色谱分离
色谱法分离
色谱法分离
色谱法分离（Chromatography）是一种技术，它可以分离和分析各种化学物质，如溶剂、溶剂混合物和混合液体。
色谱法分离技术广泛应用于各种科学领域，包括分子生物学、化学、植物学和生物医学。
色谱法分离技术主要依靠分子间的相互作用来分离和分析各种
化学物质和混合液体。
为了将混合液体中的化学物质分离开来，需要将混合液体放置在一种特定的基础上，如纸张或液体相平面上。
然后，该基础物质被加入溶剂，并以某种速度移动，这些速度的不同可以使不同的化学物质分离出来，这样就可以对这些化学物质进行分析和研究。
色谱法分离技术可以被用来分析化学物质的组成，以及它们之间的相互作用。
它还可以帮助我们了解分子的性质，比如它们的分子量、表面张力和电荷数。
由于色谱法分离技术可以提供关于分子的精确的信息，所以它被广泛用于分离和分析各种混合物。
此外，色谱法分离技术还可以用来研究生物样本中的有机物，这些有机物包括蛋白质、酶、抗体、激素和基因等。
这些有机物因其在环境中的可溶性而极为重要，因此研究它们可以帮助我们更好地了解关于它们的结构和功能。
色谱法分离技术可以将这些有机物从环境中分离出来，从而可以更好地研究其组成和功能。
色谱法分离技术是一种强大的分离分析技术，可以用来研究化学物质、混合液体，以及生物样本中的有机物。
它的应用可以深入探索各种科学问题，为解决社会问题提供有效的方法。
色谱法分离技术的
发展对人类文明的发展起着至关重要的作用，它为我们提供了一种全新的手段来探索宇宙中最奥秘而又最有价值的物质。
色谱分离方法分类
色谱法是目前分离三萜类化合物最常用的方法，通常采用多种色谱法相组合的方法：
①吸附柱色谱法；②分配柱色谱法；③高效液相色谱法；④大孔树脂柱色谱；
⑤凝胶色谱法。
（1）吸附柱色谱法：
①常用方法，可用于分离各类三萜化合物。
②依据所用的吸附剂性质的不同，分为正相吸附柱色谱和反相吸附柱色谱。
③正相吸附柱色谱的吸附剂常用硅胶。
④反相柱色谱通常以键合相硅胶Rp-18、Rp-8或Rp-2等为填充剂。
（2）分配柱色谱法：多用于分离皂苷，常用硅胶等作为支持剂，固定相为3%草酸水溶液等，流动相为含水的混合有机溶剂：如氯仿-甲醇-水，正丁醇-水等。
（3）高效液相色谱法：是目前分离皂苷类化合物最常用的方法，分离效能较高。
用于皂苷的分离制备一般采用反相色谱柱，以甲醇-水、乙腈-水等系统为洗脱剂。
（4）大孔树脂柱色谱：适用于皂苷的精制和初步分离。
操作：将含有皂苷的水溶液通过大孔树脂柱后，先用水洗涤除去糖和其他水溶性杂质，医|学教育网搜集整理然后再用浓度由低到高的甲醇或乙醇依次进行
梯度洗脱，极性大的皂苷可被l0%～30%的醇洗脱下来，极性小的皂苷则被50%以上的醇洗脱下来。
（5）凝胶色谱法：分子筛的原理来分离分子量不同的化合物，在用不同浓度的甲醇、乙醇或水等溶剂洗脱时，各成分按分子量递减顺序依次被洗脱下来。
即分子量大的皂苷先被洗脱下来，分子量小的皂苷后被洗脱下来。
应用较多的是在有机相中使用的SephadexLH-20.。
色谱分离技术
二、离子交换树脂的性能 1. 交联度（degree of cross linking）： 离子交换 交联度（ ）： 树脂上胶联剂的含量称为交联度。 树脂上胶联剂的含量称为交联度。交联度用重量百分 比表示， 标号树脂， 比表示，如“×4”标号树脂，其交联度为 标号树脂 其交联度为4%。应根据 。 试样性质进行选择。 试样性质进行选择。 2.交换容量：每千克干树脂能参加交换反应的活 交换容量： 交换容量 性基团数， 表示。 性基团数，用mmol/g or mmol/ml表示。 表示 粒度：离子交换树脂颗粒的大小， 粒度：离子交换树脂颗粒的大小，用树脂溶胀态 所能通过的筛孔数表示。 所能通过的筛孔数表示。 三、流动相 离子交换色谱流动相最常用的是水缓冲液。 离子交换色谱流动相最常用的是水缓冲液。有酸 性缓冲溶液和碱性缓冲液，有时也用有机溶剂（甲醇、 性缓冲溶液和碱性缓冲液，有时也用有机溶剂（甲醇、 乙醇）同水缓冲液混合使用。流动相的pH， 乙醇）同水缓冲液混合使用。流动相的 ，缓冲液的 类型，离子强度， 类型，离子强度，以及加入的有机溶剂都会影响组分 的分离。 的分离。
二、纸色谱法 （一）基本原理 纸色谱法是用滤纸作载体的平面色谱法。 纸色谱法是用滤纸作载体的平面色谱法 。 固定相 为纸纤维吸附的水或吸留的甲醇胺、缓冲液等。 为纸纤维吸附的水或吸留的甲醇胺 、 缓冲液等 。 流动 相为与水不相混溶的有机溶剂。 相为与水不相混溶的有机溶剂 。 因为吸附在纤维上 20%的水分中，有约 的水分中， 的水分中 有约6%可通过氢键与纸纤维素上的羟 可通过氢键与纸纤维素上的羟 基结合生成复合物，与亲水性溶剂可形成两相。 基结合生成复合物 ， 与亲水性溶剂可形成两相 。 纸色 谱法属分配色谱， 谱法属分配色谱 ， 是利用样品组分在两相间分配系数 的不同达到分离的目的。实际上，纸色谱的分离机制 的不同达到分离的目的。 实际上， 较复杂，除分配外， 较复杂 ， 除分配外 ， 可能还有溶质与纸纤维素间的吸 附作用，与纸纤维素上某些基团（ 附作用 ， 与纸纤维素上某些基团 （ 造纸时引入到纤维 素上的）之间的离子交换作用。 素上的）之间的离子交换作用。
色谱法分离纯化流程及注意事项
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1. 样品制备。
将待分离的样品溶解或悬浮在合适的溶剂中。
色谱分离
第一章色谱分离1.1基本概念1906年，俄国植物学家Tsweet提出色谱，他用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散为数条平行的色带。
色谱现象：1)一种是CaCO3吸附，使色素在柱中停滞下来2)一种是被石油醚溶解，使色素向下移动3)各种色素结构不同，受两种作用力大小不同，经过一段时间洗脱后，色素在柱子上分开，形成了各种颜色的谱带，这种分离方法称为色谱法。
定义：色谱法是利用不同物质在互不相溶的两相中具有不同的分配系数，并通过两相不断的相对运动而实现分离的方法。
原理：利用混合物中各组分的物理、化学性质（溶解度、分子极性、分子大小和形状、吸附能力等）的差别，使各组分以不同程度分布在两相(固定相、流动相)中达到分离固定相(Stationaryphase)：是色谱的基质，可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些物质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。
流动相(Mobilephase)：在色谱分离过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等。
1.2色谱法的特点优点：高选择性：可将性质相似的组分分开高效能：反复多次利用组分性质的差异产生很好的分离效果高灵敏性：适于痕量分析分析速度快：十几分钟完成一次；可以测多种样品应用范围广：气液固物质，化学衍生缺点：对未知物分析的定性专属性查需要与其他分析方法连用1.3分类1.3.1按照固定相1)柱色谱法2)纸色谱法3)薄层色谱法1.3.2按照流动相1)气相色谱法2)液相色谱法1.3.3按照分离机理分类1)凝胶色谱法2)离子交换色谱法3)吸附色谱法4)亲和色谱法1.3.4按照分离的对象1)凝胶过滤色谱（GFC）2)凝胶渗透色谱（GPC）1.4固定相1)一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质2)凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子。
色谱分离过程具备的条件
色谱分离过程具备的条件
色谱分离过程具备的条件包括：
1. 有效的分离介质：色谱分离过程中需要使用一种适当的分离介质，如固定相或移动相。
固定相通常是固体或涂在固体上的液体，而移动相通常是液体或气体。
2. 合适的样品处理方法：样品在进入色谱仪之前，通常需要经过一些前处理步骤，如稀释、过滤、萃取等，以提高分离效果或减少可能的干扰。
3. 适当的分离机制：色谱分离基于不同物质在分离介质中的亲和性差异。
不同物质的分离机制可以有吸附、分配、离子交换、排阻等方式。
4. 适当的温度和压力控制：温度和压力的控制可以影响色谱分离的效果和速度。
不同物质具有不同的热力学性质和溶解度，因此适当的温度和压力条件对于实现高效的分离是必要的。
5. 良好的仪器设备：色谱分离通常需要使用高质量的色谱柱、色谱仪及其配套的进样器、检测器等设备，以保证准确和精确的分离过程。
6. 专业的操作技术：色谱分离过程需要操作人员具备一定的专业知识和实践经验，以正确操作仪器设备、准确调节分离条件，并正确解读和分析分离结果。
色谱分离的技术
7.1.2.2 按固定相形状不同分类
(1)柱色谱
进样量大，回收容易。 除用于分析外，还广泛用于生物样品 的制备和工业生物产品的分离与纯化。
(2)纸上色谱 广泛用于定性与定量分析，不用于制备和生产。
(3)薄层色谱
主要用于分析，也可用于小量样品的制备。
7.1.2.3 其他分类方法
(1) 根据流动相的物态分类 气相色谱 、液相色谱和超临界色谱
Ve Vo K d Vi
或
(7-29) (7-30)
Ve Vo Kd Vi
Kd＝1，溶质分子完全不被排阻， 可自由进入所有凝胶颗粒微孔。 Kd＝0，溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒微孔之外，最先被洗脱。 对于中等分子，能进入部分凝胶空间，0＜Kd＜1。 当具有不同分子量物质的混合液流经凝胶柱时，其Kd值的大小就 决定了物质的流出顺序，即Kd值小的先流出，Kd值大的后流出。
7.1.4.2 吸附色谱
吸附色谱分离就是根据吸附剂(固定相)对不同物质的吸 附力不同而使混合物分离的。
离子交换色谱和亲和色谱也可归类于吸附色谱，前者主要 是静电引力的作用，而后者是生物专一亲和力的作用。
在一定温度下，分离物质在液相和固相中的浓度关系可用吸附 方程式来表示：
Ka A B A B Kd
极高的分辨率;
1944年 出现纸层析;
色谱分离
高效液相色谱仪
高效液相色谱(HPLC)流程示意图
离子交换色谱
• 离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团， 这些带 电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果 流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律， 这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相 基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子 交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可 用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫 做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2， 及－MH3+ ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－ COOH。其中-NH3+离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于 强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换 能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只 有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交 换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动 分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、 核苷和各种碱基的分离等。
色谱法的发展历程
◆ 1903年 Tswett创立色谱法（在碳酸钙上分离了叶绿素）。 由Tswett创立的色谱法分离效率低，分离时间长，根据样品的不同， 一般分离需要几小时至几天。 ◆20世纪40年代至50年代初，先后出现了纸色谱（paper chromatography,PC）和薄膜色谱法(thin-layer chromatography,TLC)。 特点：较经典色谱法简单、分离时间短，样品量要求小。 ◆1952年，James和Martin提出了气相色谱法（gas chromatography,GC) 特点： 以气体作为流动相。应用范围广泛受到人们重视。但对不 易气化和热不稳定性差的化合物难以分离。 ◆ 20世纪60年代后期由于新型色谱柱填料的，高压输液泵和高灵 敏度的监测器的出现，发展出了高效液相色谱（High performance liquid chromatograghy,HPLC）。
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吸附色谱
常用的洗脱剂
饱和的碳氢化合物、醇、酚、酮、醚、卤代烷、有机酸等。选 择吸附剂时，可根据样品的溶解度、吸附剂的种类、溶剂极 性等方面考虑，极性大的洗脱能力大，因此可先用极性小的 作洗脱剂，使组分容易被吸附，然后换用极性大的溶剂作洗 脱剂，使组分容易从吸附柱中洗出。
吸附色谱
影响吸附分离的因素 ①和功能基极性有关。极性增加的顺序：烷烃 、不饱和烃、醚、酯、酮、醛、醇、酚和羧 酸，同一类化合物极性基团越多，极性越。 ②小分子的化合物比大分子的化合物极性大。 ③和某些细微结构有关，如氢键、异构体等。
(1) 紫外线照射法 (2) 喷雾显色法 (3) 碘蒸汽显色法 (4) 生物显迹法
柱色谱
洗脱液
样品 填充物 玻璃柱
分部收集
柱色谱（Column Chromatography）
3.1 吸附剂的选择
实验室常用
氧化 铝
氧化 镁
硅胶 活性 炭
吸附剂要求： 不能与被分离的物质和展开剂发生化学作用 吸附剂的粒度大小要均匀
色谱概述
层析柱——径高比（10：1—1：100）、材质（玻璃、有机 玻璃、PVC、不锈钢等）、耐压（0.05－10 MPa）等 泵——恒速、压力（蠕动泵等） 馏分收集仪 n 检测仪
1) 通用型—示差折光、介电常数、电导等
2) 专用型—紫外、荧光、放射性检测器等
n
记录仪、工作站—色谱参数的选择和设定、自动化操作 、色谱数据的采集和存储，并作实时处理、数据后处理 、自动打印出一套完整的色谱分析数据……
31
柱色谱（Column Chromatography）
⑵ 硅胶（silicagel）
吸附性来源于硅胶氧原子上未成键的电子对和可以形成氢键 的羟基。羟基有结合型（Ⅰ）、活性型（Ⅱ）和游离型（Ⅲ） 三种。
柱色谱（Column Chromatography）
它们可以与试样和洗脱剂分子中的极性基团或不饱和键产生 氢键缔合而起吸附作用，其吸附性强弱为： （Ⅰ）<（Ⅲ）<（Ⅱ）
吸附色谱
展开剂
在吸附色谱中，组分的展开过程涉及吸附剂、被 分离化合物和溶剂三种之间的相互竞争。其基本 原则主要有两个：①展开剂对被分离组分有一定 的解吸能力，但又不能太大。②展开剂应该对被 分离的物质有一定的溶解度。 常用溶剂极性次序为：己烷<环己烷<四氯化碳<甲 苯<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<正丙醇<乙醇< 甲醇<水<冰醋酸
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现代分离科学与技术
Modern Separation Science and Technique 色谱分离
Contents
1.
色谱分离概述 色谱分离分类 常用的色谱分离方法 新型色谱分离技术
2. 3.
6.
色谱概述
色谱（chromatography） 分离技术是一类分离方 法的总称，又称色谱法、 层析法、层离法等。它 是利用不同组分在固定 相和流动相中的物理化 学性质的差别，使各组 分在两相中以不同的速 率移动而进一步分离的 技术。
吸附色谱
薄层吸附色谱分离操作 （1）薄层色谱板的制备 （2）点样 （3）展开 （4）显色
吸附色谱
1）薄层色谱板的制备
干法铺板(软板制备) 多用于氧化铝薄层板的制备。在一块边缘 整齐的玻璃板上，铺上适量的氧化铝，取一合适物品顶住玻璃板 右端。两手紧握铺板玻璃棒的边缘，按箭头方向轻轻拉过，一块 边缘整齐、薄厚均匀的氧化铝薄层即成。 湿法铺板可用于硅胶、聚酰胺、氧化铝等薄层板的制备，但最常
柱色谱（Column Chromatography）
⑴ 氧化铝（alumina）
氧化铝的吸附活性来源于铝原子上未成键电子对。氧化铝的 活性与含水量有关，含水量越低，活性越大，吸附力越强。无 水氧化铝吸附活性特别强。根据氧化铝的含水量可将氧化铝的 活性分为五级 。
活性 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅳ 氧化铝含水量（%） 0 3 8 10 15 硅胶含水量（%） 0 5 15 25 38
选用吸附色谱法分离化合物时，必须首先了解被分离
化合物的性质，然后选择合适的吸附剂和展开剂。被 分离化合物、吸附剂和展开剂三者关系配合恰当才能 得到较好的分离效果。 薄层色谱法选择的主要吸附剂为氧化铝、硅胶和聚酰 胺。色谱用的吸附剂要求一定的形状与粒度范围，不 同吸附剂用于分离不同类型的化合物。吸附剂还必须 具有一定的活度，活度太高或过低都不能使混合物各 组分得到有效的分离。
色谱概述
1941 Martin和Synge提出液-液色谱理论； 1952 James和Martin发展了气相色谱； 1956 Van Deemter提出速率理论； 1967 Kirkland等研制高效液相色谱法；
80年代以后出现毛细管电泳和毛细管电动色谱等一 系列新的色谱分析方法。
色谱概述
几个概念 色谱柱：进行色谱分离用的细长管。 固定相：管内保持固定、起分离作用的填充物。 流动相：流经固定相的空隙或表面的冲洗剂。
色谱流程及 主要部件
色谱概述
操作术语： ①洗脱剂——作为流动相的液体。 ②层析剂——分离技术中的固定相 ③展开——加入洗脱剂而使各组分分层的操作。 ④色谱图——展开后各组分的分布情况。 ⑤洗脱液——洗脱时从柱中流出的溶液。
柱色谱（Column Chromatography）
硅胶，通常视为酸性吸附剂。一般用来分离一些 酸性和中性有机物。如有机酸、萜类、氨基酸、甾类 和一些甙类。 但是，对某些酸性弱的试样，在色层中有分解的 危险。 此外，对于碱性物质可发生不可逆吸附。因此， 对一些碱性物质在使用硅胶进行层析时，有必要进行 预实验。 如在硅胶中拌入15％左右的硝酸银，这种加硝酸 银的硅胶对有机物中不饱和键有特殊的吸附性，因此 ，常用它分离一些不饱和化合物。
吸附色谱
上行展开法和下行展开法 最常用的展开法是上行展开，就是 使展开剂从下往上爬行展开；下行展开是使展开剂由上向下流 动。由于受重力作用，下行展开移动较快。 单次展开法和多次展开法 单向展开法和双向展开法
吸附色谱 显色
显色也称定位，即用某种方法使经色谱展开后的
混合物斑点呈现颜色，以便观察其位置
用的是硅胶硬板。为使制成的硅胶板坚硬，要加入黏合剂，用硫 酸钙为粘合剂铺成的板称为硅胶G板，用羧甲基纤维素钠作黏合 剂铺成的板为硅胶-CMC板。
吸附色谱
点样
用一根玻璃毛细管或点样器，吸取样品溶液，在距薄 层一端约2cm的起始线上点样，每点间距约2cm，样 品点直径一般小于0.5cm。注意点样量要适中，太少
吸附色谱
吸附色谱法(adsorption chromatography，AC)是靠
溶质与吸附剂之间的分子吸附力的差异而分离
的方法。吸附色谱的固定相为固体吸附剂，如
有较强极性硅胶、中等极性氧化铝、非极性炭
及特殊作用的分子筛等。
吸附色谱
基本原理
吸附色谱是靠溶质与吸附剂之间的分子吸附力的差异而分离
色谱概述
加样，洗脱剂冲洗 各组分与固定相无作 用力——与洗脱剂一 起流动，得不到分离 ； 各组分与固定相有一 定作用力——移动速 率低于流动相。 各组分与固定相的作 用力大小不同——移 动速率不同，作用力 大，移动慢，各组分 得到分离。
色谱概述
1903年 Tswett创立色谱法（在碳酸钙上分离了叶绿素）。由 Tswett创立的色谱法分离效率低，分离时间长，根据样品的不同 ，一般分离需要几小时至几天。 ◆20世纪40年代至50年代初，先后出现了纸色谱）和薄膜色谱 法。 特点：较经典色谱法简单、分离时间短，样品量要求小。 ◆1952年，James和Martin提出了气相色谱法（GC) 特点： 以气体作为流动相。应用范围广泛受到人们重视。但对 不易气化和热不稳定性差的化合物难以分离。 20世纪60年代后期由于新型色谱柱填料的，高压输液泵和高灵 敏度的监测器的出现，发展出了高效液相色谱（HPLC）。
的方法。吸附力主要是范德华力，有时也可能形成氢键或化
学键。吸附法的关键是选择吸附剂和展开剂。
吸附色谱分离过程示意图
吸附色谱
下列三个化合物用硅胶吸附色谱分离，以石油醚 - 乙 酸乙酯（ 95 ： 5 ）洗脱，判断三者流出色谱柱先后顺 序。
OH
O
OCOCH3
A 由先到后： C→B→A
B
C
吸附色谱
吸附剂与展开剂
吸附色谱
吸附剂与洗脱机选择的选择
吸附剂应有最大的比表面积和足够的吸附能力，它对 欲分离的不同物质应该有不同的解吸能力；与洗脱剂
、溶剂及样品组分不会发生化学反应；还要求所选的
吸附剂颗粒均匀，在操作过程中不会破裂。 洗脱剂原则上要求所选的洗脱剂纯度合格，与样品
和吸附剂不起化学反应，对样品的溶解度大，粘 度小，容易流动，容易与洗脱的组分分开。
色谱概述
岛津高效液相检测器
SPD-20A/V 紫外可见双波长检测器 SPD-M20A 二极管阵列检测器（PDA） RF-20A/xs 荧光检测器 RID-10A 示差折光检测器 CDD-10Avp 电导检测器 ELSD-LTⅡ 蒸发光散射检测器 ECD 电化学检测器 Radiochromatography Detector 放射性同位素检测 器
色谱概述
色谱法的优点 （1）分离效率高。 （2）应用范围广。
（3）分析速度快。
（4）样品用量少。 （5）灵敏度高。 （6）分离和测定一次完成。和多种波谱分析仪器联用 （7）易于自动化，可在工业流程中使用。 色谱法的缺点是处理量小、操作周期长、不能连续操作。
色谱法的分类
色谱法的分类 根据操作压力的不同分类： 低压色谱：操作压力<0.5MPa 中压色谱：操作压力0.5～4.0MPa 高压色谱：操作压力4.0～40MPa