酶工程实验报告
酶工程实验
实验一淀粉酶的提取及活力测定一、实验目的淀粉酶几乎存在于所有植物中，其中以禾谷类种子的淀粉酶活性较强。
水稻萌发时淀粉酶活性最强。
水稻萌发时淀粉活性的大小与种子萌发力有关。
本实验通过对水稻萌发期淀粉酶活性测定，学习和掌握淀粉酶的测定方法，了解水稻生长与之代谢的关系。
二、原理淀粉酶能将淀粉水解成麦芽糖，由于麦芽糖能将3，5-二硝基水杨酸试剂还原成3-氨基-5-硝基水杨酸的橙红色化合物，且在一定范围内还原糖的浓度与反应液的颜色成正比，故利用比色法可求出麦芽糖的含量。
以5分钟内每克样品水解产生麦芽糖的毫克数表示酶活性的大小。
植物淀粉酶可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶两种，其中β-淀粉酶不耐热，在温度70℃以上易钝化：而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化。
根据以上特性，可分别测定这两种淀粉酶的活性。
如测定α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性，即为淀粉酶总活性。
三、实验材料、仪器及试剂1．仪器：20ml具塞试管移液管 100ml容量瓶石英砂研钵721型分光光度计离心机恒温水箱离心管2．试剂：（1）1%淀粉溶液：称1.0克可溶性淀粉，加入100ml蒸馏水煮沸。
（临用时配制）（2）pH5.6柠檬酸缓冲液：A、称取柠檬酸21.0克，溶解后定容至1000ml；B、称取柠檬酸钠29.4克，溶解后定容至1000ml；量取A液55ml与B液145ml混匀，即为pH5.6的缓冲液。
（3）0.4mol/L氢氧化钠溶液。
（4）3,5-二硝基水杨酸试剂：取1.0克3,5-二硝基水杨酸，溶于20ml 2mol/L氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶盖，勿使二氧化碳进入。
（5）麦芽糖标准溶液：称取0.1000克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，然后定容至100ml，取为1mg/ml麦芽糖标准液。
实验材料：萌发水稻种子。
四、实验方法1．酶液的制备：称取去根萌发水稻种子2克（含外壳），置研钵中，加1克石英沙研磨成匀浆。
酶工程实验doc
酶工程实验指导实验一从植物材料中提取制备过氧化物酶一．实验目的学习从植物材料中制备过氧化物酶的方法，了解纯化酶的一些基本步骤。
比较不同植物材料过氧化物酶的含量与活性，掌握酶纯化的相关计算方法。
二．实验原理过氧化物酶（EC 1. 11. 1. 7）是一类以铁卟啉为辅基的氧化酶，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用，在工业上也广泛被应用。
过氧化物酶可溶于水，溶解度约为5%（W/V），溶液呈棕红色，透明。
此酶可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而在0.62饱和度以上则不溶。
该酶能催化愈创木酚反应产生有色物质：以此可进行酶活性的测定。
许多植物如辣根、柑桔叶子、白萝卜等含有较多的过氧化物酶，在这些植物材料的溶出物中，加入不同浓度的硫酸铵进行分段盐析，对过氧化物酶进行粗提，然后用有机溶剂沉淀、结晶等方法可对该酶进行纯化，得出较纯的制品。
三．主要仪器与试剂仪器：组织捣碎机，冰箱，真空冷冻干燥机，离心机，紫外-可见分光光度计等。
试剂：愈创木酚，丙酮，过氧化氢，硫酸铵等。
四．实验步骤（尽量在冰浴中进行）鲜植物样品约70克，剪碎或捣烂，加少许水研磨成浆（可用捣碎机），转移到500ml的烧杯中，加水至约200ml，于冰箱中浸提约2小时（中间多次搅动）。
多层纱布挤压过滤后离心（4000rpm），10ml上清液用来测酶活力，其余上清液按226克/升加硫酸铵盐析，冰箱中静置1小时以上，离心(4000rpm)去沉淀。
上清液再按258克/升加硫酸铵盐析，冰箱中静置4小时以上。
离心收集沉淀，用水溶解至约10ml，用水透析去盐，离心去沉淀，取部分酶液稀释后测酶活。
其余酶液用作精制样品。
在搅动下沿着杯壁加入一倍体积预冷(-15℃)的丙酮于酶液中，混匀，静置10分钟，低温离心(8000rpm, 4℃) 去沉淀。
按上清液与丙酮之比为1比0.8再次加入预冷丙酮，静置10分钟后离心(8000rpm, 4℃) 收集沉淀，溶于少量水中，透析去丙酮。
酶工程实验报告册
酶工程实验报告册实验目的本次实验旨在通过酶工程技术，利用已知的酶催化反应，研究酶的可控性和催化效率，以此为基础进一步探讨酶工程在生物技术领域中的应用。
实验材料* 酶底物：葡萄糖溶液* 酶：葡萄糖酶* 实验器材：试管、显微镜、荧光分析仪实验步骤1. 准备实验器材和试剂，保证实验环境的洁净。
2. 将葡萄糖底物溶液放入试管中，分为十组，每组添加不同浓度的葡萄糖底物。
3. 将葡萄糖酶加入到每个试管中，调整酶的浓度。
4. 将试管放入恒温水浴中，使反应温度稳定在适宜的酶活性温度。
5. 设置实验时间，每隔一定时间取出一组试管进行荧光分析，记录反应速率。
实验结果根据实验数据得到以下结果：* 反应速率与底物浓度呈正相关关系，随着底物浓度的增加，反应速率也增加。
* 酶活性随着温度的增加呈增加趋势，但超过酶的适宜温度范围后，酶活性会急剧下降。
结果分析本实验结果表明葡萄糖酶催化反应具有高度的可控性和催化效率。
随着底物浓度的增加，酶催化反应速率增加，这可以为工业生产中的底物转化提供重要参考。
而温度对酶活性的影响也表明了酶工程中合适的条件选取的重要性，过高或过低的温度都会影响酶的活性，从而降低反应效率。
实验结论通过本次实验，我们验证了酶工程技术在酶催化反应中的重要作用。
酶工程技术不仅可以提高反应效率，还可以调控酶的活性和特异性，从而对底物进行选择性催化。
这对于工业生产和医药研发有着重要的意义。
实验心得通过本次实验，我深刻认识到酶工程技术在生物技术领域的重要性。
酶工程技术可以帮助我们解决传统催化反应过程中的瓶颈问题，提高反应的效率和选择性。
同时，酶工程技术还为制定合适的反应条件提供了理论依据，进一步推动了生物技术的发展。
总之，酶工程技术的应用前景广阔，未来可以在医药、食品、环境等多个领域中发挥重要作用。
酶工程实验报告三( 纤维素酶最适反应pH值的测定)
实验方式 小组合作
小组成员 XX XX XX XX
掌握酶最适 pH 值的测定方法及原理。
2、 实验仪器、试剂和溶液：
A 2 仪器： 紫外分光光度计、比色皿（3个）、恒温水浴锅(4台)、试管架（1个）、1ml移液管（1 根）、10ml移液管（1根）、玻璃棒（1根）、1000ml烧杯（1个）、500ml烧杯（2个）、 1000ml容量瓶（1个)、洗耳球（1个）、标签（若干）等。
本科学生实验报告
学号 104120440 姓 名
孙永升
学院 生命科学学院 专业、班级 10 生物技术
实验课程名称
酶 工 程 <实验>
教师及职称
李俊俊 <讲师>
开课学期 2012 至 2013 学年 第二学期
填报时间 2013 年 月 24 日
云南师范大学教务处编印
1
实验名称 实验三 纤维素酶最适反应 pH 值的测定
5 实验处理
A 5 葡萄糖标准曲线如 图 1：
OD540nm值
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0 0
y = 0.7023x - 0.0747
葡萄糖标准曲线
R2 = 0.9992
系列1 线性 (系列1)
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
葡萄糖浓度(mg/ml)
图 1 标准曲线 葡萄糖标准曲线如上图所示，得回归直线方程 y=kx-0.0747，k=0.7023， R2=0.9992>0.99，该标准曲线相关性很好。式中 Y 表示表示测定的吸光度（OD）值，X 表示还原糖的浓度, 0.0747 表示补偿参数。
pH 与酶活性关系的测定是在其它条件（如底物浓度、酶浓度、反应温度等）恒定的 最适情况下，选用一系列变化的 pH 环境中进行初速度测定，其图形一般为钟形曲线。
酶工程实习报告
实习报告实习单位：XX生物科技有限公司实习时间：2021年6月1日至2021年8月31日实习内容：酶工程一、实习背景及目的作为一名生物技术专业的学生，我一直对酶工程领域充满兴趣。
酶工程是一门应用生物化学、微生物学和分子生物学等知识，通过现代生物技术手段对酶进行改造和应用的学科。
本次实习旨在让我深入了解酶工程的基本原理、技术方法和实际应用，提高我的实践能力和创新能力。
二、实习内容及心得1. 酶的筛选与改造在实习过程中，我参与了酶的筛选与改造项目。
首先，我们通过文献调研和实验室现有资源，选择了适合目标反应的酶。
然后，利用PCR技术对酶的基因进行克隆，并通过基因编辑技术对酶的氨基酸序列进行改造，以提高其催化活性和稳定性。
此外，我还学会了使用各种生物信息学工具对酶的三维结构进行预测和分析，为酶的改造提供理论依据。
2. 酶的表达与纯化在酶的筛选与改造过程中，我了解了酶的表达与纯化技术。
我们选用大肠杆菌作为宿主细胞，通过优化表达载体和培养条件，实现了酶的高效表达。
然后，采用凝胶过滤层析、离子交换层析和亲和层析等方法对酶进行纯化，以获得高纯度的酶制剂。
在此过程中，我掌握了各种层析技术的原理和操作技巧，并学会了使用相关设备进行实验操作。
3. 酶的应用与评价在酶的应用与评价方面，我参与了多个实际项目的研发。
例如，我们将筛选到的酶应用于生物制药、食品加工和环境保护等领域，评估其催化效果和实用性。
此外，我还参与了酶的动力学实验，通过测定酶的米氏常数（Km）和最大催化速率（Vmax），评估酶的催化性能。
这些实验让我深刻认识到酶在实际应用中的重要性和潜力。
4. 实习收获通过本次实习，我不仅掌握了酶工程的基本原理和技术方法，还提高了自己的实践能力和创新能力。
在实习过程中，我学会了查阅文献、分析实验数据和撰写实验报告。
同时，与导师和同事们的交流与合作，使我更加熟悉了实验室的运作方式和团队协作的重要性。
总之，本次实习让我在酶工程领域取得了丰硕的成果，为今后的学术研究和职业生涯奠定了基础。
酶工程实验报告一(纤维素酶活力测定)
葡萄糖标准曲线制作 滤纸酶活力(FPA)的测定 羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定
D 3酶活定义
D 3.1纤维素酶：在各种酶组分的协同作用下，能降解纤维素，使之变成纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖的酶。
D 3.2滤纸酶活力Filterp apera ctivity (FPA)
A 2.2羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定中仪器：自动连续多档分配器、漩涡混合器试管、水浴等仪器同A 2.1
B2试剂和溶液(除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。)
B 2.1葡萄糖标准曲线制备：
①葡萄糖标准贮备溶液(10mg/mL)：称取于( 103士2)℃下烘千至恒重的无水葡萄糖1g,精确至0.1mg，用水溶解并定容至100mL,
lg固体酶(或1mL液体酶)，在(50士0.1)℃,指定pH条件下(酸性纤维素酶pH4.8，中性纤维素酶pH 6.0), lh水解滤纸底物，产生出相当于l mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g(或u/mL)表示。
D 3.3羧甲基纤维素酶活力( CMCA)
D 3.3.1还原糖法lg固体酶(或1mL液体酶)，在(50士0.1)℃、指定pH条件下(酸性纤维素酶pH4 .8,中性纤维素酶pH 6.0), lh水解羧甲基纤维素钠底物，产生出相当于1 mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g(或u/mL)表示。简写为CMCA-DNS。
⑥以空白管(对照液)调仪器零点，在分光光度计波长540nm下，用10mm比色杯，分别测量三支样品管中样液的吸光度，取平均值。通过查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。
D 4.3滤纸酶活力(FPA)的测定步操作流程：如表二所示：
关于酶工程实验报告
一、实验目的1. 理解酶工程的基本原理和实验方法。
2. 学习酶的制备、纯化和活性测定等实验技术。
3. 掌握酶的催化特性和应用。
二、实验原理酶工程是指利用酶的催化特性，通过基因工程、蛋白质工程等手段，改造或制备具有特定功能的酶，以满足工业、医药、环保等领域的需求。
本实验通过制备、纯化和活性测定等方法，研究酶的催化特性和应用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：酶源（如淀粉酶、蛋白酶等）、底物（如淀粉、蛋白质等）、缓冲液、指示剂等。
2. 实验仪器：离心机、电泳仪、紫外分光光度计、酶标仪等。
四、实验步骤1. 酶的制备（1）酶源培养：将酶源接种于培养基中，在适宜条件下培养，使其大量繁殖。
（2）酶提取：将培养好的酶源进行离心分离，收集上清液。
（3）酶浓缩：采用透析、超滤等方法，去除酶液中的杂质，提高酶的浓度。
2. 酶的纯化（1）离子交换层析：根据酶的等电点，选择合适的离子交换树脂，进行酶的吸附和洗脱。
（2）凝胶过滤层析：根据酶的分子量，选择合适的凝胶过滤柱，对酶进行分离和纯化。
3. 酶的活性测定（1）酶活力单位：采用紫外分光光度法测定酶的活性。
（2）酶催化反应速率：测定酶催化底物反应的速率，计算酶的活力。
4. 酶的催化特性研究（1）温度对酶活性的影响：在不同温度下测定酶的活性，研究温度对酶活性的影响。
（2）pH对酶活性的影响：在不同pH值下测定酶的活性，研究pH对酶活性的影响。
五、实验结果与分析1. 酶的制备通过酶源培养、酶提取和酶浓缩等步骤，成功制备了酶液，酶浓度达到实验要求。
2. 酶的纯化通过离子交换层析和凝胶过滤层析，成功纯化了酶，纯度达到95%以上。
3. 酶的活性测定酶活力单位为：X U/mL；酶催化反应速率为：Y mol/min。
4. 酶的催化特性研究（1）温度对酶活性的影响：在30℃时，酶活性最高，随着温度升高，酶活性逐渐降低。
（2）pH对酶活性的影响：在pH 7.0时，酶活性最高，随着pH值的变化，酶活性逐渐降低。
酶工程实验
实验1、大蒜细胞SOD的提取和分离一、原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。
它可催化超氧负离子（O2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。
大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8磷酸缓冲液提取出。
由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。
二、材料和试剂1、新鲜蒜瓣2、0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）3、氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:54、丙酮：用前需预冷至4-10℃5、0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.2）6、0.1mol/L EDTA溶液7、2mmol/L肾上腺素溶液三、步骤1、组织细胞破碎：称取5g大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨。
2、SOD的提取：破碎后的组织中加入2-3倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000rpm下离心15min，取上清液。
3、除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心15min，得到的上清液为粗酶液。
4、SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心15min，得SOD沉淀。
将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，于55-60℃热处理15 min，得到SOD酶液。
5、SOD活力测定将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。
试剂空白管对照管样品管碳酸缓冲液 5.0 5.0 5.0EDTA溶液0.5 0.5 0.5蒸馏水0.5 0.5 -样品液- - 0.5混合均匀，在30℃水浴中预热5min肾上腺素溶液- 0.5 0.5加入肾上腺素后，继续保温2min，然后立即在480nm处测定光密度。
对照管和样品管的光密度值分别为A和B。
在上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。
生物大实验2(酶工程实验)
实验一酶促反应中初速度时间范围测定一、实验目的1.了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理；2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。
二、实验原理酸性磷酸酯酶（acid phosphatase, EC 3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。
它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。
酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。
以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenyl phosphate,NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。
在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。
利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。
即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间。
而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。
可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。
进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。
从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。
随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。
要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。
三、实验试剂与器材1.试剂（1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取）（2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到）取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A在0.6～0.7之间。
405（3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。
（4）0.3mol/LNaOH溶液2．器材恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机。
酶的相关实验报告
一、实验目的1. 了解酶的专一性原理。
2. 掌握验证酶的专一性的实验方法。
3. 分析实验结果，得出结论。
二、实验原理酶是一种生物催化剂，具有高度的专一性，即一种酶只能催化一种或一类底物的反应。
本实验以唾液淀粉酶为研究对象，探究其对淀粉和蔗糖的专一性。
三、实验材料1. 试剂：2%蔗糖溶液、0.5%淀粉溶液、班氏试剂、唾液。
2. 仪器：恒温水浴锅、试管、试管架、滴管。
四、实验步骤1. 取两支试管，分别编号为A、B。
2. 在A试管中加入2%蔗糖溶液2ml，B试管中加入0.5%淀粉溶液2ml。
3. 同时向A、B试管中加入唾液2滴。
4. 将两支试管放入恒温水浴锅中，保持37℃水浴30分钟。
5. 取班氏试剂2ml，加入A试管中，摇匀。
6. 将A试管放入沸水浴中，加热5分钟。
7. 取班氏试剂2ml，加入B试管中，摇匀。
8. 将B试管放入沸水浴中，加热5分钟。
9. 观察两支试管中的颜色变化，记录结果。
五、实验现象1. A试管中产生砖红色沉淀，说明唾液淀粉酶催化蔗糖水解产生还原糖。
2. B试管中无颜色变化，说明唾液淀粉酶对淀粉无催化作用。
六、实验结论1. 唾液淀粉酶对蔗糖具有催化作用，但对淀粉无催化作用。
2. 酶具有高度的专一性，只能催化一种或一类底物的反应。
七、讨论1. 实验结果表明，唾液淀粉酶对蔗糖具有催化作用，而对淀粉无催化作用，证实了酶的专一性。
2. 实验过程中，注意控制实验条件，如恒温水浴温度、时间等，以保证实验结果的准确性。
3. 在实验过程中，发现唾液淀粉酶对蔗糖的催化作用与班氏试剂反应时间有关，提示我们在后续实验中应优化实验条件。
八、应用1. 酶的专一性原理在生物工程、医药、食品等领域具有广泛的应用。
2. 通过了解酶的专一性，可以更好地利用酶催化反应，提高生产效率。
九、注意事项1. 实验过程中，注意保持实验操作规范，避免污染。
2. 实验数据应准确记录，便于分析。
3. 实验结束后，及时清洗实验器材，保持实验室卫生。
酶工程实验报告五(纤维素酶米氏常数—Km的测定)
酶工程实验报告五(纤维素酶米氏常数—Km的测定)引言在酶工程中，了解和研究酶的基本特性是非常重要的。
米氏常数(Km)是一种描述酶的底物浓度与酶速率之间关系的参数，它能够给出底物与酶的结合强度和底物浓度对反应速率的影响程度。
本实验旨在通过测定纤维素酶的米氏常数，来探讨纤维素酶与底物纤维素之间的结合情况以及底物浓度对纤维素酶催化反应速率的影响。
实验方法实验材料和仪器•纤维素酶溶液•含有不同浓度纤维素的底物溶液•pH缓冲液•活化剂•酶解试管•恒温水浴•分光光度计实验步骤1.准备一系列不同浓度的纤维素底物溶液。
2.将50 μL纤维素酶溶液加入酶解试管中。
3.加入100 μL纤维素底物溶液和150 μL pH缓冲液。
4.加入适量的活化剂，混匀试管中的液体。
5.将试管放入恒温水浴中，在37°C恒温条件下进行酶解反应。
6.设定分光光度计波长为适当的值，测定反应体系中的底物浓度随时间的变化。
7.重复以上步骤，并分别用不同浓度的纤维素底物进行实验。
实验结果通过分光光度计测定反应体系中的底物浓度随时间的变化，得到了以下数据：时间 (min) 底物浓度 (mmol/L)0 105 8.710 7.515 6.220 5.025 3.730 2.535 1.240 0.0根据实验数据，我们可以绘制底物浓度随时间的变化曲线图。
通过拟合得到的曲线，可以确定纤维素酶的米氏常数。
数据处理与分析根据实验数据，我们可以将底物浓度随时间的变化绘制成一条曲线。
通过拟合得到的曲线，可以确定纤维素酶的米氏常数。
假设底物浓度随时间的变化符合酶动力学方程：V = Vmax * [S] / (Km + [S])其中，V为反应速率，[S]为底物浓度，Vmax为最大反应速率，Km为米氏常数。
我们可以通过将实验数据代入上述方程进行拟合，得到最优的Vmax和Km的估计值。
结果与讨论通过将实验数据代入酶动力学方程进行拟合，我们得到了纤维素酶的米氏常数(Km)的估计值。
探究酶的影响_实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解酶的催化作用及其影响因素。
2. 探究不同因素对酶活性的影响，如温度、pH值、底物浓度等。
3. 通过实验，培养学生的实验操作能力和数据分析能力。
二、实验原理酶是一种生物催化剂，具有高效、专一、温和等特点。
酶的活性受多种因素的影响，如温度、pH值、底物浓度等。
本实验通过改变这些因素，观察酶活性的变化，从而探究酶的影响。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：淀粉酶、淀粉、碘液、氢氧化钠、盐酸、蒸馏水、温度计、pH计、恒温水浴锅、试管、移液器等。
2. 实验仪器：显微镜、离心机、分光光度计、酸度计等。
四、实验方法1. 温度对酶活性的影响（1）将淀粉酶溶液和淀粉溶液分别置于不同温度的水浴锅中，分别为0℃、25℃、37℃、50℃、75℃。
（2）分别将淀粉酶溶液加入淀粉溶液中，摇匀，观察反应现象。
（3）记录不同温度下淀粉酶催化淀粉水解的时间。
2. pH值对酶活性的影响（1）将淀粉酶溶液和淀粉溶液分别置于pH值为3、5、7、9、11的缓冲溶液中。
（2）分别将淀粉酶溶液加入淀粉溶液中，摇匀，观察反应现象。
（3）记录不同pH值下淀粉酶催化淀粉水解的时间。
3. 底物浓度对酶活性的影响（1）将淀粉酶溶液分别置于不同浓度的淀粉溶液中，分别为0.1%、0.5%、1%、2%、3%。
（2）分别将淀粉酶溶液加入淀粉溶液中，摇匀，观察反应现象。
（3）记录不同底物浓度下淀粉酶催化淀粉水解的时间。
五、实验结果与分析1. 温度对酶活性的影响实验结果显示，随着温度的升高，淀粉酶催化淀粉水解的时间逐渐缩短，酶活性增强。
在37℃时，酶活性达到最大值，超过37℃后，酶活性逐渐降低。
2. pH值对酶活性的影响实验结果显示，随着pH值的升高，淀粉酶催化淀粉水解的时间逐渐缩短，酶活性增强。
在pH值为7时，酶活性达到最大值，超过pH值为7后，酶活性逐渐降低。
3. 底物浓度对酶活性的影响实验结果显示，随着底物浓度的增加，淀粉酶催化淀粉水解的时间逐渐缩短，酶活性增强。
酶工程实验报告四(纤维素酶酶促反应初速度的测定)
E 不同时间保温
3min、6min、9min、12min、1保5m温in不、2同0m时in间、2：5min、30min、40min、50min、 60min。迅速取 2mL
反应液于装有 3mLDNS 试剂的 25mL 试管中（取两次，每次时间间隔相同），迅速振荡均匀
↓ F 测定
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↙
↘
↘
①反应终止→ ②沸水浴 5min → ③定容至 25ml→ ④测定 OD540 吸光值
0.8 0.7115 1.0640 1.2330 1.2730 1.2930 1.4340 1.5520 1.5620 1.6180 1.6860 1.7900
5.2 结果处理 以反应时间为横坐标，以相对反应速度（吸光度值）为纵坐标，做出四种酶
浓度的进程曲线，求出各种酶浓度下的初速度时间范围和反应初速度。 统计软件 SPSS 作图分析如图一 、图二： 纤维素酶反应的速度曲线
本实验采用最适 pH、最适温度和足够高的底物浓度，来测定不同酶浓度下反应速度
2
的时间范围。
4、实验方法步骤、操作流程及注意事项：
4 .1 实验方法与步骤： 1、 酶液制备 精确称取固体纤维素酶0.05g 、0.1g、 0.15g 、0.2g ，分别溶于100mL蒸馏水
中，制成浓度为0.5mg/mL、 1mg/mL、 1.5mg/mL、 2mg/mL的酶液。 2、预热 (1)分别取50mL的底物溶液和不同浓度的已制备好的纤维素酶酶液于250mL三角瓶
XX 小组合作
XX
XX
1、 实验目的
求出在一定条件下测定酶活力的初速度时间范围，并了解它的意义，了解浓度度对
曲线的影响。
2、 实验仪器、试剂和溶液：
2.1 仪器： 紫外分光光度计、比色皿（3个）、恒温水浴锅、试管架（1个）、l移液管、洗耳球、 标签（若干）、分析天平（感量0.01mg）等。
酶的实验报告结果
一、实验目的通过本次实验，我们旨在了解酶的特性，包括酶的专一性、温度、pH值对酶活力的影响，以及激活剂和抑制剂对酶活力的影响。
二、实验原理酶是一种生物催化剂，具有高效性、专一性和可调节性等特点。
在特定的条件下，酶可以显著提高化学反应的速率。
本实验通过观察酶在不同条件下的催化效果，分析酶的特性。
三、实验材料与仪器1. 材料：淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖、蔗糖、氯化钠、氢氧化钠、盐酸、硫酸铜、苯酚、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠溶液、盐酸溶液、硫酸铜溶液等。
2. 仪器：恒温水浴锅、电子天平、试管、试管架、移液器、滴定管、烧杯、漏斗、滤纸等。
四、实验方法与步骤1. 酶的专一性实验（1）取两只试管，分别加入等量的淀粉溶液和蔗糖溶液。
（2）向两只试管中分别加入等量的淀粉酶和蛋白酶。
（3）将两只试管放入恒温水浴锅中，在37℃下反应30分钟。
（4）用苯酚-硫酸法检测反应后的还原糖含量。
2. 温度对酶活力的影响实验（1）取三只试管，分别加入等量的淀粉溶液。
（2）向三只试管中分别加入等量的淀粉酶。
（3）将三只试管分别放入不同温度（0℃、25℃、50℃）的恒温水浴锅中，反应30分钟。
（4）用苯酚-硫酸法检测反应后的还原糖含量。
3. pH值对酶活力的影响实验（1）取三只试管，分别加入等量的淀粉溶液。
（2）向三只试管中分别加入等量的淀粉酶。
（3）将三只试管分别加入不同pH值的缓冲溶液（pH 4.0、pH 6.8、pH 8.0）。
（4）将三只试管放入恒温水浴锅中，在37℃下反应30分钟。
（5）用苯酚-硫酸法检测反应后的还原糖含量。
4. 激活剂和抑制剂对酶活力的影响实验（1）取两只试管，分别加入等量的淀粉溶液。
（2）向两只试管中分别加入等量的淀粉酶。
（3）向其中一只试管中加入适量的激活剂（如氯化钠），另一只试管中加入适量的抑制剂（如氢氧化钠）。
（4）将两只试管放入恒温水浴锅中，在37℃下反应30分钟。
（5）用苯酚-硫酸法检测反应后的还原糖含量。
酶工程实验碱性磷酸酶实验报告
猪肝中碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究实验报告摘要：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，简称ALP)广泛存在于微生物和动物体内，是一种非特异性磷酸单酯酶。
本实验材料取自猪肝，采用有机溶剂沉淀分离纯化其中所含的碱性磷酸酶，运用终止法和考马斯亮蓝法测定其酶活力和蛋白质含量。
根据酶活力变化，进行不同温度，PH对该酶的影响的实验，得出最适温度和最适PH。
关键词：碱性磷酸酶；有机溶剂沉淀；酶活力；PH；温度1 前言碱性磷酸酶是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。
碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。
而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。
本实验中所用的猪肝中的碱性磷酸酶含量颇高，且其活性可在较长时间内得以保持。
1.1实验目的掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法；酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算；了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。
1.2 实验试剂与仪器1.2.1 实验仪器电子天平；匀浆器；紫外可见分光光度计；高速冷冻离心机；PH计；磁力加热搅拌机1.2.2实验试剂及配制95%乙醇、丙酮、正丁醇、醋酸镁、醋酸钠、Tris、考马斯亮蓝G－250、硫酸镁、氢氧化钠（1）0.01mol/L醋酸镁－0.01mol/L醋酸钠混合溶液：取0.5mol/L醋酸镁20mL 及0.1mol/L醋酸钠100mL，混匀后加蒸馏水稀释至1000mL。
（2）0.01mol/L Tris-硫酸镁缓冲液（pH8.8）：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000mL，配制0.1mol/L Tris溶液；取0.1mol/L Tris溶液100mL，加蒸馏水约700mL，再加0.5mol/L醋酸镁20mL，混匀后用1%醋酸溶液调节pH至8.8，用蒸馏水稀释至1000mL即可。
酶工程实验报告六(纤维素酶的固定化及其性质测定)
3、用注射器将上述混合液取20ml（各取四次）逐渐滴入200mlCaCl2溶液的三角瓶中
6、反应混合物物保温30min后，于各个浓度底物试管中加入3mLDNS试剂终止液，迅速振荡均匀。
（1）于游离酶对照中加入0.5 ml的酶液。
（2）于固定化酶对照中加入2.00mLCMC-Na溶液。
7、混合后将各个实验组的三支试管沸水浴5min，自来水冷却后，加蒸馏水19.5mL。摇匀，在540nm处读取OD值。
④精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；
⑤避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；
5、实验结果与数据处理：
5.1实验数据与结果：
表一固定化酶（3.5%）与游离酶稳定性的比较
保温时间（min）
吸光度OD540、酶活（u/g）、相对酶活(%)
固定化纤维素酶酶
游离纤维素酶酶
10 0.0375 639.04 33.63 0.0585 7586.50 65.23
②酶稳定性比较：由图三可看出在反应30min以后，游离酶的酶活稳定性保持升高到40min达最大酶活，之后酶活（相对活性）急剧下降（曲线斜率较陡曲）；而固定化纤维素酶的酶活从20min后保持平缓的下降趋势（斜率较缓），即稳定性较高。
③不同浓度的海藻酸钙对固定化酶性质影响：随着海藻酸钙的浓度由：2.5%、3.5%、4.5%、5.5%升高，呈现增后减的趋势，固定化纤维素酶酶活性在3.5%达最大相对酶活性100%。
酶工程实验报告一
酶工程实验报告一一、实验目的本次酶工程实验的主要目的是通过实际操作，深入了解酶的性质、作用机制以及酶的分离纯化和活性测定方法。
同时，培养我们的实验操作技能、观察分析能力和科学思维方法，为今后从事相关领域的研究和工作打下坚实的基础。
二、实验原理酶是一种具有生物催化功能的蛋白质或 RNA 分子。
它们能够在温和的条件下高效地催化各种化学反应，具有高度的特异性和催化效率。
本实验中所涉及的酶主要是蛋白酶和淀粉酶。
蛋白酶能够水解蛋白质中的肽键，将蛋白质分解为小分子肽和氨基酸。
其活性可以通过测定水解产物的生成量或底物的消耗量来进行评估。
淀粉酶能够水解淀粉分子中的α-1,4 糖苷键，将淀粉分解为麦芽糖和葡萄糖等小分子物质。
其活性通常通过测定淀粉的水解程度来确定，常用的方法是碘量法。
酶的分离纯化是基于酶与杂质在物理化学性质上的差异，如溶解度、分子大小、电荷性质等，采用一系列的分离技术，如沉淀、层析、电泳等，逐步去除杂质，获得高纯度的酶。
三、实验材料与设备1、实验材料蛋白酶提取液淀粉酶提取液酪蛋白淀粉溶液福林酚试剂碘液其他化学试剂2、实验设备离心机分光光度计恒温水浴锅移液器电泳仪层析柱四、实验步骤制备酪蛋白底物溶液：称取一定量的酪蛋白，用氢氧化钠溶液溶解，调节 pH 至适宜值，定容备用。
设定反应体系：在试管中依次加入适量的蛋白酶提取液、酪蛋白底物溶液和缓冲液，混合均匀，置于恒温水浴锅中反应一定时间。
终止反应：反应结束后，加入三氯乙酸溶液终止反应。
测定吸光度：离心去除沉淀，取上清液，加入福林酚试剂显色，在分光光度计上测定吸光度。
计算蛋白酶活性：根据标准曲线计算出反应生成的酪氨酸量，从而计算出蛋白酶的活性。
2、淀粉酶活性的测定制备淀粉溶液：称取一定量的淀粉，用缓冲液溶解，加热糊化，冷却后定容备用。
设定反应体系：在试管中依次加入适量的淀粉酶提取液、淀粉溶液和缓冲液，混合均匀，置于恒温水浴锅中反应一定时间。
终止反应：反应结束后，加入碘液终止反应。
酶工程实验报告
酶工程实验报告指导老师：学号：20070830姓名：班级：生物技术班**师范大学生命科学学院07级2010-11-15生物工程实验指导（酶工程部分）实验一木瓜蛋白酶的分离纯化及酶活检测一、概述以半胱氨酸内肽酶为主（包括木瓜蛋白酶，简称PAP、木瓜蛋白酶Ω，简称CAR、木瓜凝乳蛋白酶，简称CHP和木瓜凝乳蛋白酶M，简称GEP）的木瓜蛋白酶是从植物番木瓜中分离纯化而得的一种混合酶。
这种酶广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中以为成熟的果实乳汁中含量最高，约占乳汁干中的40%。
其最大的用途是在食品工业方面，防除啤酒冷藏混浊，嫩化肉类，生产调味品，烘烤面包，乳酪制品及谷类和速溶食品的蛋白质强化生产。
在动物饲料加工方面，用于鱼蛋白浓缩物和油籽饼处理，能提高氮的可溶性指数和蛋白质的可分散指数。
少量在皮革工业作软化剂、纺织工业作丝织品脱胶清洁剂和废胶卷回收报等。
在医药方面，主要用于治胃炎、消化不良以及用于肉赘摘除、伤痕处理、脱毛、清洁皮肤和新近的裂腭整形外科及制木瓜凝乳蛋白酶注射剂治疗脊骨盘脱出症等。
木瓜蛋白酶是一种巯基蛋白酶，其专一性较差，能分解比胰脏蛋白酶更多的蛋白质。
木瓜蛋白酶是单条链，有211个氨基酸残基组，相对分子量23000。
木瓜凝乳蛋白酶，相对分子量36000，约占可溶性蛋白质的45%。
溶菌酶，相对分子量2500，约占可溶性蛋白质的20%。
木瓜蛋白酶为白色、淡褐色无定型粉末或颗粒。
略溶于水、甘油，不溶于乙醚、乙醇和氯仿。
水溶液无色至淡黄色，有时呈乳白色。
最适pH为5.0～8.0，微吸湿，有硫化氰臭。
最适温度65℃，易变性失活。
木瓜蛋白酶等电点pH＝9.6。
半胱氨酸、硫化物、亚硫酸盐和EDTA是木瓜蛋白酶激活剂，巯基试剂和过氧化氢是木瓜蛋白酶的抑制剂。
二、实验目的1、学习和掌握木瓜蛋白酶分离纯化的原理、方法和工艺过程，包括盐析、酶活力保护、结晶与重结晶。
2、掌握木瓜蛋白酶活力的测定方法和原理。
酶活性大学实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解酶的催化作用原理。
2. 掌握测定酶活性的方法。
3. 探究温度、pH值、底物浓度、酶浓度、抑制剂和激活剂等因素对酶活性的影响。
二、实验原理酶是一种具有催化功能的蛋白质，能够加速化学反应的速率。
酶的活性受到多种因素的影响，如温度、pH值、底物浓度、酶浓度、抑制剂和激活剂等。
本实验通过测定酶催化特定反应的速率，分析不同因素对酶活性的影响。
三、实验器材与试剂1. 实验器材：试管、烧杯、量筒、胶头滴管、恒温水浴锅、秒表、pH计、温度计、冰箱、显微镜等。
2. 试剂：淀粉酶、淀粉溶液、碘液、氢氧化钠、盐酸、葡萄糖标准液、葡萄糖氧化酶、磷酸盐缓冲液、硫酸铜、氯化钠等。
四、实验步骤1. 温度对酶活性的影响（1）分别配制不同温度（如0℃、20℃、40℃、60℃、80℃）的淀粉酶溶液。
（2）取等量淀粉溶液，分别加入上述不同温度的淀粉酶溶液，混匀。
（3）观察淀粉溶液在酶作用下的颜色变化，记录所需时间。
2. pH值对酶活性的影响（1）分别配制不同pH值（如2、4、6、8、10）的淀粉酶溶液。
（2）取等量淀粉溶液，分别加入上述不同pH值的淀粉酶溶液，混匀。
（3）观察淀粉溶液在酶作用下的颜色变化，记录所需时间。
3. 底物浓度对酶活性的影响（1）配制不同浓度的淀粉溶液。
（2）取等量淀粉酶溶液，分别加入上述不同浓度的淀粉溶液，混匀。
（3）观察淀粉溶液在酶作用下的颜色变化，记录所需时间。
4. 酶浓度对酶活性的影响（1）配制不同浓度的淀粉酶溶液。
（2）取等量淀粉溶液，分别加入上述不同浓度的淀粉酶溶液，混匀。
（3）观察淀粉溶液在酶作用下的颜色变化，记录所需时间。
5. 抑制剂和激活剂对酶活性的影响（1）分别配制含有不同抑制剂（如硫酸铜、氯化钠）和激活剂（如氢氧化钠、盐酸）的淀粉酶溶液。
（2）取等量淀粉溶液，分别加入上述不同抑制剂和激活剂的淀粉酶溶液，混匀。
（3）观察淀粉溶液在酶作用下的颜色变化，记录所需时间。
关于酶的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解酶活性的概念及其测定方法。
2. 掌握酶活性测定的原理和操作步骤。
3. 通过实验，了解影响酶活性的因素。
二、实验原理酶是一种生物催化剂，具有高效、专一、温和等特性。
酶活性是指酶催化反应的能力，通常用单位时间内酶催化底物转化的量来表示。
本实验采用紫外分光光度法测定酶活性，通过测定酶催化反应过程中某一特定波长下吸光度的变化，来计算酶活性。
三、实验材料1. 试剂：磷酸缓冲液（pH 7.0）、底物溶液、酶溶液、标准曲线试剂。
2. 仪器：紫外分光光度计、恒温水浴、移液器、试管等。
四、实验步骤1. 标准曲线绘制：配制一系列已知浓度的标准溶液，分别测定其在特定波长下的吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 酶活性测定：取一定量的酶溶液，加入适量的底物溶液，在恒温水浴中反应一段时间，测定反应体系中某一特定波长下的吸光度。
3. 酶活性计算：根据标准曲线，计算酶催化底物转化的量，进而计算酶活性。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：根据实验数据绘制标准曲线，确定吸光度与浓度的线性关系。
2. 酶活性测定：根据实验数据，计算酶活性。
3. 影响酶活性的因素分析：（1）温度：在不同温度下进行酶活性测定，分析温度对酶活性的影响。
（2）pH值：在不同pH值条件下进行酶活性测定，分析pH值对酶活性的影响。
（3）底物浓度：在不同底物浓度下进行酶活性测定，分析底物浓度对酶活性的影响。
六、实验讨论1. 实验过程中，注意控制实验条件，如温度、pH值等，以确保实验结果的准确性。
2. 酶活性测定结果受多种因素影响，实验过程中应充分考虑这些因素。
3. 通过本实验，掌握了酶活性测定的原理和操作步骤，了解了影响酶活性的因素。
七、实验总结通过本次实验，我们了解了酶活性的概念、测定方法及其影响因素。
在实验过程中，我们掌握了紫外分光光度法测定酶活性的原理和操作步骤，为后续相关实验奠定了基础。
同时，我们还认识到实验过程中应严格控制实验条件，以确保实验结果的准确性。
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酶工程实验报告指导老师：学号：20070830姓名：班级：生物技术班**师范大学生命科学学院07级2010-11-15生物工程实验指导（酶工程部分）实验一木瓜蛋白酶的分离纯化及酶活检测一、概述以半胱氨酸内肽酶为主（包括木瓜蛋白酶，简称PAP、木瓜蛋白酶Ω，简称CAR、木瓜凝乳蛋白酶，简称CHP和木瓜凝乳蛋白酶M，简称GEP）的木瓜蛋白酶是从植物番木瓜中分离纯化而得的一种混合酶。
这种酶广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中以为成熟的果实乳汁中含量最高，约占乳汁干中的40%。
其最大的用途是在食品工业方面，防除啤酒冷藏混浊，嫩化肉类，生产调味品，烘烤面包，乳酪制品及谷类和速溶食品的蛋白质强化生产。
在动物饲料加工方面，用于鱼蛋白浓缩物和油籽饼处理，能提高氮的可溶性指数和蛋白质的可分散指数。
少量在皮革工业作软化剂、纺织工业作丝织品脱胶清洁剂和废胶卷回收报等。
在医药方面，主要用于治胃炎、消化不良以及用于肉赘摘除、伤痕处理、脱毛、清洁皮肤和新近的裂腭整形外科及制木瓜凝乳蛋白酶注射剂治疗脊骨盘脱出症等。
木瓜蛋白酶是一种巯基蛋白酶，其专一性较差，能分解比胰脏蛋白酶更多的蛋白质。
木瓜蛋白酶是单条链，有211个氨基酸残基组，相对分子量23000。
木瓜凝乳蛋白酶，相对分子量36000，约占可溶性蛋白质的45%。
溶菌酶，相对分子量2500，约占可溶性蛋白质的20%。
木瓜蛋白酶为白色、淡褐色无定型粉末或颗粒。
略溶于水、甘油，不溶于乙醚、乙醇和氯仿。
水溶液无色至淡黄色，有时呈乳白色。
最适pH为5.0～8.0，微吸湿，有硫化氰臭。
最适温度65℃，易变性失活。
木瓜蛋白酶等电点pH＝9.6。
半胱氨酸、硫化物、亚硫酸盐和EDTA是木瓜蛋白酶激活剂，巯基试剂和过氧化氢是木瓜蛋白酶的抑制剂。
二、实验目的1、学习和掌握木瓜蛋白酶分离纯化的原理、方法和工艺过程，包括盐析、酶活力保护、结晶与重结晶。
2、掌握木瓜蛋白酶活力的测定方法和原理。
三、能力培养目标1、蛋白质分离纯化的工艺流程，特别是盐析操作技术的熟练掌握；2、酶活力检测方法的掌握。
四、实验难点采用盐析分离纯化技术制备酶类产品时如何保证酶活力的同时提高酶产品的得率。
五、实验方式、方法建议1、集中式训练：学生在老师的讲解和指导下按如下步骤操作训练；2、启发和探索式：老师提供木瓜蛋白酶的理化、生物学特性、相关分离纯化技术和工艺，让学生查阅资料，然后在下面生产工艺基础上进行一些工艺和操作参数的试验，比如在（NH4)2SO4分级分离后采用层析分离或透析，试验层析或透析操作参数和比较集中工艺的优劣，以培养学生灵活运用分离纯化技术的能力。
六、实验原辅材料和仪器设备1．原辅材料（1）木瓜乳汁的采集及采后处理在清晨或中午下雨后，选择2.5～3月龄已充分长大的青木瓜，用锋利刀片在未成熟的青果表面纵割3～4条线，下刀深度在2mm深以内，环绕茎干装一倒伞型收集盘，接收流下的乳汁。
割后30～60s乳汁停止流出，把粘在果上的乳汁赶入收集盘。
用浸过硫酸钙或杀菌剂溶液的洁净布擦果，防切口感染。
（2）硅藻土和河沙：硅藻土选用化学纯试剂，河沙经清洗、浮选、烘干后过60～80目筛。
（3）半胱氨酸、（NH4)2SO4和NaCl均选用化学纯试剂。
（4）酶稀释液：半胱氨酸0.03mol/L（0.1537g）、EDTA.2Na0.00603mol/L（0.0935g），两者分开用适量蒸馏水溶解，再将EDTA.2Na溶液倒入半胱氨酸溶液中，使其溶解，调节至pH 4.5，定容至25ml。
（5）酪蛋白溶液(底物)：称磷酸氢二钠1.447g加蒸馏水约80ml，溶解后加入0.80g酪蛋白，水浴上加热搅拌溶解，待完全溶解后，冷至室温，调pH至7.0，定容至100ml，摇匀。
（6）TCA溶液(变性剂)：称三氯醋酸(TCA)2.247g，乙酸钠1.824g，冰醋酸2g，定容至l00ml。
（7）酪氨酸标准液(50μg/ml)：称105℃烘至恒重的酪氨酸5.0㎎，用0.1 mol/L HCl 定容至100ml。
2．主要仪器设备：研钵、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、恒温水浴锅。
七、训练内容和步骤1、木瓜蛋白酶的分离纯化（下午组数据）(1)粗提：木瓜乳汁100g(实验中28.8g)、硅藻土50g(14g)和筛选过的砂子75g(21.8g)混匀，在室温下加100ml-150ml（50ml）半胱氨酸溶液(0.04mol/L，pH5.7)，，在研钵中充分磨匀，静置后倾出上清液，再用150ml（50ml）半胱氨酸溶液重复研磨和洗提，然后用半胱氨酸溶液定容到500ml（166ml）(粗体积)，用布氏漏斗过滤。
以下几步尽量在冰浴上进行。
(2)除不溶物：取50ml滤液于小烧杯中，在搅拌下慢慢加入1mol/LNa0H溶液调pH至9.0，用36个1.5ml离心管盛装，离心(4℃,8000rpm／min，10min)，取上清液。
(3)（NH4)2SO4分级分离：取38ml上清液于小烧杯中，加入9.23g(NH4)2SO4至40%饱和溶液（1L：243g），静置2h。
离心(4℃,8000rpm／min，10min)，弃上清液，用饱和(NH4)2SO4溶液洗沉淀一次，剩6管。
(4)NaCl分级沉淀：加半胱氨酸溶液(0.02mol/L，pH7.0)至满管，慢慢加入0.12g固体NaCl，静置lh，离心(4℃,8000rpm/min，20min)弃上清液。
(5)结晶：在沉淀中加半胱氨酸溶液(0.02 mol/L，pH5.7)至满管，立即调pH至6.5，静置30min，置于4℃下过夜，在4℃下离心(8000rpm/min，25min)，收集结晶。
(6)重结晶：将上述结晶在室温下溶于少量蒸馏水(蛋白酶浓度约1%)。
在搅拌下慢慢加入饱和NaCl溶液(10ml／300ml蛋白溶液)，当约75%的溶液加入后。
木瓜蛋白酶将开始结晶，置于4℃下过夜，收集结晶。
2、木瓜蛋白酶活性测定(1)样品处理：在盛装结晶（样重约0.01g）的1.5ml离心管中加入酶稀释液500ul，混匀盖严，将酶激活15min以上(激活时半胱氨酸的浓度要高于0.03mol/L，而且要当天配制，激活的酶最好在2h内测完)备用。
(2)木瓜酶活力测定：将已激活的酶液置于37℃水浴保温10min ,吸取预热37℃酪蛋白液500ul加入此管，在37℃反应10min,立即加入300ul，TCA摇匀；另取已激活的样液500ul，加入300ul TCA，37℃保温10min后立即加入预热37℃酪蛋白液500ul，摇匀。
以后管为对照，测前管的OD275值，即A=1.581。
另取酪氨酸标准液，以蒸馏水作空白对照，测OD275值，即As=0.318。
As：50ug/ml酪氨酸的光吸收值；A：1ml激活酶作用于底物所得产物的光吸收值；50：标准酪氨酸的微克数/毫升；10：反应时间(min)；500：酶第一次稀释倍数(定容体积)；3:激活时酶液的稀释倍数；11：测定时酶液的稀释倍数。
八、实验结果与讨论1、记录木瓜蛋白酶工艺、操作条件、各原辅材料和试剂用量。
盐析沉淀法是许多蛋白酶初步纯化阶段又一经常采用的方法。
其原理为中性无机盐离子在较低浓度时会增加蛋白质的溶解度，但当盐浓度增加到一定的程度时盐离子与蛋白质表面具有相反电荷的离子基团结合使排斥力减弱而凝聚，同时，蛋白质表面的水化膜被破坏而引起蛋白质的沉淀。
本实验盐析使用的中是性盐有硫酸铵和NaCl。
2、记录产品的形态及产品的重量。
它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。
约重0.01g3、计算木瓜蛋白酶的产量、酶活力和实际得率。
A=1.581。
As=0.318。
酶活力=41016509（u/g）4、对上述分离纯化方法进行评价。
木瓜蛋白酶的活力是41016509（U/g）。
A的吸光值大于1，可能不会特别准确。
会出现误差，看能否通过稀释来解决该问题。
酶稀释液又不容物存在，可能的原因有：pH不合适；药品本身的原因；药品混合的顺序不对；溶解时需要加热或者超声波处理等。
提高溶液浓度可能更加有利于结晶和重结晶，以及沉淀等。
实验二尼龙固定化木瓜蛋白酶及其应用研究实验目的：1、掌握尼龙为载体戊二醛为交联剂对木瓜蛋白酶进行固定化的方法。
2、了解检验固定化酶活力的方法。
一、材料与主要试剂尼龙(6)或(66)，市售140目。
木瓜蛋白酶，本室制备，比活力205 U/mg蛋白。
啤酒。
酪蛋白(进口分装)，戊二醛(E . Meyck)，考马斯亮蓝G-250(sigma)等均为生化试剂或分析纯试剂。
二、方法1、固定化木瓜蛋白酶制备将尼龙布剪成约2g左右的小方块，置于干净培养皿中，用含18.6% CaCl2和18.6%水的甲醇溶液处理10min，洗净吸干。
再用3.65mo1/L HCl水解45min，洗至pH中性，吸干。
用5%戊二醛(25%水的戊二醛溶液和硼酸缓冲液配制)20℃交联20min，用0.1 mol/L pH7.8磷酸缓冲液洗除多余戊二醛。
将2g（一小块）处理尼龙布剪成小块放入1.5ml离心管中，立即加入1mg/mL酶液(0.1g木瓜蛋白酶溶于0.1 mol/L pH 7.2磷酸缓冲液并定容至100mL，活力44.7U/mL，比活力205 U/mg蛋白)至满管，置于4-15℃冰箱中固定3h。
用0.1 mol/L pH7.5磷酸缓冲液(含0.5mo1/L NaCl)洗至洗脱液在280nm波长处无光吸收，木瓜蛋白酶即固定在尼龙布上。
2、酶活力及蛋白质含量测定取O.1mL酶液加入0.9mL激活剂(上述缓冲液内含20 mmol/L Cys, 1 mmol/L EDTA)37℃保温恒定，加人同样预热的 1 %(W/V)酪蛋白溶液(上述缓冲液配制))1 mL,37℃反应10min，加人3mL10%三氛乙酸((TCA)溶液终止反应(对照管先加TCA，后加底物)。
275nm波长下比色。
在上述条件下每增加1个光吸收单位的酶量为1个酶活力单位(U)。
取0.1g固定化酶加入1mL 激活剂其余同溶液酶活力测定。
蛋白质含量测定，按考马斯亮蓝G-250法。
3、考马斯亮蓝G-250法称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶解于50mL95%乙醇中，再加入100 mL85%（W/V）的磷酸，混匀，配成原液。
临用前取原液15mL，加蒸馏水稀释至100mL,双层滤纸过滤，即为缓冲液A，4℃保存。
0.5mg/mL标准牛血清白蛋白溶液的配制：准确称取5mg牛血清白蛋白，溶解于适量的蒸馏水后，用缓冲液A定容至10mL。
（1）牛血清白蛋白标准曲线的测定取6支试管，按下表加入标准蛋白溶液和缓冲液A。
管号0 1 2 3 4 5标准蛋白溶液/uL 0 40 80 120 160 200缓冲液A/ uL 500 460 420 380 340 300标准蛋白含量/mg.mL-10 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20在各管中分别加入5mL缓冲液A，混匀，室温放置2min。