病理学常用研究方法(研究生课程)

一、免疫组化标准化问题探讨
本世纪70年代问世 抗体种类急速增加，交叉反应存在 免疫组化技术方法不断问世 使用的试剂或实验室条件不同 操作人员的熟练程度 病理医生的结果判定水平及关联知识 解决标准化的问题势在必行
(一)方法的选择
目前常用的免疫组化方法有： PAP、ABC、APAAP法、S-P方法等 各种方法只要运用得好，都会得到满意 的结果
应用
免疫组化 DNA或RNA原位杂交 FISH 原位PCR
低密度芯片(50-70个标本)、高密度芯片(500个标本)
制作过程
1. 组织处理：固定、石蜡包埋、HE染色、组织定位 2. 组织打孔/阵列仪钻取组织，直径0.6mm 3. 制作阵列蜡块，将钻取的组织按设定的位置放入
空白蜡块内 4. 切片厚度为5μm，以40℃为宜，56℃烤片3小时，
病理学常用研究方法
主讲人：王恩华
整体水平： 尸体解剖 autopsy
动物实验 animal experiment
细胞水平：光镜组织切片 light-microscope
细胞培养 cell culture 流式细胞技术 flow cytometry 组织芯片 tissue micro-array 组织微切割技术 micro-dissection 电镜 透射、扫描、免疫电镜
③2-氢硫基乙醇 7.5μl(1/100)混合
④95℃沸腾5分钟 → 冰上放置
2. 蛋白定量 标准蛋白浓度制备：BSA，0，0.5，1，2mg/ml 比色：测定系数 换算成含量 → 计算出每个样品加样量
3. 电泳 丙烯酰胺 上部胶、下部胶 marker样品
4. 转膜 5. 洗膜 → 一抗、二抗 → 显色或自显影
心梗预报：心绞痛→一般认为没有酶 谱改变，设想用免 疫PCR就可能发现改变
2. 原位免疫PCR
在组织切片上有定位 Ag+Ab1+Ab2→ 卵 白 素 → 洗 净 → 生 物 素 标 记
的DNA片断→洗净→原位PCR扩增→洗净→ACB 或S-P显色
特点：①提高阳性率 ②定位好
2. 扩增：
Total: 25μl
中性，不与内源性凝集素样物质结合,而ABC法为10
S-P法与ABC法的区别
S-P法：Streptaridin peroxidase conjugataed method 链霉菌素抗生物素蛋白——过氧化物酶连接法
ABC法： Avidin-Biotin peroxidase complex method 卵白素亲生物素——过氧化酶复合物法
(三) 抗原修复(抗原暴露、抗原复原)
组织中存在某种抗原、但用特异性抗体，却为阴性 其原因是： ①固定、包埋后部分抗原决定簇与核酸或其它蛋白抗
原发生了交联，形成网络 ②固定液中的醛基本身也会发生交联，而封闭抗原
抗原修复的目的：
就是要打开交联，暴露抗原决定簇，有利于抗原抗体反 应，抗原修复的方法从大的方面讲有两种：
四、组织芯片(Tissue Micro-Array, TMA)
组织芯片技术是一种特殊生物芯片技术，它是将几 十个或几百个不同个体的临床组织标本按预先设计的顺 序排列在一张玻片进行分析研究，是一种高通量、多样 本的分析工具。它使科研人员第一次有可能同时对几百 甚至上千种正常或疾病以及疾病发展不同阶段的自然病 理生理状态下的组织样本，进行某一个或多个特定的基 因，或与其相关的表达产物的研究。
4. DNA收集 RECOCHIP法
三、Western Blotting
1. 提取蛋白
①500μl的hypotonic buffer + 组织2mm3匀浆器 粉碎 → 冰上放置30’
②15000转/分，4℃，30’。 上清：细胞质蛋白，+250μl 3×loading buffer 沉淀物 + 750μl × loading buffer 再次粉碎、离心，上清为细胞膜蛋白
蛋白水平：
1.免疫组化 immunohistochemstry 2.Western Blotting 3.组织芯片 tissue micro-array
基因水平：
1.原位分子杂交(组织、染色体Fish) in situ hybridization
2.Leabharlann Baidu因芯片 gene chip 3.组织芯片 tissue micro-array 4.PCR及测序等 PCR and sequence
只限于需要抗原修复的 抗体
①热
微波 高压锅 水浴锅
②酶消化
胰蛋白酶 胃蛋白酶
热修复：
0.01M柠檬酸缓冲液，PH=6.0，95℃，10分钟
注意：脱片多——多聚L赖氨酸
干片 选医用微波炉
酶消化：1.细胞内抗原——0.1%胰蛋白酶 20’37℃
2. 间 质 抗 原 ——4% 胃 蛋 白 酶 37℃ ， 4-8 小 时
S-P法中的链霉菌素抗生物素蛋白取代了ABC方法中的卵白 素和生物素
即：卵白素中的4个亚基一方面与第二抗体上的生物素结 合，另一方面还与复合物中的生物素结合
ABC法：
一二 抗抗
卵生过 白物氧 素素化
物 酶
A------B-------C
S-P法：
一二 抗抗
过氧化 物酶
链菌素抗生物 素蛋白
(二) 固定、包埋
① PCR buffer
2.5μl
② mixed dNTP
2.0μl
③ dH2O ④ primer 1
16.375μl 1.0μl
primer 2
1.0μl
⑤ Taq
0.125μl
⑥ DNA template
2.0μl
94℃ 25” → 55℃ 25” → 72℃ 40” 30 cycles
3. Agarose 2-5%，用1×TBE电泳 ①扩增后液 5μl + 1μl loading buffer ②溴化乙淀染色 20’，UV照射下确认泳带→照相
建议：在我们省内都采用S-P法
S-P法的优点
① 方法统一 ② 有配套的即用型抗体、试剂盒和显色试剂盒 ③ 一般2-3小时(30’-60’)，而ABC法需1天，分
子量小(60KD)，穿透力强 ④ 灵敏性高，特异性强，4个亚基都能于二抗上的生
物素结合，而且结合键强 ⑤ 背景低，非特异性反应少，等电点为6.5，接近于
固 定 液 ： 一 般 10% 中 性 缓 冲 福 尔 马 林 ， PH7.3-7.4(PBS配制)
固定时间：应少于24小时，固定时间越长， 抗原丢失越多
固定液量或组织块大小：组织为1/3，固定 液2/3
大体标本：切下一块固定
包埋：起初免疫组化对蜡温的要求很
严，温度一高会严重影响结果。现在由于抗 体质量的提高，以及抗原恢复方法的问世， 多数人又忽视了蜡温的问题。个人认为：尽 管有抗原修复方法，但不如开始就不使抗原 破坏，另外，蜡温过高，组织变脆，不易切 成大片，容易脱片。因此，要控制蜡温在 65℃以下
(八)免疫组织化学的发展
1. 免疫PCR：主要用于临床生物分子检测方面 血清(Ag)电泳+Ab+无关引物扩增→显色
意义：1. 原来较弱、水平较低的酶等，用免疫PCR 就可以检测出来
2. 需要较长或一定时间才能查出来 用免疫PCR法，就可提前查出来 如：病毒性心肌炎、血肿CPK检测 心梗早期心肌酶谱的检测等
备用
好的组织芯片 1. 制片过程中组织片不移位、不脱落 2. 组织样本的厚度以3mm为佳 3. 每张组织芯片为5μm 4. 一个芯片蜡块可切片100-200张 注：0.6mm组织片上约有30,000个细胞，2mm
的组织芯片约有100,000个细胞