内毒素的检测和去除

1 内毒素及其来源

1.1内毒素

内毒素（endotoxin）是存在于革兰氏阴性菌细胞壁外膜表面的一种大分子物质，一般只有在细胞死亡或分解时自行释放到周围介质中，特殊条件下也可以从活细胞中直接泄漏出来。内毒素又被称为热原，是一种脂多糖物质，具有耐热性，不易被去除。若疫苗中存在一定浓度的内毒素，接种动物后，可引起动物发热，休克等，严重时甚至造成死亡。

1.2内毒素的来源

因为革兰氏阴性菌无处不在，所以内毒素几乎存在于任何地方。在疫苗生产中一定要重视和尽可能减少内毒素的污染。

生产用水中内毒素的含量是导致疫苗安全性的关键因素之一。大量研究表明，疫苗生产过程中内毒素主要来源于培养液和配制用水，其在贮存过程中易受到革兰氏阴性菌的污染。贮水罐，纯水系统的过滤器和连接管道，以及培养液容器等都可能受到革兰氏阴性菌的污染。工作人员进出车间携带的物品，以及空气净化系统久不维护，都有可能造成生产车间内的空气尘埃浓度升高，导致内毒素污染。

生产用具、管道、泵、阀门、滤器等的清洗消毒不彻底也会造成内毒素污染。生产原料的污染，如血液制品，细胞培养基。人为操作不规范也会引起内毒素污染。

2内毒素的检测

目前，内毒素的检测方法较多，但是各存在利弊，因此，选取检测方法要根据实际需求，不建议采取单一的检测方法。

2.1鲎试验法

鲎试验法是通过酶的级联反应而实现，内毒素在二价阳离子的参与下激活C因子（FC），然后激活其它酶原，产生一系列凝集酶反应。该方法是目前检测内毒素最特异和最灵敏的方法。

2.2重组C因子法

重组C因子法是使用一个单一的蛋白（重组C因子）作为有效活性成分。反应中内毒素激活重组C因子，活化的重组C因子将荧光底物裂解，产生荧光复合物，定量检测荧光复合物来量化内毒素。这种方法可有效避免假阳性的产生。该方法可用于药品生产，环境，器械生产中的内毒素检测。

2.3热原试验法

该方法是比较广泛的检测热原的方法，利用微量内毒素可引起动物体温升高的特性来测试其含量。这种方法存在灵敏度低，无法定量测定，种属差异大，周期长等问题。

2.4其它方法

除了上述较常见的方法外，还有一些方法也被应用于内毒素的检测，如免疫学方法（酶联免疫吸附检测法，火箭免疫电泳鲎试验法，双抗体夹心ELISA法等），生物学方法，化学发光法，流式细胞法，高效液相色谱法等。

3内毒素的去除

一直以来，去除内毒素都是疫苗生产中的一个难题。其热稳定性高，对PH值不敏感。目前，已有一些去除内毒素的方法，但其去除方法还有待进一步研究。

3.1超滤法

利用内毒素与其他物质的分子量的差别来去除内毒素。一般在样品流经超滤膜时，超滤膜将内毒素截留在膜上，而让其它低分子量物质透过，从而有效控制内毒素的含量。超滤膜的内毒素去除率较高，变化范围较宽，高达%，低至%。因热原是一类形态和相对分子质量均不确定的物质，其种类，浓度也会有所不同，因此内毒素的去

除率也是由多种因素所决定，如超滤运行的压力，超滤浓缩的倍数，超滤洗脱的体积等。由于内毒素聚合体可能会在高温或酸性环境中分解，进而造成内毒素分子的真正毒性部分类脂A穿过滤膜而进入滤液中。该方法去除内毒素，抗原损失较少，并且富集样品，能够满足疫苗生产的要求。

3.2活性炭法

该方法主要适用于水等组分简单的小分子溶液的内毒素去除。因其选择性能差，易吸附有效成分，一般较少用。该方法可与超滤法联合使用去除内毒素的效果较佳。

3.3热处理法

该方法主要用于耐热物品内毒素的去除。

3.4化学降解法

使用强酸，强碱或氧化剂使内毒素自身降解，从而去除内毒素。

3.5亲和膜分离系统法

此法基于亲和色谱法，以纤维素膜等做基础材料，通过化学的方法键合不同的配基，这些配基对内毒素分子或聚集体有较强的吸附作用。此法吸附特异，吸附量大，去除率高，膜可再生，且具备一定的耐酸耐碱性。

3.6其它方法

吸附技术和双向萃取法也用于去除内毒素，但这两类方法涉及的试剂，步骤较多，易造成污染，使用较少。