第七节代谢控制育种

特 性： 1、结构与葡萄糖类似。
2、不被微生物代谢， 也不阻抑微 生物生长。
3、和葡萄糖 一样 会阻遏诱导酶的 合成，其 阻遏作用 甚至比葡萄糖还 要强。
筛选方法：
诱变 后的 菌株
培养基含有氮源、无机盐、生 长因子、低浓度的2－dG或3－ mG及一种生长碳源 ，该碳源
需诱导酶才能利用
涂布
验证
比不 较含
丙二酰CoA
脂肪酸
脂肪酸缺陷型
灰黄霉素 四环素 制霉菌素
抗生素产量受脂肪酸代谢途径 的影响
氯霉素产生菌初级代谢途径中的色氨酸、 酪氨酸、苯丙氨酸中的任何一个氨基酸 发生营养缺陷突变，都会使氯霉素产量 增加。
营养缺陷菌株还可以产生新品种。
金霉素第六个碳原子是由蛋氨酸供应， 若获得蛋氨酸缺陷型，结果产生去甲基 金霉素。
各
种抗性和耐性育种，回复突变子的应用
2. 截流或减少终产物堆积
借
助营养缺陷型或采用渗漏缺陷型
3. 移去产物
借
助膜透性突变
抗反馈调节突变株获得途径
（一）回复突变引起的抗反馈调节突变株 （二）耐自身产物突变株选育 （三）抗终产物结构类似物突变株的选育 （四）累积前体和耐前体突变株的选育
（一）回复突变引起抗反馈调节突变株
正向突变：
微生物从野生型经自然突变或人工诱 变突变成有益突变型。
回复突变：
当具有突变型基因的个体通过再突变 又变成野生型表型。
噬菌体敏感 野生型
噬菌体抗性 突变株
前后表型同，但实质有区别
噬菌体敏感 野生型表型
1、回复突变的原因
（1）原有基因的回复突变 （2）非原有基因的回复突变
原有基因位点 消除
原有基因不同 位点
（1）初级代谢途径障碍性回复突变型
原养型 诱变 营缺型 诱变 原养型
酶活力恢复，但调节中心已发生改变， 不能与阻遏物结合，因此解除了反馈调节机制
例： 5-磷酸核糖焦磷酸
次黄嘌呤核苷
酶缺失 酸
酶活力恢复， 调节中心改变
琥珀酸腺核苷 黄嘌呤核苷酸
酸
腺核苷酸
鸟核苷酸
（2）次级代谢途径障碍性回复突变
抗生素回复突变株
3.限制抗生素合成的诱导物 甲硫氨酸是头孢霉素和磷霉素的诱导物
色氨酸是麦角碱的诱导物，而磷酸盐是色氨酸 合成酶等的抑制剂；
4.抑制或阻遏磷酸酯酶类的合成 链霉素、紫霉素、新霉素等生物合成中某些
中间代谢产物需经磷酸化，因此从中间产物到 终产物需由磷酸酯酶类， 而磷酸盐抑制或阻遏 磷酸酯酶的合成。
例如磷酸盐明显抑制链霉素的生物合成通过抑 制形成链霉胍的三步 磷酸盐分解反应。
其特点是所需产物不断积累，不会因其 浓度超量而终止生产。
“抗反馈抑制突变型”
Structure gene
“抗阻遏突变型”
product NO
Enzyme 调节中心
Regulatory gene protein NO product
operator
在实际应用中，解除反抗调节可由 以下方面：
1. 从遗传上解除反馈调节
而回复突变导致合成氨基酸的酶的调节 中心变化，氨基酸能大量合成。
抗生素大量合成。
氨基酸
抗生素
甲硫氨酸 亮氨酸 缬氨酸
金霉素 放线菌素
（二）耐自身产物突变株选育
自身产物：初级代谢产物 次级代谢产物
大多数抗生素都受本身的反馈调节，特别是 氨基糖苷类抗生素。
提高耐受性就意味着提高抗生素的产量。 选育对抗生素不敏感、钝化酶活性高的菌株。 筛选：涂布于含自身抗生素的平板上，逐级
不同基因不同 位点
A基因 C基因
A B基因 C 真正回复突变
A
B
基因内抑制突变 C
抑制基因突变 B
区别基因回复突变和抑制基因突变，可以 将回复突变菌株和野生菌株进行回交试验或 杂交重组试验来观察它们的子代是否有突变 型出现：
杂交结果有同样的突变型重新出现，说明 回复突变和原来突变型不在同一座位上而是 分开的，属于抑制回复突变。反之，如果杂 交后代没有产生突变型，表明回复突变的座 位与原突变型基因位点相同，是真正的回复 突变。
1、在直线式生物合成途径中
谷氨酸
N-乙酰谷氨酸
N-乙酰-γ-谷氨酸磷酸
N-乙酰谷氨酸半醛
N-乙酰鸟氨酸
鸟氨酸
瓜氨酸 利用氨基酸缺陷型
精氨酰琥珀酸 突变株进行鸟氨酸
精氨酸
发酵
2、在分支生物合成途径中
脂肪酸
生物素
葡萄糖 乙酰辅酶A
柠檬酸
硫胺素
α酮戊二酸
谷氨酸
谷氨酸棒杆菌营养缺陷型产生L谷氨酸的生物 合成途径
磷酸盐对ATP调节：cAMP ATP
例如：灰色链霉菌静息细胞研究磷酸盐 对杀假丝菌素合成的影响。当加入 10mol//L磷酸盐后，5minATP增加5倍， 15min抗生素合成受抑制。
发酵中磷酸盐浓度控制在亚适量水平。
解除（抗）磷酸盐调节突变株的选育
灰色链霉菌
诱变后涂布于琼脂平 板
含10mol/LNa3PO4
这两种突变株在工业上都可能得到应用， 特别是在微生物酶制剂工业上。
Regulatory gene
repressor NO operator
operator NO repressor
筛选方法
1、限量诱导物法
诱变 恒化器
低乳糖浓 度
突变株不需诱导物也能合成 β- 半乳糖 苷酶，把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖作为 能源和代谢原料，而迅速生长。
在实际生产中，采用流加葡萄糖或应用混合 碳源可以控制中间代谢产物的积累，来减少不 利影响。
根本的解决办法是筛选抗碳源分解调节突变 株。
（一）解除碳源调节突变株的选育
筛选方法： 1、循环培养法
葡萄糖
乳糖
O-硝基苯
酚-β-D-半
突变株 野生株
乳糖苷
2、鉴别培养基 有半乳糖酶
喷ONPG，抗分解阻遏的菌落呈黄色，野
解除碳、氮、磷源分解调节突变株
营养缺陷突变株 渗漏缺陷突变株 回复突变株 耐自身代谢产物突变株 抗终产物结构类似物 耐前体物突变株 条件突变株
营养缺陷突变株 生物素、油酸、甘油缺陷型 温敏突变株
一、组成型突变株的选育
组成型突变株是指操纵基因或调节基因 突变引起酶合成诱导机制失灵，菌株不经 诱导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调 节突变型。
提高抗生素的浓度。
从土壤中筛选Aurdox 改良培养基和培养条件
紫外线诱变，零突变 紫外线诱变，回复突变
耐自身抗生素
20-40mg/L 500mg/L 0mg/L 600mg/L 1.6-2.5g/L
除耐受自身产物之外，还可以考虑与以下 情况结合进行：
1、抗Mg2+离子突变，根据以氨基糖苷类抗生 素为材料的研究， Mg2+可提高产生菌的耐 受性，以此设想筛选抗高浓度Mg2+的突变 株，如卡那霉素、新霉素、链霉素等培养基 中加入5~20mmol/L Mg2+能显著提高产生 菌自身耐受性。
第四节 代谢调节控制育种
代谢调节控制育种是通过特定突变型的选 育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产 物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜 的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。
外因控制 内因控制
培养调节 突变体
调节体系
诱导 分解阻遏 分解抑制 反馈阻遏 反馈抑制
细胞膜渗透性
育种措施
1组成型突变株的选育 2抗分解调节突变株的选育
脱敏感 突变
不含Na3PO4
底部加浸润250mm/L 磷酸盐的滤纸
敏感菌
三、营养缺陷型在代谢调节育种中 的应用
生物遗传学上：阐述代谢途径
工业微生物代谢控制育种上：筛选 到解除反馈的菌株。
（一）在初级代谢调节育种的应用
1. 阻断代谢流或切断支路代谢，使代谢途 径朝着有益产物合成方向进行。
2. 还可以通过营养缺陷型解除协同反馈效 应，降低终产物的数量，以累积支路代 谢中某一末端产物。
回复突变的测定
回复突变常发生在遗传物质没有明显获得或缺 失的点突变。
苏氨酸营 养缺陷型
基本培养基
抗链霉素细菌的回复突变
依赖性突变株：抗链霉素突变株中有少数必须 在有链霉素存在的时候才能生长。
诱变后 的菌株
不含链霉素
不含链霉素
含链霉素
含链霉素
依赖性突变株
含链霉素
2、回复突变引起的抗反馈调节突变株的 筛选
零变株：完全丧失产生抗生素的能力，但 回复突变株的产量往往比亲株高。
诱变
诱变
原养型
营缺型
原养型
例如金霉素、链霉素
诱变
诱变
原养型
零变株
原养型
一个共同的趋势：发生障碍性突变的营养缺 陷型，抗生素产量都比亲株抵，而回复突变株往
分往析比原 原养因型亲株高。
营养缺陷型菌株中，几种不能合成的 氨基酸与抗生素合成有关。基因突变的结 果，使菌体丧失了合成这些氨基酸的某种 酶的活力，导致抗生素产量 下降。
野生型菌株因缺少诱导物和相应的诱导 酶，不能利用乳糖而淘汰。
2、循环培养法
诱变
含诱导物
含诱导物
不含诱
不含诱
导物
导物
3、鉴别性培养基的应用
涂布
向菌落上喷射 O-硝基苯酚β-D-半乳糖苷
组成型 突变株
诱导型
诱变后的 以甘油为唯一碳源 孢子 原理 ： 组成型菌株在没有诱导物的作用下
仍能合成 β－半乳糖苷酶，将无色试剂水解 ， 放出 O－硝基苯酚。
水解蛋白10mg/ml
（三）磷酸盐对次级代谢的调节
机制
1.通过初级代谢的变化影响次级代谢 加强初级代谢，推迟抗生素合成的起
始。 磷酸盐是许多初级代谢反应酶的 效应物。
2.改变糖类分解代谢途径： 磷酸盐有利于糖酵解，从而降低了戊
糖途径的活力，导致以戊糖途径为先导 的抗生素合成受抑制。
例如：四环素、金霉素、土霉素、竹桃 霉素
选育有关抗分解调节的突变株，其实就 是筛选合成酶产生不受碳、氮、磷的代谢阻 遏或抑制的突变株，使抗生素提前到菌体生 长期开始合成，从而延长了产抗期而提高产 量。
（一）解除碳源调节突变株的选育
在次级代谢中，高浓度的葡萄糖对青霉素转 酰酶、链霉素转咪基酶和放线菌色素合成酶等 抗生素的关键酶均有分解阻遏作用。
四环素合成中，甲基化酶缺失，便形 成了去甲基四环素。
赤藓糖4磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸
例2 DAPH
邻氨基苯甲
莽草酸
酸
பைடு நூலகம்
L-对氨基 苯丙氨酸
L-苏对氨基 苯丝氨酸
分支酸 预苯酸 酪氨酸
色氨酸 PABA
杀假丝 菌素
氯霉素
苯丙氨酸
其它例子见p235
四、渗漏缺陷型在代谢调节育种的 应用
渗漏缺陷型：遗传代谢障碍不完全的突变型 特点：酶活力下降，但不完全丧失，能在基
含葡萄糖
不含 葡萄糖
含淀粉
（二）解除氮源分解调节突变株的 选育
次级代谢的氮降解物的阻遏主要指铵盐和其他 快速利用的氮源对抗生素生物合成具有分解调 节作用。
筛选芽孢杆菌中耐氨基酸菌株，是提高蛋白酶 产量的一种有效方法。因为高浓度氨基酸会抑 制芽孢的形成，并且阻遏蛋白酶的合成。
氨基酸1.5mg/ml
含阻遏物
阻
遏
物
例如： 桔林油脂酵母合成淀粉酶：玉米淀粉 、 酵母膏、蛋白胨及含有0.01%2dG的琼脂平板。
木霉合成 纤维素酶：含酸膨胀纤维素 、蛋白 胨、无机盐、胆汁 、防菌扩展剂、2-dG的琼 脂平板。
抗性突变株的性质
在2-dG或3-mG平板上生长的菌落接入斜面， 对它们在含阻遏物和不含阻遏物培养基中的产 酶能力比较，结果表明，大部分变株是抗分解 阻遏突变型，并发现它们在去除阻遏物的培养 基中酶活力往往高于野生型菌株。
本培养基上少量生长。 筛选方法：
营养缺陷型菌株 基本培养基
高丝氨酸营养缺陷型菌株赖氨酸的合成 途径
天冬氨酸
天冬氨酸半醛 高丝氨酸
脱氢酶 高丝氨酸
天冬酰胺
苏氨酸
高丝氨酸 脱氢酶活 力下降，
赖氨酸
没有完全
协同反馈抑制 丧失
五、抗反馈调节突变株的选育
抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢 反馈调节机制的突变型菌株。
例：
5-磷酸核糖焦磷酸
次黄嘌呤核苷酸
酶缺失
琥珀酸腺核苷酸 黄嘌呤核苷酸
协
同
反
腺核苷酸
鸟核苷酸
馈
谷氨酸棒杆菌的腺核苷酸、鸟核苷酸合成 代谢途径
高丝氨酸营养缺陷型菌株赖氨酸的合成 途径
天冬氨酸 同工酶
天冬氨酸半醛 高丝氨酸 脱氢酶 DES
高丝氨酸
天冬酰胺 赖氨酸
苏氨酸
协同反馈抑制
（二）在次级代谢育种中的应用
生 型是白色。
3、特殊氮源
组氨酸酶突变株
葡萄糖+组氨酸
分解代谢抑制物+唯一必须被分解的氮源
4、葡萄糖结构类似物
CHO H OH HO H H OH H OH
CHO HH HO H H OH H OH
CHO H OHO H3C-O H H OH H OH
CH2OH
CH2OH
CH2OH
葡萄糖 2-脱氧－葡萄糖 3－O－甲基－ 葡萄糖
4、筛选
将处理后的菌体移接到含有诱导能力 低，但能作为良好碳源的诱导物的培养 基中培养，突变体能良好生长，野生型 不能生长。 例：β-半乳糖苷酶组成突变株的筛选
底物采用苯- β-半乳糖
二、抗分解调节突变株的选育
抗分解调节突变株：指抗分解阻遏和分解抑 制的突变 （一）解除碳源调节突变株的选育 （二）解除氮源分解调节突变株的选育 （三）解除磷酸盐调节突变株的选育