第六章毛状根培养
6第六章_药用植物资源开发利用的途径和方法
药用植物栽培种类
古籍记载人工种植的中药材达200多种。 目前由野生种变家种或引种栽培的约 2000多种，其中家种成功的约1100多 种。 大面积常年栽培的有300为余种。
药用植物栽培种类
从国外引进成功变家栽的中药材20多种， 其中金鸡纳已在大面积种植生产。 正在由野生转家种的有防风、龙胆、肉 苁蓉、知母、猪苓、川贝母、紫草、柴 胡、天冬等。 对长春花、月见草等一些抗癌药材和治 疗心血管病的药材也进行了引种驯化工 作。
色药物资源。据全国中药资源普查表明：我国现有生 药达12807种，其中药用植物11146种，占87%；药用 动物1581种，占12%；矿物类药80种，不足1%。
生药产区
据资料分析我国生药产区，以云南省所产种类
最多，居全国第一位，约 5050余种；广西产
4590余种；四川（4354）、湖北（3970）、陕西 （3291）。
广西的蛤蚧、肉桂、罗汉果、石斛 ������ 天 ������ 安微的白芍、牡丹皮、菊花 广东的藿香、砂仁、槟榔、高良姜、巴戟
������
江苏的薄荷
生药资源的开发利用
“资源的开发” 是指人们对资源进行劳动，以达到 利用采取
的措施。 “资源的利用 ”是指人们对已开发出 来的资源进行一
定目的的使用，如进行加工和制成新 产品等。 “生药的开发利 用” 主要是以药物为主并进行 其它如保健品、饮料、化妆品、 香料、色素、矫味剂、 农药等多方面、多层次的开发和综合利用。
综合科学研究 （三级开发）
第三节 开发药用植物新资源的途径和方法
主要途径和方法
一、筛选民族药；
二、扩大药用部位；
三、寻找亲缘关系相近的药用植物； 四、合成、半合成及修饰活性成分结构； 五、利用生物技术繁殖； 六、利用药用植物地域性定位发展；
实验1毛状根诱导和培养
准备工作
• 下周实验前，用YEB活化培养菌株 • 菌株：ＡＴＣＣ１５８３４ harboring
wild type agropine pRiA4b • 培养时间：30h until the OD 600 of
suspension is ca 0.8
THANKS FOR YOUR ATTENTION!
3.4 叶盘法产生毛状根的实验过程
4，需准备的下次实验的材料
• 1.MS固体培养基（不加激素，0.8%琼脂，pH6.0）,每 人4-6瓶（20—30mL果酱瓶）
• 2.MS 液体培养基，每组200mL（稀释活化菌液用） • 3.YEB 液体培养基，pH7. 共2,2升（全班用） • 4.YEB固体500mL（全班用） • 5.无菌水（每人至少4瓶）和空瓶1-2个/人。 • 6.每人无菌吸水纸和牛皮纸各一包（灭菌后供下次用） • 7.接种工具（镊子，手术刀等）包裹灭菌。
实验一， 毛状根的诱导和培养
实验目的
• 1.掌握毛状根产生的原理 • 2.掌握毛状根诱导和培养的方法 • 3.掌握毛状根鉴定的方法
Ri质粒ED C源自G virB AT-DNA
LB RB
Hairy root genes and opine synthase
Ri opine
catabolism
ori
1.毛状根产生的原理
2.毛状根产生过程
• 毛状根形成：
• 菌种活化培养—感 染-吸附到细胞伤 口附近—穿过细胞 壁,膜-质-进入细胞 核内进行插入整合 和表达—形成毛状 根。
3.毛状根的诱导方法
• 1.叶盘法 2.原生质体共培养 3.活体接种法(PPT 演 示)
褐脉少花龙葵毛状根
叶盘法（Horsch et al 1985）
毛状根培养在植物化学成分和重组药物蛋白研究中的应用
毛状根培养在植物化学成分和重组药物蛋白研究中的应用辛萍;王有志;孙世芹
【期刊名称】《时珍国医国药》
【年(卷),期】2012(23)11
【摘要】毛状根培养是由发根农杆菌转化植物建立起来的体系,具有激素自养、生长迅速、化学成分含量与原植物相当或高于原植物及生物合成能力相对稳定等优点,近年来已在多种植物中建立,并开始用于重组药物蛋白的合成,不但为植物化学成分的大规模生产开辟了新的途径,而且使那些在细菌、酵母菌和哺乳动物体内难以表达的药物蛋白的合成成为了可能。
文章系统综述了近年来毛状根培养在植物化学成分和重组药物蛋白研究方面的进展和成果,以期为毛状根培养的深入研究与开发提供指导。
【总页数】3页(P2750-2752)
【关键词】毛状根;发根农杆菌;植物化学成分;重组药物蛋白
【作者】辛萍;王有志;孙世芹
【作者单位】哈尔滨医科大学(大庆)药学院
【正文语种】中文
【中图分类】R2-03
【相关文献】
1.毛状根培养在药用植物中的应用概况 [J], 曲伟红;赵建国
2.极具潜力的重组药用蛋白的毛状根表达系统研究 [J], 潘学武;董妍玲;韩晓红
3.毛状根培养技术在获得药用植物次生代谢产物中的应用 [J], 司春灿;林英
4.毛状根培养技术在获得药用植物次生代谢产物中的应用 [J], 司春灿;林英
5.应用毛状根转化技术获得植物次生代谢产物的研究Ⅰ.萝芙木毛状根的诱导与培养 [J], 孙敏;汤绍虎
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第六章毛状根培养
毛状根培养反应器
毛状根培养技术的优点
1.生长速度快
毛状根有大量的分枝和根毛, 生长快,可用于大量培养。 毛状根中的T-DNA片段上有生长 素合成酶基因。 毛状根是细胞分化而来的根组 织，属于单克隆,具有遗传稳 定性。 发根农杆菌中的Ri质粒是一个 很好的转基因载体,可把目的 基因导入植物细胞中
2.激素自养性
毛状根的培养方法
具体培养方法
固体培养
•
成批培养 连续培养
液体培养法
两相培养法
•
•
大规模发酵培养
毛状根的筛选与鉴定
筛选：选择生长速度较快、分枝较多的毛状根 株系进行扩大培养 鉴定：
形态学水平：激素自养，根丛生，多分枝
多根毛，无向地性 细胞水平：冠瘿碱的测定 （硝酸银染色）
，
毛状根培养反应器
利用发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA
整合到植物细胞上,使植物细胞诱导产生 毛状根。
2.毛状根培养体系
除菌
发根农杆菌菌株的筛选及活化
发根农杆菌菌株的类型： 农杆碱型（agropine type） 胭脂碱型 章碱型
农杆菌菌株的筛选及活化
将菌株在液体培养基上培养（含乙酰丁香酮），
激活vir区的基因，为Ri质粒的转移提供先决条件
生物技术，其次级代谢物质的生产能力遗传及生化稳定性增 加生物量的可操作性等特点都引起了人们相当大的兴趣 。 缺：目前的生物反应器还难以满足毛状根大规模培养的要求, 主要限制因素为物质的转移,毛状根生长时易成团,限制了营养 和氧气的进入。 缺：由于目前对农杆菌不同菌株间侵染物种能力的差异机理 还不够了解，并且不同物种间诱导形成毛状根的能力也不同 ，目前为止仅应用于部分的双子叶植物和少部分的单子叶植 物及裸子植物，应用范围较窄。
苦参毛状根及愈伤组织培养研究
苦参毛状根及愈伤组织培养研究苦参毛状根及愈伤组织培养研究植物组织培养技术是一种能够实现植物体外生长和发育的关键技术之一，对于植物根系的研究和利用具有重要意义。
本文将对苦参（Sophora flavescens Ait.）的毛状根及愈伤组织培养研究进行探讨。
苦参是一种草本植物，广泛分布于我国华北、华东、华南和西南等地区。
其根系富含多种生物碱、黄酮类化合物和皂甙等有效成分，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等药理活性，被广泛应用于中药制剂和功能食品中。
毛状根是苦参植物根系生长过程中形成的一种特殊结构，具有未分化的细胞和较高增殖能力。
通过毛状根培养，可以大量繁育苦参植物，并提取其有效成分。
在实验室条件下，以苦参幼苗为材料进行细胞悬浮培养、愈伤组织诱导和愈伤组织分化等步骤，可成功获得愈伤组织。
愈伤组织是在植物组织培养过程中诱导和分化的一种未分化、增殖能力强的细胞群体。
通过愈伤组织培养，可以实现大规模生产苦参有效成分的愈伤组织悬浮培养液，具有较高的药用价值。
同时，愈伤组织还可以作为研究苦参生物合成途径和代谢调控的模型系统，为深入研究苦参药理作用提供了重要工具。
本研究以苦参幼苗为材料，在适当培养基中进行毛状根和愈伤组织培养试验。
实验结果表明，通过调节培养基中植物生长调节剂的浓度和配比，可以有效诱导苦参幼苗形成毛状根和愈伤组织。
并通过显微镜观察和组织切片技术对所培养的毛状根和愈伤组织进行形态学和组织学分析。
进一步的研究发现，愈伤组织呈现出较高的细胞分裂活性和增殖能力，通过增加培养基中激素的浓度，可以进一步促进愈伤组织的增殖。
同时，对培养过程中的营养供给、光照和温度等环境因素进行优化，也对苦参毛状根和愈伤组织的形成和生长起到重要作用。
本研究为深入了解苦参植物根系的发育规律和有效成分的生物合成机制提供了重要依据。
通过组织培养技术，可以实现苦参植物的快速繁育和有效成分的大规模生产，为苦参的利用和开发提供了重要途径。
此外，本研究还为其他草本植物毛状根和愈伤组织培养技术的研究和应用提供了一定的借鉴意义综上所述，本研究通过苦参幼苗的毛状根和愈伤组织培养试验，成功诱导了苦参幼苗形成毛状根和愈伤组织，并对其进行了形态学和组织学分析。
植物组织器官培养生产代谢产物
植物组织器官培养生产代谢产物
第9页
在通常状态下, Ri质粒上Vir区基因处于抑制 状态, 当发根农杆菌感染寄主植物时, 受损伤 植物细胞合成低分子苯酚化合物乙酰丁香 酮使Vir区处于抑制状态基因被激活, 产生一 系列限制性核酸内切酶, 在酶切割作用下产 生T-DNA链, T-DNA进入植物细胞核内, 整合进 植物细胞基因组。其整合和表示结果造成 了大量毛状根产生。
植物组织器官培养生产代谢产物
第18页
冠瘿组织形成
与根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）上 Ti质粒相关。Ti质粒上也有一段特殊T-DNA, 编码细胞分裂素合成酶基因ipt(trnsr)以及生长 素合成酶基因 iaaM(trns1)、iaaH(trns2)。
植物组织器官培养生产代谢产物
植物组织器官培养生产代谢产物
第21页
三 毛状根培养生产药用次级代谢产物 讨论分析
植物组织器官培养生产代谢产物
第22页
1.长春花碱毛状根培养制备
长春花（Catharanthus roseus (L.) Don）: 夹竹桃科长春花属。
长春花姿态优美, 花期长, 适合布置花坛、花 境, 也可作盆栽观赏。还是一个防治癌症药 源植物。长春花中含55种生物碱。其中长春碱 和长春新碱对治疗绒癌等恶性神瘤、淋巴肉瘤 及儿童急性白血病等都有一定疗效（长春新碱 抗癌比长春碱高强）。
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2.雪莲花毛状根培养制备黄酮
毛状根实验报告
一、实验目的1. 了解毛状根的生物学特性及生长规律。
2. 掌握毛状根的培养方法及实验操作技能。
3. 探究不同培养基、温度、光照等条件对毛状根生长的影响。
二、实验材料1. 植物材料：紫花苜蓿品种WL-525HQ2. 发根农杆菌：LBA9402、R16013. 培养基：MS培养基、1/2MS培养基、1/4MS培养基4. 药品与试剂：抗生素、温度计、pH计、紫外灯、移液器、培养皿、无菌操作台等三、实验方法1. 发根农杆菌的培养与活化：将发根农杆菌接种于含有抗生素的LB培养基中，37℃恒温培养过夜。
次日，将菌液按1:100的比例稀释，涂布于含有抗生素的LB培养基平板上，37℃恒温培养过夜，获得单菌落。
2. 外植体准备：将紫花苜蓿品种WL-525HQ的茎段剪成1-2cm长，用70%乙醇消毒30秒，无菌水冲洗3次，再用0.1%氯化汞消毒10分钟，无菌水冲洗5次，最后将茎段切成0.5cm长的小段。
3. 毛状根诱导：将外植体接种于含有发根农杆菌的培养基中，置于28℃、光照强度为1500lx的培养箱中培养。
每隔3天更换一次培养基，持续培养30天。
4. 培养基筛选：将诱导出的毛状根分别接种于MS培养基、1/2MS培养基、1/4MS培养基中，观察毛状根的生长情况。
5. 温度、光照条件探究：将毛状根分别置于不同温度（20℃、25℃、30℃）和光照强度（1000lx、1500lx、2000lx）的培养箱中培养，观察毛状根的生长情况。
6. 数据统计与分析：对毛状根的生长情况（长度、直径、分枝数等）进行统计与分析。
四、实验结果1. 发根农杆菌培养结果：在含有抗生素的LB培养基平板上，成功获得单菌落。
2. 外植体诱导结果：接种外植体后，部分外植体在培养基上形成了毛状根。
3. 培养基筛选结果：在1/2MS培养基中，毛状根生长情况最好，长度、直径、分枝数均较高。
4. 温度、光照条件探究结果：在25℃、1500lx条件下，毛状根生长情况最佳。
植物毛状根的培养及其化学进展：1.植物毛状根的诱导形成？…
植物毛状根的培养及其化学进展：1.植物毛状根的诱导形
成？…
周立刚;杨崇仁
【期刊名称】《天然产物研究与开发》
【年(卷),期】1998(010)003
【摘要】本文综述了发根农杆菌诱导植物毛状根的方法及其分子机制。
对毛状根的鉴定技术进行了介绍。
诱导出毛状根的植物主要集中在双子叶植物，对单子叶植物毛状根诱导的可能性进行了讨论。
由于毛状根的激素自主性、稳定性和高产性，这一技术为植物有用成分的大量生产提供了新的途径。
【总页数】9页(P87-95)
【作者】周立刚;杨崇仁
【作者单位】华中理工大学药物研究所;中国科学院昆明植物研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q944.6
【相关文献】
1.药用植物毛状根诱导及其培养技术研究 [J], 李亚璞;闫静辉
2.发根农杆菌诱导植物毛状根形成的研究进展 [J], 潘野;王晓峰;林丽;吕春茂
3.发根农杆菌诱导植物毛状根的发生及次生代谢物生产的研究进展 [J], 胡亚忱;曲德业
4.植物毛状根的培养及其化学进展：2.植物毛状根的次生代谢 [J], 周立刚;杨崇仁
5.应用毛状根转化技术获得植物次生代谢产物的研究Ⅰ.萝芙木毛状根的诱导与培养 [J], 孙敏;汤绍虎
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药用植物毛状根的诱导及其应用
药用植物毛状根的诱导及其应用植物毛状根培养是植物组织培养中的一种，因其不仅克服了植物生长缓慢、有效成分积累有限的不足，且具有不依赖外源植物激素等优点，近年来研究较多。
文章介绍了目前药用植物毛状根的诱导情况，并总结了植物毛状根培养体系在次生代谢物的生产、生物合成机制及调控基因的研究、植物基因工程、生物转化以及药物蛋白中的应用，旨在为其他药用植物毛状根的培养及利用提供参考依据。
标签：毛状根；药用植物；次生代谢产物；发根农杆菌；生物转化1 药用植物毛状根的诱导1.1 毛状根的发根机制毛状根（hairy roots）是发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes感染植物后，在植株创伤表面诱导产生的一种特殊表现型。
早在1907年，Smith和Townsend 就发现发根农杆菌能够诱导植物产生毛状根，此后，学者们发现无论是发根农杆菌还是根癌农杆菌A. tumefaciens，其致病原因均是由大分子质粒引起的[1-2]，但发根农杆菌的致病质粒与其他Ti质粒（根瘤诱导质粒）功能既有差异又有联系[3]。
直到1982年，美国科学家Chilton[4]发表文章阐述其发根机制：发根农杆菌中Ri质粒上T-DNA进入宿主植物细胞引发了毛状根的产生。
Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个约250 kb的大质粒，其上面存在2个与转化有关的功能区，即T-DNA（转移区）和Vir（致病区）。
T-DNA的主要功能是在转化时进入植物细胞并插入到寄主植物基因组中，表达决定毛状根生长和冠瘿碱合成的基因；Vir区的作用是协助T-DNA区完成转化。
Vir区上有7个操纵子VirA-G，轉化时，植物伤口产生小分子酚类化合物与VirA的表达产物结合，激活其他Vir基因，使T-DNA被剪切、转移并最终整合到宿主细胞基因组中。
因此，单子叶植物不能合成特异性小分子酚类化合物是其难以被侵染诱导出毛状根的主要原因[5-7]。
1.2 药用植物毛状根诱导情况目前，已有近百种药用植物成功诱导出毛状根，总结发现其中76%为草本植物，也有少量藤本及木本植物，比例分别占到7%，17%；在植物学分类方面，已诱导出毛状根的药用植物科属分类较为分散，其中豆科、茄科、菊科和唇形科占有相对较大的比例（表1）。
毛状根培养技术在获得药用植物次生代谢产物中的应用
２０２１ 年 ６ 月
景德镇学院学报
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３６No．
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２０２１
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毛状根培养技术在获得药用植物
次生代谢产物中的应用
司春灿 ①,林 英
(景德镇学院 生物与环境工程学院,江西 景德镇 ３３３４００)
平,相对于正常植物根内次生代谢产物的量,增加量
并不是很大,可以通过正常的根培养来实现,这表明
需要更好的实验设计来进行毛状根的代谢工程.由
于毛状根主要在暗 环 境 下 培 养,一 些 与 光 合 作 用 相
关的代谢产物在发根内的含量并不高.相对于只需
要一到几天就能繁 殖 一 代 的 微 生 物 而 言,某 些 毛 状
状根技术对药用植物进行改良也是近些年的发展趋
势之一,主要有以下几种方式:
２．
２．
１ 毛状根再生植株
植物 被 发 根 农 杆 菌 侵 染 后 产 生 毛 状 根,通 过 添
养条件下,皂苷的产量显著提高 [１２].
２．
３ 毛状根与微生物共生产生次生代谢产物
微生物能够促进药用植物毛状根次生代谢产物
超量积累. WuJY 等 发 现,细 菌 Ba
种改良和良种选育 等 方 面 发 挥 着 重 要 作 用,但 是 不
①
化生产等优点,在诱 导 产 生 发 根 的 过 程 中 还 可 以 导
入外源基因,达到改良改进药用植物品种的目的 [３].
常见的中药材有 ３０％ 以上来源 于 药 用 植 物 的 根 部,
第六章 植物的次级代谢产物
二、含氰苷
广泛分布于植物界，其中以豆类、禾谷类和玫瑰一些种类最多。 主要存在于叶表皮的液泡中，其本身无毒，但其分解酶——糖苷酶存在叶肉中，
互不接触。叶片被咬碎后，含氰苷与酶混合，含氰苷中的氰醇和糖分开，前者 在酶催化下自发分解为酮和氰化氢（HCN）。 昆虫和其他食草动物[如蛇、蛞（kuō）蝓(yú)]取食后，产生HCN，呼吸被抑制。
3. 重要药物的有效成分（麻黄能平喘，其有效成分是麻黄碱；黄连可抗菌，其主要成 分是小檗碱/黄连素；元胡可镇痛，其有效成分是延胡索乙素等多种生物碱）
元胡又名延胡索、玄胡，为罂粟科紫堇属多年生草本植物，入心、脾、肝、肺，是活血化瘀、 行气止痛之妙品，尤以止痛之功效而著称于世。
现在的西药常用的重要药品，最初都是从植物分离出来证实有效后化学合成的。
一个芳香环（B）和桥是从苯丙氨酸转变而来，而另一个芳香环（A），则来自于 丙二酸途径。
基本类黄酮骨架会由许多取代基，羟基常位于4、5、7位，它也常带糖，所以大 多数类黄酮是葡萄糖苷。
羟基和糖增加类黄酮的水溶性，而其他替代物则使类黄酮呈脂溶性。
2. 功能 （1）呈现颜色
植 物 色 素
可吸引昆虫传粉，鲜艳果实可吸引动物食用传播种子。
安、流泪、流汗、流鼻水、易怒、发抖、寒战、打冷颤、厌食、便秘、腹泻、身体卷曲、抽筋等。 危害：急性中毒，昏迷、呼吸抑制、低血压、瞳孔变小，严重的引起呼吸抑止致人死亡。
海洛因
以吗啡生物碱作为合成起点得到的半合成毒品，是 鸦片毒品系列中的精制品，主要作用成分是二乙酰 吗啡。最初曾被用做戒除吗啡毒瘾的药物，后来发 现它比吗啡成瘾性更强。
症状：焦虑、倦怠和极度兴奋等症状，酷似妄想精神 分裂症，产生幻觉，触觉致幻尤为强烈，仿佛皮肤上 总是有昆虫附着，以致发生自残行为，常常还有心理 恐怖，总怀疑被人监视、跟踪。
药用植物毛状根诱导及其培养技术研究
导出毛状根，并用 ＨＰＬＣ 法测定了筛选出了高产发根 系 Ｒ９９２３ 发根系中各种单体皂甙的含量，测定出人参 总皂甙的含量为 １５．２ｍｇ／ｇ，并进一步探讨了人参发根 大规模培养的可能性［１０］。１９９７ 年，Ｌａｕｒａｉｎ 从银杏原叶 体及悬浮细胞获得了转化根，其药用成分占干重的 ０． ０６５％和 ０．０８７％ 。 ［１１］ ２００３ 年 Ｙａｍａｚａｋｉ 用发根农杆菌 （Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）和矮蛇根草（Ｏｐｈｉｏｒｒｈｉｚａ ｐｕｍｉｌａ）毛状根 的培养来生产喜树碱，获得毛状根干重 １０００ｍｇ／ｇ［１］。另 外，丹参［１２］、长春花［１３，１４］、西洋参［１５，１６］、银杏［４］、黄芪［１７］、绞股 兰［１８］、枸杞［１９］、何首乌［２０］等药用植物的发根，也都有相应 的研究报导。 １ 发根农杆菌 Ｒｉ 质粒及其作用机理
利用发根农杆菌诱导产生毛状根后，必须尽快除 去毛状根吸附的微生物，使毛状根在无菌条件下快速 生长。除菌的方法有抗生素除菌法和温度除菌法，或将 两者联合使用。抗生素除菌法是将毛状根转移至含有 抗生素的培养基上，经数代转移直到完全无菌为止，常 用的抗菌素有羧苄青霉素、利福霉素和头孢霉素等；温 度除菌法是将毛状根转移至不含有抗生素的培养基 上，经过 ３９￣４０℃温度条件处理，再转移到新培养基 上，达到完全除菌的目的。除菌后，挑选生长速度较快、 分支较多的的发状根转至液体培养基中继续培养。在 连续培养过程中，对发状根进行驯化，使其适合发酵培 养。获得生长状态稳定的发状根后，须进一步开展发酵 工艺研究，优化培养条件，提高发状根培养及次生代谢 产物的发酵水平，最终建立规模化培养毛状根生产药 用植物次生代谢产物的发酵技术体系［２４］。 ３ 影响发根农杆菌转化的因素
现已成功诱导出毛状根的植物外植体材料有叶 片、茎段、子叶、愈伤组织等。研究表明，植物材料的幼 嫩部位，特别是用种子萌发直接获得的无菌幼苗更易 获得毛状根。这是因为幼嫩的生长旺盛的组织对农杆 菌更敏感，被感染后，伤口附近的细胞易脱分化形成较 多的感受态细胞，从而有利于农杆菌的诱导而产生毛 状根。此外，外植体材料预先在无激素的固体培养基上 培养 １￣３ｄ，可以提高毛状根的诱导率。 ２．３ 毛状根的转化方法
毛状根培养生产药用次级代谢产物
2毛状根生长机理 毛状根生长机理
2.1发根农杆菌Ri质粒及其作用机理
发根农杆菌属土壤农杆菌， 革兰氏阴性。发 根农杆菌能侵染多种植物, 诱发被感染植物的 受伤部位长出毛状根。 发根农杆菌之所以具 有这种致根性， 是因为它具有能诱导毛状根 产生的 Ri 质粒。Ri 质粒是发根农杆菌染色体 外的一个约250kb的大质粒， 在Ri质粒上有 T-DNA。当发根农杆菌感染植物时， Ri 质粒 上的 T-DNA 可以转化并插入到植物细胞的基 因组中，其整合和表达的结果是产生了大量的 毛状根。
4毛状根合成次生代谢产物 毛状根合成次生代谢产物
培养基进行培养，主要影响因素有 光照、温度、 PH 、培养基成分 （碳源、氮源、激素等）等，经过 培养毛状根产生并积累次级代谢产 物,经分离提取可做药品、色素、调 味品、香料、兴奋剂、杀虫剂等。
5结语 结语
随着毛状根诱导技术的不断 成熟，毛状根培养取得了显 著的发展，目前需要解决的 主要问题是如何进行大规模 培养，如何提高次级代谢产 物的产量。
badboy11植物被发根农杆菌感染后在伤口处就会形成不定根不定根除菌后能迅速生长传基因稳定生长迅速于培养次生代谢产物含量高等特点
毛状根培养生产药用 次级代谢产物
Bad Boy
1毛状根概念及特点 毛状根概念及特点
1.1 植物被发根农杆菌 感染后，在伤口处就会 形成不定根，不定根除菌后能迅速生长， 并 产生多个分枝， 呈毛发状， 该不定根又被称 为毛状根 。 1.2 毛状根具有遗传基因稳定、 生长迅速、 易 于培养、 次生代谢产物含量高等特点。关于 毛状根诱导的技术发展很快，特别是利用毛状 根大量生产药用植物活性成分的研究， 成为 研究热点。
3毛状根培养步骤 毛状根培养步骤 外植体的选择及处理 毛状根的转化 毛状根的鉴定除菌
毛状根
毛状根组织培养进展及现状毛状根，又称发状根，发根。
为发根农杆菌侵染植物后产生的一种病理状态。
优点为生产效率高，特点为生物合成能力强、生长快。
整体植株或某一器官、组织(包括愈伤组织)、单个细胞，甚至原生质体受到发根农杆菌的感染所产生的一种病理现象，是细胞中质粒的T-DNA插入寄主细胞核基因组而得到的表现型，主要是在感染部位上或附近能产生大量的副产物-毛状根。
发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是一种革兰氏阴性菌，能侵染大多数的双子叶植物、少数单子叶植物及个别的裸子植物，诱发被感染植物的受伤部位长出毛状根。
发根农杆菌之所以具有这种致根性,是因为它具有能诱导毛状根产生的Ri质粒。
Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个约250kb的大质粒，带有冠瘿合成酶基因。
在Ri质粒上，存在与转化有关的两个主要功能区，即T-DNA (转移区)和Vir(致病区)。
Vir区基因并不发生转移，但它对T-DNA的转移非常重要。
当发根农杆菌感染植物时Ri质粒上的T-DNA可以转化并插入到植物细胞基因组中，其整合和表达的结果导致了大量毛状根的产生。
处理菌株后可提高Vir 区的表达并明显提高药用植物外植体的转化率。
发根农杆菌Ri质粒有几种不同的类型，分别是农杆碱型、甘露碱型和黄瓜碱型。
其中含有农杆碱型Ri质粒的菌株通常具有更广泛的宿主范围和更强的致根特性。
经发根农杆菌侵染植物形成的毛状根适离体培养能够再生植株，而且许多植物的毛状根在离体培养条件下表现出次生代谢产物的合成能力，产物产量较正常植物及悬浮培养细胞的要高。
因此Ri质粒可应用于有价值的次生代谢产物的生产。
与植物细胞培养相比，毛状根培养具有生长速度快、激素自养、分化程度较高以及遗传性状相对稳定等优点。
由于近三分之一传统药材的药用部位是根，所以这一培养系统在传统药材生产中具有更重要的意义。
1. 毛状根诱导常用菌种常用于实验的发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes ）有：ATCC15834、ATCC39207、G58P GV3296、A4、NCPPB2659、Rl500、Rl601、LBA9402、TRl05等菌株，这些菌株中含有侵入性致根质粒（root inducing plasmid）Ri质粒。
浅谈毛状根及在药用植物中的应用
2.1发根土壤杆菌诱导毛状根的过程
①发根农杆菌识别受伤植物释放的诱导物。 ②发根农杆菌识别信号分子后，向受伤细胞作趋化性
运动，并与宿主细胞发生粘接。 ③ Ri质粒的vir区基因被乙酰丁香酮等物质括化，使Ri
质粒上的T-DNA片段被切割下来并转入植物细胞。 ④T-DNA基因进入寄主细胞的细胞核并整合到核基因
②用反义技术来调控代谢途径：利用反义技术将 反义 DNA 或 RNA 片段导入植物细胞，使其某 一代谢途径关键酶的活性得到控制，从而影响 活性成分的含量。
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3.2获得毛状根转基因植物
以Ri质粒为载体转入外源功能基因，获得药 用植物的转基因植株。
通过转基因技术，一、可以对克隆出的目的 基因进行功能验证；二、导入外源功能基因， 可以改善药用植物的某些特性。
毛状根及在药用植物中的应用
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主要内容
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毛状根简介及特点 形成过程及影响因素 培养技术的应用 存在的问题及解决方法 参考文献
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1.1毛状根简介
植物被发根农杆菌感染后，在伤口处 就会形成不定根，不定根除菌后能迅速 生长，并产生多个分枝，呈毛发状，该 不定根又被称为毛状根。
次生代谢产物是指药用植物体内一大类 化合物。 它们是细胞生命活动或植物生长发育正 常运行的非必需小分子化合物。 其产生和分布通常有种属、器官、组织 以及生长发育时期的特异性。
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药用植物器官培养生产次生代谢物的路线图
3.1.2提高毛状根生产能力的技术
研究药用 研究药用
= 植物毛状
植物毛状 根的目的
有两个非常主要的功能区即转移区T-DNA 区(即TL-DNA和TR-DNA)和致病区Vir区；
商陆毛状根的诱导、培养及其皂甙的产生
!"卷!期#$$%年!月生物工程学报!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12&’()!"*’)!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!+,-.,/0#$$%收稿日期：#$$#1$21%$，修回日期：#$$#1!$1!2。
商陆毛状根的诱导、培养及其皂甙的产生施和平"梁朋权宏（华南师范大学生命科学学院，7!$6%!广州）摘要发根农杆菌（31*(4+0/%*#)5*"#6(1%$%&）D!6$!感染商陆叶片外植体!周后，在其切口处产生毛状根，#$C 后产生毛状根的外植体比例达2$E ；毛状根可直接从叶片外植体叶脉处或从叶脉处产生的愈伤组织上产生。
毛状根能在无激素的FG 培养基上自主生长，其呼吸速率比对照根提高57)6E 。
冠瘿碱检测和HID 扩增结果表明，发根农杆菌D=31J*K 的冠瘿碱合成酶基因及其D=质粒的*(,基因均已在商陆毛状根基因组中得到表达。
毛状根中总皂甙含量约为自然根的!)78倍，但其多糖含量则仅为非转化根的2$E 。
关键词发根农杆菌；商陆；毛状根；呼吸速率；总皂甙中图分类号L5!%文献标识码K文章编号!$$$1%$6!（#$$%）$!1$$861$8发根农杆菌（31*(4+0/%*#)5*"#6(1%$%&）侵染植物后，它所含的D=质粒的31J*K 片段在植物细胞基因组中整合和表达，形成毛状根［!，#］。
利用生长迅速、次生代谢物产率高而稳定的毛状根培养物来生产药用植物的次生物质，已有不少报道［%M 6］。
但利用发根农杆菌对商陆（7"2/(,+00+%&0),%$/+N,-O’.PP4）的遗传转化，以毛状根来生产商陆的药用成份，至今未见正式的报道。
商陆的根是我国长期应用的一种传统中药。
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到基础研究和大规模工业化生产的要求还需要进一步探讨
毛状根培养反应器
毛状根培养技术的优点
1.生长速度快
毛状根有大量的分枝和根毛, 生长快,可用于大量培养。
2.激素自养性
毛状根中的T-DNA片段上有生长 素合成酶基因。
3.遗传稳定性 4.可塑造性
毛状根是细胞分化而来的根组 织，属于单克隆,具有遗传稳 定性。
发根农杆菌中的Ri质粒是一个 很好的转基因载体,可把目的 基因导入植物细胞中
毛状根培养技术
毛状根培养技术
教学内容
1 毛状根培养技术简介 2 毛状根诱导培养体系的建立
33 毛状根培养、筛选和鉴定
4 毛状根培养技术与中药生产
5
展望
1. 毛状根培养技术简介
毛状根（hairy root）概念
毛状根：植物受伤后，被发根农杆菌感染，在 伤口处就会形成不定根，并产生多个分枝，呈 毛发状；这些不定根又被称为毛状根。
ori
1. 毛状根培养技术简介
发根农杆菌Ri质粒
？什么是毛状根培养技术
➢毛状根培养技术是20世纪80年代发展起
来的基因工程和细胞工程相结合的一项 新技术。
➢利用发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA
整合到植物细胞上,使植物细胞诱导产生 毛状根。
2.毛状根培养体系
除菌
发根农杆菌菌株的筛选及活化
1. 毛状根培养技术简介
发根农杆菌 Agrobacterium rhizogenes
发根农杆菌一种侵染性非常广泛的土壤细菌， 革兰氏阴性。发根农杆菌能侵染多种植物,诱发被 感染植物的受伤部位长出毛状根，其特征是迅速增 生、高度分化出大量不定根。
1. 毛状根培养技术简介
发根农杆菌的生物学特性 质粒
5.毛状根与中药现代化生产
次生分
成功应 用于工 业生产 的例子
药用植物人参、紫草、长春花、甜 菜胡萝卜(Daucuscarota)等植物的 毛状根能够通过生物反应器培养来 进行其次生物质的规模化生产。
展望
➢ 优：毛状根培养体系是一种非常有潜力的生产次生代谢物的
或有效成分含量增多。
➢ 要建立起正常的毛状根必须经过除菌以便获得无菌的毛
状根。通常用抗生素除菌即是：将毛状根从母体上切下 后移植到含抗生素的培养基上经数代转移直到完全无菌 为止。
毛状根诱导的分子机理
1
发根土壤杆菌识别受伤植 物释放的诱导物（乙酰丁 香酮等酚性物质）
2
发根土壤杆菌识别信号 分子后,向受伤细胞作趋 化性运动,并与宿主细胞
生物技术，其次级代谢物质的生产能力遗传及生化稳定性增 加生物量的可操作性等特点都引起了人们相当大的兴趣 。
➢ 缺：目前的生物反应器还难以满足毛状根大规模培养的要求,
主要限制因素为物质的转移,毛状根生长时易成团,限制了营养 和氧气的进入。
➢ 缺：由于目前对农杆菌不同菌株间侵染物种能力的差异机理
还不够了解，并且不同物种间诱导形成毛状根的能力也不同 ，目前为止仅应用于部分的双子叶植物和少部分的单子叶植 物及裸子植物，应用范围较窄。
发生粘接。
4
T-DNA基因进人寄主细 胞的细胞核，并整合到核 基因组中,然后在寄主细 胞中表达,从植物的感染 点诱导毛状根.
3
发根土壤杆菌Ri质粒上的 vir区（致病区）基因被 乙酰丁香酮等物质活化, 使Ri质粒上的T-DNA片段 被切割下来并转入植物细 胞,但vir区本身不转入。
毛状根的培养方法
发根农杆菌菌株的类型： 农杆碱型（agropine type） 胭脂碱型 章碱型
农杆菌菌株的筛选及活化
将菌株在液体培养基上培养（含乙酰丁香酮）， 激活vir区的基因，为Ri质粒的转移提供先决条件 。
受体材料的选择及处理
外植体：植物幼嫩的叶片、茎尖、分生组织等 ；或愈伤组织；或原生质体
外植体处理：在培养基中进行预培养
发根农杆菌感染的方法：
向植物体直接注射 与原生质体共培养 对植物外植体进行接种感染
毛状根的除菌方法
• 抗生素除菌法 抗生素除菌法是将毛状根转移至含有抗生素的 培养基上，经数代转移直到完全无菌为止，常 用的抗菌素有青霉素、头孢霉素等；
• 温度除菌法 温度除菌法是将毛状根转移至不含有抗生素的 培养基上，经过39~40℃温度条件处理，再转 移到新培养基上
无菌苗
诱导出的毛状根 进行液体培养
毛状根的诱导过程
➢ 无菌植株生长到一定时候,将植株的茎尖、叶片切去,剩
下茎秆和根部,在茎秆上划出伤口,将带Ri质粒的土壤杆 菌接种在伤口处和茎的顶部切口处,接种后继续培养被 感染的植株,经过一段时间（2一4周）的培养后,在接种 部位产生出毛状根。
➢ 诱导过程中可通过优化诱导条件，使毛状根生物量增殖
（1）发根农杆菌能侵染
大多数双子叶植物和少数
单子叶植物
Hairy root genes LB and opine synthase
E
（2）Ri质粒(root inducing
D C
plasmid) T－DNA区（转 G vir
B
移区）、Vir区（致病区） A
两个功能区
RB
T-DNA
Ri
opine
catabolism
具体培养方法
✓ 固体培养 ✓ 液体培养法 ✓ 两相培养法
• 成批培养 • 连续培养 • 大规模发酵培养
毛状根的筛选与鉴定
筛选：选择生长速度较快、分枝较多的毛状根 株系进行扩大培养 鉴定： 形态学水平：激素自养，根丛生，多分枝 ， 多根毛，无向地性 细胞水平：冠瘿碱的测定 （硝酸银染色）
毛状根培养反应器