色谱分离技术

流动相的物态 实验技术
迎头法 顶替法 洗脱分析法
4.色谱分离方法的选择
初级代谢产物：氨基酸、有机酸、核苷酸、 目 的 次级代谢产物：生物碱、萜类、糖苷、色素、 产 鞣质类、抗生素 物 生物大分子：蛋白质、酶、多肽、核酸、多糖
单糖类、脂肪酸
色谱分离方法的选择依据：
① 目的产物的分子结构、物理化学性质及相对 分子质量；
被吸附的物质称为吸附物。 吸附力主要是范德华力，有时也可能形成氢 键或化学键。
（一）基本原理 溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表 面时，分子会贴在固体表面上，发生吸附作用。 1.发生吸附作用的原理：
固体表面分子（或原子）与固体内部分子（或原子） 所处的状态不同： 固体内部分子（或原子）受临近四周分子的作用力是 对称的，作用力总和为零，即彼此互相抵消，故分子处 于平衡状态。 界面上的分子所受的力不对称，作用力总和不等于零， 合力指向固体内部。
2.色谱法的特点
（1）概念 色谱法是一种物理的分离方法，利用不同物 质在两相中具有不同的分配系数，并通过两相 不断的相对运动而实现分离的方法。 其中一相是固定相，通常是表面积很大的或
多孔性固体；另一相是流动相，是液体或气体。
流动相流经固定相时，由于物质在两相间的
分配情况不同，经过多次差别分配而达到分离； 或者说，易分配于固定相中的物质移动速度慢， 易分配于流动相中的物质移动速度快，因而逐 步分离。
不足之处：
概述
吸附色谱法 分配色谱法 离子交换色谱法 凝胶色谱法 高效液相色谱法 亲和色谱法
一、概述 1.发展史
创始人：茨维特（Tsweet）1906 纸色谱 薄层色谱 气相色谱 高效液相色谱 离子色谱、凝胶色谱、亲和色谱
菊根粉或 碳酸钙
石油醚
植物色 素的石 油醚提 取液
连续色带—色层或色谱 色谱法得名
Golay Porath, Flodin Moore Giddings Small Jorgenson等
发明毛细管柱气相色谱。 发表凝胶过滤色谱的报告。 发明凝胶渗透色谱。 发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。 发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型 离子色谱法。 创立了毛细管电泳法。
1931
1938 1938 1941 1944 1949 1952 1956 1957 1958 1959 1964 1965 1975 1981
Kuhn, Lederer
Izmailov, Shraiber Taylor, Uray Martin, Synge Consden等 Macllean Martin, James Van Deemter等
固定相和流动相、操作条件。
④ 设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件， 因而不容易使物质变性，特别适于不稳定的大分子 有机化合物。
缺点： 处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此 主要用于实验室，工业生产上应用较少。
3.色谱法的分类
分离机理
操作方法
吸附色谱法 分配色谱法 离子交换色谱法 凝胶色谱法 亲和色谱法 柱色谱法 纸色谱法 薄层色谱法 气相色谱法 液相色谱法
年代 1937 1938 1939 1950 1951 1955 1958 1961 1970 1970 1972 1972
获奖学科 化学 化学 化学 生理学、医学 化学 化学 化学 化学 生理学、医学 化学 化学 生理学、医学
获奖研究工作 类胡萝卜素化学，维生素A和B 类胡萝卜素化学 聚甲烯和高萜烯化学 性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离 超铀元素的发现 脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素 胰岛素的结构 光合作用时发生的化学反应的确认 关于神经元触处迁移物质的研究 糖核苷酸的发现及其在生物合成碳水化合物中的作用 核糖核酸化学酶结构的研究 抗体结构的研究
按色谱动力学过谱(a)、顶替色谱(b)、迎头色谱(c)
按组份在固定相上的物理化学原理，分为： 吸附色谱：不同组份在固定相的吸附作用不同； 分配色谱：不同组份在固定相上的溶解能力不同； 离子交换色谱：不同组份在固定相（离子交换 剂）上的亲和力不同； 凝胶色谱:（尺寸排阻色谱）：不同尺寸分子在固 定相上的渗透作用；
色谱分离基本原理：
使用外力使含有样品的流动相（气体、液体或超 临界流体）通过一固定于柱或平板上、与流动相互
不相溶的固定相表面。处于柱起始端的样品中各组 份与两相进行不同程度的作用。与固定相作用强的 组份随流动相流出的速度慢，而与固定相作用弱的 组份随流动相流出的速度快。由于流出的速度的差 异，使得混合组份最终形成各个组份的“带(band)” 或“区(zone)”，对依次流出的各个组份物质可分 别进行定性、定量分析。
② 点样：
用毛细管吸取样品溶液，轻轻接触到薄层上， 使样品自动吸到薄层上。
直径 < 3 mm
1.5 – 2 cm
③ 展开：
在密闭容器中进行：层析缸。
最常用的展开法： 上行展开法
薄板放入层析缸时，切勿使溶剂浸没样品点。 当溶剂移动到接近薄板上端边缘时，取出薄板， 划出溶剂前沿。
④ 显色：
也称定位，即用某种方法使经色谱展开后的混 合物各组分斑点呈现颜色。 每类化合物都有特定的显色剂。
展开剂：由实验确定。 极性越大，对物质的洗脱能力越强
（3）基本操作
薄层色谱板的制备 点样 展开
显色
① 薄层板的制备：
在一块玻璃板（薄厚一致，表面光滑平整）表面涂 上很薄的吸附剂，如硅胶或氧化铝等。(--涂布) 为了增加薄层的牢固性且易于保存，可在涂布过程 中加入某些黏合剂。如羧甲基纤维素钠（CMC-Na）
1 分离效率高
复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。
2 灵敏度高 可以检测出10-11—10-13g的物质量。 3 分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。 4 应用范围广 气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。
（2）色谱柱：玻璃柱
柱色谱装置
（3）基本操作
干法装柱
装柱
吸附剂
湿法装柱 干法上样
上样 洗脱
被分离物质
湿法上样
梯度洗脱，各组分先后被洗出
三、分配色谱法
分配色谱法：利用溶质在固定相和流动相之 间的分配系数不同而进行分离的方法。
移动速度的不同：
易被吸附的物质相对移动较慢，在薄层板上移 动的距离就小； 较难被吸附的物质移动较快，移动的距离大。
经过一段时间的展开，不同物质就被彼此分开， 最后形成互相分离的斑点。 将展开完毕的薄层板从密闭容器中取出后，用特 定的方法使斑点显色，达到定性和定量的目的。
（2）吸附剂和展开剂的选择： 吸附剂：氧化铝、硅胶和聚酰胺
化学分析方法的基本要求是其选择性要高。即，在分析过程 中，待测物与潜在的干扰物的分离是最为重要的步骤！ 20 世纪中期，大量采用一些经典的分离方法：沉淀、蒸馏和 萃取。 现代分析中，大量采用色谱和电泳分离方法。迄今为止，色 谱 方法是最为有效的分离手段！其应用涉及每个科学领域。 1903年，俄国植物学家MikhailTswett 最先发明。他采用填充 有固体 CaCO3 细粒子的玻璃柱，将植物色素的混合物 ( 叶绿素和 叶 黄素chlorophylls & xanthophylls)加于柱顶端，然后以溶剂淋 洗，被分离的组份在柱中显示了不同的色带，他称之为色谱 ( 希 腊 语中“chroma”=color; “graphein”=write) 。 20世纪50年代，色谱发展最快（一些新型色谱技术的发展， 复杂组分分析发展的要求）。
按照分离过程中相系统的形式和特征，可分为：
柱色谱法 填充柱色谱法 毛细管色谱法 平板色谱法 纸色谱法 薄层色谱法
按流动相，可分为： 气相色谱法 液相色谱法 超临界色谱法 按固定相物态，气相色谱法可分为： 气固色谱法 气液色谱法 按流动相物态，液相色谱法可分为： 液固色谱法 液液色谱法
柱色谱法的分类见表8-1。
2.吸附的类型：
物理吸附 化学吸附
交换吸附
物理吸附
产生方式 活化能 进行温度
释放热量 速度 选择性
化学吸附
分子力（范德华力） 库仑力(电子转移，生成化学键)
低 低温 小 较快，容易达到平衡 不严格
高
高温 很大 慢，平衡慢 强
交换吸附：
吸附剂表面如果由极性分子或离子组成，则会 吸引溶液中带相反电荷的离子形成双电层，同时 放出等物质的量的离子，发生离子交换。
（1）原理：
利用混合物中各组分的物理化学性质的差异， 在层析过程中，在不相溶的两相中分布不同，从 而达到分离的目的。
吸附剂：涂布在薄层板上 （固定相）
两 相 展开剂：在展开过程中流过固定相的溶剂
（流动相）
将待分离的样品溶液点在薄层板的一端，在 密闭的容器中用适宜的溶剂（展开剂）展开。
当溶剂流过时，不同物质在吸附剂和展开剂 之间发生连续不断的吸附、解吸附、再吸附、再 解吸附。 由于吸附剂对不同物质的吸附力大小不同： 对极性大的物质吸附力强， 对极性小的物质吸附力弱。
年代 1906
发明者 Tswett
发明的色谱方法或重要应用 用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。 用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。 最先使用薄层色谱法。 用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。 提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色 谱）。 发明了纸色谱。 在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。 从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。 提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。 基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。
离子的电荷是决定因素，离子所带电荷越多， 在吸附剂表面的相反电荷点上的吸附力越强。 电荷相同的离子，水化半径越小，越容易被吸 附。