制品与原始物体或者生物之间的相似度。

无缝克隆是一项具有挑战性的技术。

虽然目前还存在许多问题和困难，但随着科学技术的不断进步，无缝克隆有望实现。

这将会给人类带来许多新的机遇和挑战。