RT-PCR实验心得

RT-PCR实验心得

■提取RNA(我做细胞的)

1.取中号培养瓶(100ml培养瓶注:此时细胞汇合度≥80%),用PBS洗细胞两次，弃尽PBS后加2mlTRIzol（量大无防！）, 细胞用用吹打管吹至液体澄清且无细胞团块转至2个管中.

2.颠倒摇晃10下，室温5分钟.

3.在2个EP管中各加入ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒并将其在30°C下孵育2—3分钟。

4.在2—8°C下用不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。

5.用移液枪分别转上层水相（约500-600μl）于另二个管中,加等体积异丙醇（约500-600μl），混匀室温10分钟来沉淀RNA→在2—8°C 下以不超过12,000×g 的离心力高速冷冻离心10 分钟。注:移液枪的枪头不宜伸入液面太深,以防洗上中层液体!;离心前注意放管的方向,此时RNA沉淀形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。

6.舍弃上清,用75%的乙醇(用DEPC水处理的,临时十分钟配,预冷保存于4°C或-20°C) 1 ml来洗涤RNA沉淀→在2—8°C下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟。;离心前注意放管的方向,

注:旋涡振荡混合样品;RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年!

7 弃上清，置于卫生纸上，自然晾干（不能完全干燥）,用20-50μl DEPC水溶解。(建议装于的EP管中.)

8紫外光度检测

注:该步后,可保存于-70℃超低温冰箱,或算好计量建立体系立即用于逆转录.

■RT反应体系注意事项

试剂盒中试剂解冻后, 摇晃试管使其均匀,在稍离心,放于冰盒上.反应也在冰上操作.

2 PCR仪预热到50°C,在放PCR管于PCR仪上(之前在冰上!)开始逆转录.

3反应体系准备:比原体系大10%;建立25ul的反应体系;先按总反应体系混合总体体系反应物,在分装于PCR管中(分装前宜离心!),再分别加RNA和引物/内参;

4 RNA的量宜大2ug/reaction!

5 要有要有逆转录(50℃,30min)和初始热活化(95℃, 15 min);

反应体系要搞清!

2、6×缓冲液上样缓冲液(4℃保存)

■% / %:琼脂糖凝胶的配制及用法:

找干净的容积大约为100ml的瓶子,加琼脂糖再加50ml电泳缓冲液(或:琼脂糖+100ml电泳缓冲液)，微波炉中火60秒至沸腾，取出,熔化的琼脂物冷却,用1ml 的移液枪,取琼脂糖凝胶封底后将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。(注意:加槽的注意事项(平行放;滴/泡沾缓冲液);取槽时的注意事项; 先取出凝胶盒,放侧板和梳子,在封底凝固后,到入凝胶,跑电泳时在取梳和侧板,此时凝胶和电泳液相混!注意不要有气泡! )

■PCR产物电泳

取目的基因RT-PCR产物各10μl及内参RT-PCR产物各5μl加已点在纸上的(只要干净即可!)溴酸兰(即6×缓冲液上样缓冲液)量大约1-2ul(量宜大不宜小,否则难以下沉)，反复吸打混匀(操作时注意事项:不要有气泡,关键是不要压枪到头!)用移液枪滴加到小槽内(操作的注意事项,伸入液面下,但不要碰到胶!) 后进行电泳! Maker的不加,直接移液枪滴加到小槽内.

■SYBR ■SYBR Green I染色方法

1配制: 用PH - 的缓冲液（如：TAE，TBE 或TE），按照10000：1的比例稀释SYBR GreenⅠ浓缩液，混匀，制成染色溶液。TBE pH的要求: - (最好pH .用水配稳定性不好(要在24h内用!)!配液时双层戴手套,试剂要常温解冻,离心再配!

2.保存:塑料和tip头盒中避光保存,不要放在玻璃容器中

3.方法:将染色溶液倒入合适的聚丙烯容器中，放入凝胶，用铝箔等盖住容器使染料避光。室温振荡染色10-30分钟，染色时间因凝胶浓度和厚度而定。(可保存一周多,重复用4次!)

为10mA，电源100V，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。

■实验前期准备

预防RNA酶污染:

* 全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。

* 使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A或T1来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品（如自动吸管）可能富含RNA酶。* 在TRIZOL中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。

其他注意事项

* 当TRIZOL用量少于2ml时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。

* 当TRIZOL用量较大时，可以使用玻璃试管(Corex)或聚丙材质试管，事先检验以确保该试管可以耐受加

入TRIZOL和氯仿后12,000×g的离心力。不可使用有裂缝或者破损的试管。

* 离心前小心平衡试管。

* 离心前玻璃管口必须盖上铝箔并用石蜡膜封口，聚丙烯管必须盖紧。

■RNA抽提指南

注意：用TRIZOL抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。所有的操作应该在15 -30℃的条件下完成，试剂亦在15-30℃的条件下。

实验前准备工作：

一实验器具与材料：

1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl

2、吸头：1ml、200μl、20μl

3、匀浆管：5ml

4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个

5、EP管：、、100μl

6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）

7、量筒：50ml、250ml、500ml

8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml

9、试管架：5ml、、20μl

10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水

11、铝制饭盒：4个

12、塑料小饭盒：1个

13、大瓷缸：2个

14、锡泊纸：一卷

15、卷纸：2卷

16、三角烧瓶：带盖，稍大

17．新开包的手套（全程戴!）

二、实验器具的处理与准备

1、塑料制品：（包括枪头、EP管、枪头盒、匀浆管等!）

先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需