生物传感器-2

3.2.4共价键合法


使生物活性分子通过共价键与不溶性载体结合而固定的方法。
载体包括无机载体和有机载体。 酶与载体共价键合方式：
与载体直接反应连接
通过同源双功能试剂与载体连接 通过异源双功能试剂与载体连接后再与载体反应连接
选择那种方法,要了解酶的氨基酸残基的反应性(reactivity)、 出现频率(frequency of occurrence)和可接近性(accessibility)。
三维空间结构的作用。
在酶的共价固定中，尤其是要保护活性中心.有两种方法：1)
共价反应前用酶的底物或是底物的类似物等将活性中心保护起来。 2)利用共价反应的化学选择性和生物特异性异源双功能试剂。 酶与载体之间的共价结合方式，主要有重氮法、肽键法、烷 化法等。如图所示：
O OH
CH3
N+ N
+酶
O OH
间，然后用透析法或凝胶过滤除去未结合的戊二醛即可得到酶结
合物。
在正常情况下，蛋白质只与一个戊二醛分子的一个醛基反应， 而第二个醛基不能与同一个或其他酶反应，即不发生聚合，故可 将戊二醛先与蛋白质反应，透析除去未反应的戊二醛，再加入抗
体，这样就不会产生聚合现象，此为二部交联法。
(2-aminoethy1)ferrocene
of 0.05M KH2PO4–NaOH buffer
solution (pH 7.5) with stirring. Then, 0.15 g of modified MPS was added to 30 ml of the stock solution with stirring at 4C for 3 h. The MPS-cytc solids were collected by filtration and dried under vacuum.
吸附的牢固程度与溶液的pH、离子强度、温度、溶剂性质 和种类以及吸附物的浓度有关。
3.2.3凝胶包埋法
将生物分子包埋并固定在高分子聚合物三维空间网状结构基 质中即为包埋法。 不产生化学修饰 保持生物分子活性 膜的孔径和几何形状可任意控制 被包埋物不易渗漏 分子可以在膜中扩散
分子量大的分子在膜中扩散困难
敏感膜
Schematic view of the steps leading from a solution t0 a mesoporous oxide network.
Adv. Mater. 2003,15,1933
Adv. Mater. 2003,15,1933
3.5.2固定化酶的动力学常数
底物所携带的电荷与载体所带的电荷相反,底物就会在载体周
微胶囊法 交联法
凝胶包埋法
3.2.1交心法
将生物活性材料封闭在双层滤膜之间,形象地称为夹心法.依 生物材料的不同而选择各种孔径的滤膜. 特点: 操作简单 不需要化学处理 固定生物量大 响应速度快 重现性好 适用于微生物和组织膜制作
3.2.2吸附法
经非水溶性载体物理吸附或离子结合作用使生物敏感元件固 定,称为吸附法. 吸附的作用力: 氢键 范德华力 离子键 配位键
The immobilization of cytc in MPS was achieved according to the following procedure. First, a 20mM cytc stock solution was prepared by dissolving 0.067 g of cytc in 270 ml
CH3
N
N
酶
重氮法
O OH
NH C NH 酶
O O C
NH + NH
酶
O O C
O O OH C NH 酶
N
酶
肽键法
Cl N
Cl N O C N C Cl C N + NH2 酶
C N
O
C N C
N
酶
烷化法
H
共价结合的特点
结合牢固、蛋白质分子不易脱落、载体不易降解、
寿命长
操作步骤多、酶活性受影响，所以制备具有高活来自涂酶层涂酶层 基片
基片 光聚合
紫外线照射 掩膜
基片 除掉未聚合的 光刻胶及酶膜 灭活酶 基片 图3-7 光致酶膜定位沉积
基片
活性酶
基片 图3-8 固定化酶的局部灭活法
3.5 固定化生物活性材料的性质
生物分子被固定后,性质会发生变化.酶变化的原因是:
1)载体与环境物质之间的静电作用和疏水作用使得酶周围环 境中反应物质或氢离子非均匀分布; 2)增加了底物和产物的扩散限制,它们的传质速率也发生变化; 3)酶分子构型发生变化,与之结合的载体对酶活动有一定空间
当酶促反应速率远低于底物扩散速率并且底物浓度足够大时， 酶促反应呈一级动力学，实验所测得的动力学参数为真实值。如 果在酶附近的底物浓度很低，酶促反应速率将受控于底物扩散的 限制。需要实验数据求得固定化酶的真实动力学常数。
第四章 电化学生物传感器之一：经典酶电极
4 .1概述
经典酶电极 第一代生物传感器 酶电极 介体酶电极 第二代生物传感器 直接电化学生物传感器 第三代生物传感器
微胶囊法主要采用脂质体(liposome)来包埋生物活性材料 或指示分子。脂质体是由脂质双分子层组成的内部为水相的闭 合囊泡.
质肢体的两个重要参数: 俘获容积:一定量脂质做包封的容积,单位是L/mol. 包裹效率:脂双层所包裹的水室所占的比例.
脂质体
磷脂双层分子膜 a)脂质体微胶囊膜结构
加入脂溶性物质
性的固定化酶比较困难。
3.2.5交联法
此法借助双功能试剂(bifunctional agents)使蛋白质结合到惰
性载体或蛋白质分子彼此交联成网状结构.
操作简单、结合牢固、在酶源较困难时常常需要加入数倍于
酶的惰性蛋白质作为基质。
严格控制pH，交联剂浓度也比较重要
3-5 双功能试剂
戊二醛交联法有一步法和二步法之分。一步交联法是把一定 量的酶，抗体和戊二醛同加入溶液中，在一定温度下反应一段时
障碍.
3.5.1 固定化酶的稳定性 酶的稳定性描述 1) 在低温和常温条件下长期保存的稳定性 2) 在较高温度条件下的稳定性
3) 固定化酶长期工作的稳定性
含有疏水基团的载体可能减少酶在保存过程中的自然失活
一定条件下,由于静电作用,亲水性载体可能增加酶的稳定性或降
低酶的稳定性 如果酶与载体结合后高级结构被稳定下来且酶的活性中心结构变 化不大,酶的稳定性会增加. 固定化对酶作用方式和专一性也有影响.载体基质的孔径和底物 的大小以及酶的固定化方式决定了底物扩散进入载体基质和抵达 酶活性中心的可能性,酶的作用有时仅仅局限与部分底物分子,在 极端的情况下,甚至连酶的专一性也会发生改变. 空间和扩散限制只发生在酶对大分子的作用
开始成为溶胶，进而生成具有一定结构的凝胶，最后经
过干燥和热处理得纳米粒子，即经由分子态→聚合体→
溶胶→凝胶→晶态(或非晶态)的过程。由于这种方法在
材料制备初期就在相当小的尺寸范围内进行控制，其均
匀性可达到亚微米级、纳米级甚至分子级的水平，因而 近些年来越来越受到人们的青睐。
Sol-Gel” refers to a process by which largely inorganic polymers are synthesized. A “Sol” is a dispersion of colloidal particles and a “Gel” is an interconnected polymeric network formed by the assembly of the sol.
第三章生物敏感元件的固定化 3.1概述
固定化的主要目的是将酶等生物敏感元件限制在一定的空
间,但又不妨碍被分析物的自由扩散.与游离相生物材料相比,固
相生物材料具有一系列优点: 1)热稳定性提高 2)可重复使用 3)不需要在反应后进行催化物质与反应物质的分离
4)可以根据已知的半衰期(half-life)确定传感器膜的寿命等.
3.2 基本方法
夹心法(sandwich)或隔离法(insulation)
包埋法(entrapment) 吸附法 (adsorption) 共价结合法(covalent binding) 交联法(cross linking) 微胶囊法(micro-encapsulation)
夹心法
吸附法
共价结合法
许多生物分子在洁净的水表面展开后能形成水不溶性液态单分子膜,小心压缩 表面积使液态膜逐渐过度到成为一个分子厚度的似固态膜,这种膜以技术的发明者 命名,称为LB膜. LB膜实验对液体的纯度、pH和温度有很高的要求 LB膜优点 可以制的很薄的膜，厚度和层数可控， 可获得高密度酶分子膜
LB膜制备:
是由铺膜、推膜、挂膜三个基本操作构成。 样品溶解在铺展溶剂中，铺展溶剂须要满足的的条件：对成 膜材料溶解性好，易铺展，挥发速度适中，密度相对较低，纯度 高和化学惰性。 基片常用的有玻璃、石英、铝蒸镀膜等。基片表面应光滑， 并避免油脂类污染。
a)表面的单分子膜
b)第一次抽出基片
c)第二次插入基片 图 3-6 典型LB膜的沉积过程
d)第二次抽出插片
３.4光平版印刷技术(Light lithographic)
光平版印刷术简称光刻(photoetching),利用照相原理与化
学腐蚀相结合,在工件表面制取精密、细微和复杂薄层图形,广泛
用于印刷电路和集成电路的制造以及印刷制版等过程.
脂质体微胶囊 包埋指示分子
脂溶性物质嵌入 脂质体膜 b)脂质体技术用于生物传感器原理
膜遭到破坏,释放指示分子, 给出信号
图3-3 脂质体微胶囊技术固定生物活性材料
3.2.7 溶胶-凝胶玻璃(sol-gel glass)
• 溶胶-凝胶法的化学过程是首先将原料分散在溶液中，
然后经过水解反应生成活性单体，活性单体进行聚合，
Schematic illustration of the hypothetical structure of a multilayer of GOx and 2-AF deposited on the Au electrode.
-NH2与-COOH的交联反应
-SH与maleimide
3.2.6微胶囊法
原理 利用光刻胶(photoresist)感光后因光化学反应而固化的特 点将掩模板(mask)上的图形刻制到被加工表面上.光刻胶是一类 对光敏感的高分子溶液,由感光树脂、增感剂和溶剂组成.光刻胶
经过光照射后,其理化性质(特别是溶解性和亲和性)发生明显变
化,经适当溶剂处理,溶去可溶性部分,得到所需要的图像. 负性胶:光照射后形成不可溶物质 正性胶:光照射后变成可溶物质
围富集,反之,底物浓度就会在固定化酶的微环境中下降. 底物扩散也是影响酶促反应的因素之一,分两个方面: 1)固相载体对底物扩散的阻碍作用，成为外部扩散限制(external diffusion limitation)
2)底物在载体内部扩散时因载体孔径大小不同遇到的阻碍作用，
成为内部扩散限制(internal diffusion limitation)
溶胶-凝胶前体+水+催化剂+溶剂 水解 溶胶 聚缩合 凝胶 蒸发干燥 干凝胶 超临界干燥
形成薄膜
气凝胶
图 3-4 溶胶-凝胶的一般过程
3.3 LB膜技术
生物传感器的响应速度和响应活性是一对相互影响的因素.
响应活性增高
固定量增大
膜厚度增加,响应速度减慢
LB膜的原理:
Langmuir-Blodgeett(LB)膜
反应性指氨基酸残基的反应活性，即氨基酸残基参与共价反 应的 活泼程度。具有反应能力的氨基酸残基称为反应性氨基酸。 反应性氨基酸常常含有容易对羰基发生亲核攻击的基团，如氨基、 巯基和羟基。它们的亲核反应速率又受到基团的亲核性、碱性以 及碳阳离子的亲电性等因素的影响。
可接近性是指是否能够抵达到蛋白质中的氨基酸残基所在的 位置，它与氨基酸残基的梳水性有关。一般而言，疏水性氨基酸 多分布在球蛋白分子表面，它们在水环境中能够起到维持蛋白质
电极过程由固定化生物膜和基础电极完成
电极过程由化学介体分子介导 酶分子被直接修饰在电极表面
4.2 基础电极
4.2.1 离子选择电极 离子选择电极(Ion selective electrode)是对特定离子产生选择 性响应的一类电化学传感器,其主要结构如图:
引出导线
电极帽
塑料内管 电极壳 内参比电极 内充液