HPLC中常用的检测器

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发展历程:
第一台ELSD是由澳大利亚的Union Carbide研究实验室的科学家 研制开发的,并在八十年代初转化为商品. 八十年代以激光为光源的第二代ELSD面世. 现在ELSD越来越多的作为通用型检测器用于高效液相色谱,超 临界色谱(SFC)和逆流色谱中.
目前主要有4种商品化的ELSD,即:Sedex,Eurosep,PL-ELS和 Alltech.
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PL-ELS 2100
组分进入检 测器的入口
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结构:
商品化的ELSD都是三部分组成,即雾化器 加热漂移管 光散 雾化器,加热漂移管 雾化器 加热漂移管和光散 射池. 射池 a: 雾化器与分析柱出口直接相连,柱洗脱液进入雾化器针管,在 针的末端,脱洗液和充入的气体(通常为氮气)混合形成均匀的微 小液滴,可通过调节气体和流动相的流速来调节雾化器产生的液滴 的大小. b: 漂移管的作用在于使气溶胶中的易挥发组分挥发,流动相中的 不挥发成分经过漂移管进入光散射池. c: 在光散射池中,样品颗粒散射光源发出的光经检测器检测产生 光电信号. ELSD采用的光源 一般为卤素灯 卤素灯
a: 雾化室温度:影响不大 b: 氮气流速:气体流速增大,使响应值减小,故最佳气体流速是在可以接 受的噪声基础上所产生的最大检测响应值的最低气体流速 最低气体流速. 最低气体流速 c: 漂移管温度:温度过低则流动相得不到充分挥发,使基线水平较高;温 度过高则可能带来更大的噪声. 最佳温度是在流动相基本挥发的基础上产 生可接受噪音的最低温度 最低温度. 最低温度 d: 流动相流速: 盐对基线噪音的影响:对于高浓度的盐,盐的不完全挥发会造成基线增高 ,使样品响应值受气体流速的影响相对变小;对于低浓度的盐,盐的完全 挥发使响应值受其影响较大. 所以,对用做缓冲液的盐,既要容易挥发,又要具有好的纯度.一般 盐的挥发性越大,所需的气体流速和漂移管温度越低!
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在垂直的方向上 进行检测
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优点: 优点 a: 灵敏度非常高 灵敏度非常高(灵敏度在目前常用的HPLC检测器中最高 ),其 检出限可达10-9g/ml,(比紫外检测器高2—3个数量级,适合于痕量 分析 ) b: 可以用于梯度洗脱 c: 对仪器的稳定性(如温度和压力的稳定性)依赖较小 d: 选择性好,优于紫外 选择性好,
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与普通UV-VIS检测器不同之处:
a: 普通UV-VIS检测器是先用单色器分光,只让特定波长的光进入 流动池. 而二极管阵列UV-VIS检测器是先让所有波长的光都通过流动池,然 后通过一系列分光技术,使所有波长的光在接受器上被检测. b:普通UV-VIS检测器只能得到二维的谱图,而DAD可以得到三维 图谱.
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2:荧光检测器
原理: 原理 物质的分子或原子经光照射后,有些电子被激发至较高的能 级,这些 电子从高能级 跃至低能级时,物质会发出比入射光 波长较 长的光,这种 光称为荧光.荧光检测器就是在样品的激发波长处检测发射光的强弱 样品的激发波长处检测发射光的强弱. 样品的激发波长处检测发射光的强弱 在样品浓度足够低时,下,荧光强度与如射光强度,量子效率及样品浓度 成线形关系. 荧光强度: F=I0 εφ L C : 荧光检测器是一种选择性 选择性检测器 选择性 不到20%的物质使用这种检测手段,许多药物如喹诺酮类药物采用这种检 测方法.
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特点:
因为ELSD在检测前将流动相蒸发,所以基线的噪声和漂移都很小 ,因此基线稳定和样品检测的灵敏度高.
流动相的蒸发使得ELSD和梯度脱洗相容,因而可提高色谱分离的 分辨率和缩短分离时间. 不像紫外检测器,ELSD的激光源无需更换,大大降低了运行成本 . 要求更低的气体压力和气体流速 ( 1L/min ) ,可以使用气瓶,空压 机或气体发生器.
1976年Nilano等人首先报道这种检测器,它不必停留就可获 得"在流"色谱的全部光谱信息,可跟随色谱峰扫描,用来观察色 谱柱流出组分的每个瞬间的动态光谱吸收图. 由于比其他快速扫描检测器具有结构简单,工作可靠,性能好 的优点,自一问世,就得到迅速发展.
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1:紫外-可见光(UV-VIS)检测器
工作原理: 工作原理 基于Lambert-Beer定律,即被测组分对紫外光或可见光具有吸 收,且吸收强度与组分浓度成正比 A=lg Io/I=εbc 其中A为吸光度(消光值),Io为入射光强,I为透射光强,ε为样 品的吸光度(消光系数)b为光程长,c为样品浓度. 通用型检测器 约有80%的分析样品具有紫外吸收,可以使用这种检测器检测. %
结构: 核心是二极管阵列元件,它由一系列光敏二极管蚀刻在硅片上 组成.一般,每个阵列又200～1024个光电二极管组成,他 们的光敏范围是200～600nm,每只二极管的分辨率是1～ 2nm,光电二极管越多,分辨率越高. 阵列的每一单元有一只光敏二极管和一只与之并联的电容器. 光电二极管紫外检测器n个单元同时检测,从而使采样时间减 少到普通的1/N.使用211个二极管的阵列元件,最快时,每 10ms可完成一次测量.每秒中可以收集20000～10000 0个数据.
现在在药物分析领域里面已经没有其他方法常用了.
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5:示差折光检测器 (RID)
原理: 原理 化合物的折光率不同,光会偏转.光偏转的程度与样品的浓度 成正比. 根据不同浓度的物质具有不同折射率来进行组分检测的. 溶液的折射率是溶剂(流动相)和溶质(样品)各自的折射 率乘以各自的摩尔浓度之和. 溶有样品的流动相与流动相本身之间折射率之差就表示样品 在流动相中的浓度.原则上,凡是与流动相折射指数有差别的样品 都可以测定它的浓度. 通用型检测器 (浓度 浓度检测器 ) 通用型 浓度 检测限可达10-6 ～10-7g/ml
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ELSD最大的优越性 最大的优越性在于能检测不含发色团的化合物 能检测不含发色团的化合物: 最大的优越性 能检测不含发色团的化合物 如:碳水化合物,脂类,聚合物,未衍生脂肪酸和氨基酸,表面活 性剂,药物,并在没有标准品和化合物结构参数未知的情况下检测 未知化合物 .
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ELSD检测只要分为三个步骤: (1)用惰性气体(一般是用N2)雾化脱洗液: (2)流动相在加热管(漂移管)中蒸发: (3)样品颗粒散射光后得到检测:
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重要参数与影响ELSD的因素: 重要参数与影响ELSD的因素 ELSD的因素
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优点: 优点
a: 灵敏度高 灵敏度高,检测下限约为 10-6 g/ml b: 线性范围广 C: 对温度和流速不敏感,适于进行梯度洗脱 梯度洗脱
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Hale Waihona Puke Baidu
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限制: 限制
a: 没有紫外吸收的物质不能检测 b: 应尽可能选择在检测波长下没有背景吸收的流动相 (限制了一些 一些截止波长在200~300nm之间的良好溶剂的使用 )
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应用
a: 色谱峰纯度检查 比较光谱法 吸收比法 双波长法 b: 色谱峰鉴定 与标准品或标准光谱比较 正常紫外光谱的比较 三维色谱能提供更多全面的信息. 三维色谱能提供更多全面的信息.
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4:电化学检测器
理论基础 a: 法拉第第一定律 在电介过程中,电极上起反应的物质量 (W)与通过电介池的电量(Q)成正比.
b: 法拉第第二定律 各种不同的电介质溶液中,通过相同的电量 时,电极上析出的电极产物的当量数相同. (96487库仑)
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优点: 优点
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6:蒸发光散射检测器 (ELSD)
原理: 原理 色谱柱流出液进入雾化器形成微小液滴,与通入的气体 (通常是 氮气,有时也用空气)混合均匀,经过加热的漂移管,蒸发除去流动 相,样品组分形成气溶胶,用强光或激光照射气溶胶,产生光散射 ,用光电二极管检测散射光. 散射光的强度(I)与组分的质量(m)有下述关系 关系: 关系 I=km 或lgI=b lgm+lgk 其中k和b为与蒸发室(漂移管)温度,雾化气体压力及流动相性质等 实验条件有关的常数.
响应不依赖与样品的光学特性,任何挥发性低于流动相的样品均能 响应不依赖与样品的光学特性 任何挥发性低于流动相的样品均能 被检测,不受其官能团的影响. 被检测,不受其官能团的影响 ELSD的响应值与样品的质量成正比,因而能用于测定样品的纯度 响应值与样品的质量成正比, 响应值与样品的质量成正比 或者检测未知物. 或者检测未知物
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优点: 优点
通用性强,操作简便
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缺点: 缺点
a: 灵敏度低 b:过于娇贵---室温的变化会影响基线的稳定性 ,大的溶剂前沿峰可 能会掩盖前期脱洗的色谱峰
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注意事项: 注意事项 a: 洗脱液的组成一定要恒定,不能使用梯度洗脱. b: 不能使检测池带压工作,在与其它检测器串联使用时应放在最 后. c: 流速要恒定,泵的流速波动要小于0.5%,使用往复泵时要用阻 尼装置. d: 温度要恒定,恒温控制要达±10-4℃,在使用时预热时间要充足 ,否则基线漂移十分严重 .
目前HPLC中常用的检测器 一:目前 目前 中常用的检测器
检测器是一套分离分析设备的关键.
目前有两种基本类型的检测器: 一类是溶质性检测器 溶质性检测器,它仅对被分离组分的物理或化学特性 被分离组分的物理或化学特性有 溶质性检测器 被分离组分的物理或化学特性 响应,属于这类检测器的有紫外,荧光,电化学检测器等. 另一类是总体检测器 总体检测器,它对试样和洗脱液总的物理或化学性质 总的物理或化学性质有 总体检测器 总的物理或化学性质 响应,属于这类检测器的有示差折光,蒸发光散射,电导检测器等 .
a:专用型 专用型检测器,具很强的专属性. 具很强的专属性. 专用型 具很强的专属性 b:线性范围可达 6,宽广 线性范围可达10 线性范围可达 c:高灵敏度 10-12g/l,可与荧光相比, 高灵敏度 ,可与荧光相比,
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缺点: 缺点
a: 只能测定具有电解活性 具有电解活性(电氧化一还原性)物质 具有电解活性 b: 要求洗脱液具有导电性 洗脱液具有导电性(可向洗脱液中加入少量电解质,或在 洗脱液具有导电性 柱后补加适量电解质溶液,这并不影响分离效率)
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3:二极管阵列检测器(diode-array detector, DAD)
原理: 光电二极管阵列(或CCD阵列,硅靶摄像管等)作为检测元件的 UV-VIS检测器.它可构成多通道并行工作,同时检测由光栅分光, 再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号,然后,对二极管阵列 快速扫描采集数据,得到的是时间,光强度和波长 三维谱图 时间, 三维谱图. 时间 光强度和波长的三维谱图
例子: 例子:花生酱提取物中衡量黄曲霉素的荧光检测法
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缺点: 缺点 a:适用范围有一定的局限性 –只适用于有荧光基团&衍生化之后 局限性 有荧光基团的化合物 b: 定量分析时线性范围较窄 线性范围较窄
它适合于 稠环芳烃,氨基酸,胺类,维生素,蛋 白质 稠环芳烃,氨基酸,胺类,维生素, 白质等荧光物质 的测定