雷公藤内生真菌的分离鉴定及抗肿瘤活性菌株筛选

通过对其 内生真 菌的分离鉴定 ， 研究其 内生 真菌 的分
类 和组成 ； 通过 体外 抗 肿瘤 活性 试 验 ， 选 获得 具 有 筛
显著抗 肿瘤活性 的菌株 ， 雷公 藤植 物 内生 真菌 的进 为
一
根据 内生真菌 主 要 的群 体 形 态 特征 点 （ 包括 菌 落 大小 、 颜色 、 面特 征 、 表 质地 ） 个体 形 态 特 点 （ 和 包 括 菌丝 、 子实 体 和孢子 形 态）ｌ删 。 ＿ １
次 报道 了从 云南 西 双 版 纳州 美 登 木 的 茎 、 中分 离 叶 筛 选 到 １株 内 生 真 菌 Ｃ ａ ｔｍｉｍ ｌｂ ｓｍ ９ ． ｈ ｅｏ ｕ ｇ ｏ ｏｕ ８
现 新 的生物 活 性 物 质 的重 要 来 源［ ］ ２ 。近 年来 人 们 。 已从药 用植 物 内生真 菌 中分离 得 到许多 具有 抗肿 瘤
活 性 的物质 。Ａ． ｉ ｌ 等从 短 叶 红 豆杉 内生 真 菌 Ｓｅ ｅ ｒ 中分 离 得 到 抗 肿 瘤 活 性 物 质 紫 杉 醇 。Ｚ ａ ｇ Ｌ ｈ ｎ ．
Ｍ６ 该 真 菌 可 产 生 抗 肿 瘤 活 性 物 质 球 毛 壳 甲素 。 ， Ｊ ｏＲ ｉ ．Ｈ．８ ａ Ｌ 等从 植物 Ｉ ｅａａｃｌ ｄ ｉ ｍｐ ｒｔ ｙｉ ｒ ａ得到 １ ｎ ｃ 株
ａ ｄ ｔ ｒ ｅｏ ｄ ｒ ．Ｆ ｖ ｆｔ ｅ ｅ ｈｂｔ ｄ ｓｇ ｉ ｃ ｎ ｙ ｏ ｏ ｉ ｃｉｉｉｓｔ ｗａ ｄｔ ｅ ｅｔ ｍｏ ｅｌ ｉｅ ｎｔ ｅ ｎ ｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｉ ｅｏ ｈ ｍ ｘ ｉ ｉ ｉｎ ｆ ａ ｔｅ ｔ ｔ ｘ ｃａ ｔｖｔｅ ｏ ｒ ｈ ｓ ｕ ｒｅ ｌ ｌ ｓｉ ｈ ｅ ｉ ｎ
Ｓｃ ｅ ｎ ｎ ｆＩ ｓ Ａｎｔｔ ｍｏ ｔｖ ｔｅ ｒ ｅ ｉ ｇ ｏ ｔ ｉｕ ｒ Ａｃ ｉｉｉ ｓ
Ｗ ＡＮＧ Ｊ ａ ｍｉ ｇ，Ｓ ｉ－ ｎ ｏＮＧ — ｉ ｎ ，ＬＩ Ｈｏ ｇ ｌａ ｇ Ｙａ ｑ ｏ ｇ Ｕ ｎ － ｎ ，ＬＩ Ｄｉ ｈ ｕ，ＹＡＮＧ ｎ － ｈ ， ｉ Ｕ ｏ ｚ Ｈｏ ｇ ｚ ｅ
Ａｂ ｔａ ｔ Ｏｂｅ ｔｖ ： ｏｉｏ ａｅｔ ｅｅ ｄ ｐ ｙ ｅｏ ｉ ｅ ｙ ｉ ｍ ｌ ｏ ｄ ｉａ ｄ ｓ ｒ ｅ ｓａ ｔｔ ｍｏ ｃ ｉｉｉｓ ｓｒ ｃ ： ｊ ｃｉｅ ｔ ｌｔ ｈ ｎ ｏ ｈ ｔ ｆＴｒｐｔｒ ｇ ｕ ｗｉｆ ｒ ｉ ｎ ｃ ｅ ｎ ｉ ｎ ｉｕ ｒａ ｔｖｔ ． ｓ ｔ ｅ
王 家 明 ，宋 亚琼 ，刘 宏 亮 ，刘迪 洲 ，杨 泓枯 ，李 乃 怡 ，张 朝 正 ，孙 华
（ 业发 酵 微生 物 教育 部 重 点 实 验 室 ， 津 科 技 大 学 生 物工 程 学 院 ， 津 ３ ０ ５ ） 工 天 天 ０ ４ ７
摘 要 ： 目的 ： 雷公 藤根 （ ｒｐ ｅｙ ｉｍ ｌ ｏ ｄ ｉ 茎及 叶 中分 离鉴 定 内生真 菌 ， 从 Ｔ ｉ ｔｒ ｇ ｕ ｗｉ ｒ ｉ） ｆ 并对 其 发 酵 产 物 进行体 外抗肿 瘤 活性 筛选 。方法 ： 用微 生物 纯化 方 法分 离雷公 藤 植 物 的 内生 真 菌 ，根 据 菌 落 采 形 态和 显微 特 征 对 菌株 进 行 分 类 鉴 定 。 选 用 ＨＣ 一 （ 结 肠 癌 细胞 ） Ｂ ｌ ４ ２ 人 肝 癌 细胞 ） Ｔ８ 人 、 ｅ ７０ （ 一 、 Ｂ ８ ３ 人 胃癌 细胞 ） Ａ５ ９ 人 肺 癌细胞 ） 指标 ， 用 ＭＴＴ 法对 发 酵产 物进 行 体 外 抗肿 瘤 活 性 ＧＣ ２ （ 、 ４（ 为 采
ＬＩＮａ － ｉ ｉｙ ，ＺＨ ＡＮＧ ａ － ｈ ｎｇ，ＳＵＮ ｕ Ｃｈ ｏ ｚ ｅ Ｈ ａ
（ ｙ Ｌ ｂ ｒ ｔ ｒ ｆ Ｉ ｄ ｓｒａ ｒ ｎ ａ ｉｎＭ ｉ ｏ ｉｌｇ Ｍ ｉｉｔｙｏ ｄ ｃ ｔ ｎ， Ｋｅ ａ ｏ ａ ｏ ｙ ｏ ｎ ｕ ｔｉ ｌ Ｆｅｍｅ ｔｔ ｃ ｂｏ ｏ ｙ， ｎ ｓｒ ｆ Ｅ ｕ ａ ｉ ｏ ｒ ｏ
移 至新 的 马铃 薯 葡 萄 糖 培 养 基 平 板 上 ， ８ ℃培 养 ， ２
经反 复几 次纯 化后 ， 即得 到雷 公 藤 内生 真菌 纯 培 养 物 。试验 中 主要采 用漂洗 液 检验 法来 检测 表 面灭菌 效果 ， 即把最后 一 次 漂 洗 材料 的无 菌 水 涂 布 于 马铃
内生 真 菌 （ ｎ ｏ ｈ ｔ ｕ ｇ） 指 其 在 生 活 史 ｅ ｄ ｐ ｙｉ ｆ ｎ ｉ是 ｃ
的某 一段 时 间生 活在 植 物 组 织 内 ， 植 物组 织 没 有 对
Ｑ． 等从 长 春花 内生 真 菌 中分 离 到 的抗 肿 瘤 活 性 嗍 物质长 春新 碱类 似物 。吴 运帏 ［ 等从 楸 树 中分离 得 ６
藤、 断肠草等 ， 卫矛科雷公 藤属 木质藤 本植 物 ， 为 主要 分 布在长 江 中下 游 地 区 ， 其药 用最 早 收 载于《 神农 本
草经 》 ］ ［ 。雷 公 藤 提取 物 中含有 二 萜 类 、 萜类 、 三 倍
次 ， 根、 、 待 茎 叶切面 处长 出菌 丝后 ， 挑取 其尖 端部 分
韧皮 部 。将 韧皮部 和 叶剪成 ０ ５Ｃ Ｉ ． ｍ 小片 。 ． ｌ ×０ ５ｃ Ｔ
把 处理过 的韧皮部 和 叶片 分别 植入 不 同浓 度 马铃薯
葡 萄糖 双抗 固体 培养 基 平 板 中， 皿植 入 ４ 每 ～５片 ，
肿瘤 细胞呈现 出细胞毒活 性 。由此 可见 ， 药用植 物 从
个新化 合物 ， ３个化合 物对 Ａ５ ９和 ＨＣ １ 这 ４ Ｔ１６２种
性 氯 浓度 的次 氯 酸钠 溶 液 浸 泡 ２ ～ １ ｉ， 无 Ｏｓ ５ｒ ｎ 用 ａ 菌水 漂洗 ４次 ， 无菌 纱布 蘸 干水分 ， 去根 和茎 两头 剪 褐变 部分 ， 其剪成 ０ ５ｃ 小段 ， 除木 质部 ， 留 将 ． ｍ 去 保
薯 葡萄糖 培 养基平 板 上 ， ８℃培养 ７ｄ ２ 。 ２ 分 类鉴 定 ． ２
半萜类 、 物碱类 等 多种 化学 成 分 ， 究 表 明其 具 有 生 研 抗肿瘤及 免疫抑制 等多种药理 活性 ＿ 他 。 目前 ， 】ｊ 国内
外对 其内生 真菌 研究 较 少＿。 ＿ 引。本研 究 的 目的在 于 ｌ 。
Ｍ ｅ ｈ ｄ ： ｅ ｄ ｐ ｙ ｉ ｕ ｇ ｒ ｎ ｅ ｔ ｉｄ ｂ ｔ ｏ ｓ ｎ ｏ ｈ ｔ ｆ ｎ ｉ ｗｅ ｅ ｉ ｄ ｎ ｉ ｅ ｙ ｍｏ ｐ ｏ ｏ ｙ Ｆ ｕ ｕ ｒ ｃ ｌ ｌ ｅ （ ＣＴ一 Ｂｅ一 ４ ２， ｃ ｆ ｒ ｈ ｌ ｇ ． ｏ ｒ ｔ ｍｏ ｅｌ ｉ ｓ Ｈ ｎ ８， ｌ７ ０ Ｂ ＧＣ８ ３ ２ ，Ａ５ ９ ４ ）ｗｅ ｅ ｓ ｌ ｃ ｅ ｈ ＴＴ ｓ ａ ． Ｒｅ ｕ ｔ ：ｓｘ ｙ ｆ ｕ ｔ ａ ｎ ｆｅ ｄ ｐ ｙ ｉ ｆ ｎ ｉ ｒ ｓ — ｒ ｅｅ ｔ ｄ ｉ ｔ ｅＭ ｎ ａｓｙ ｓ ｌｓ ｉ ｔ －ｏ ｒ ｓ ｒ ｉ ｓｏ ｎ ｏ ｈ ｔｃ ｕ ｇ ｗｅ ｅ ｉｏ
收 稿 日期 ： ０ １０ — ８ 修 回 日期 ：０ １０ — ５ ２ １—２１ ２ １ — ３ １ 基 金 项 目 ： 津科 技 大学 实验 室 开放 基 金 项 目 （０ ４ １ ） 天 １ ０ Ａ２ ０ 。 作者简介 ： 家明， ， 士， 王 男 博 主要 研 究 方 向 ： 生 物 工 程 及 药 物 化 学 。 微
筛选 。结果 ： 雷公藤 不 同器 官 中分 离得 到 ６ 从 ４株 内生真 菌 ， 形 态观 察 鉴 定 为 ３目， 经 ５科 ， ｌ属 。 １ 其 中 ５ 内生真 菌发 酵产 物对 不 同肿 瘤 细胞 具有 显 著选 择 性 细胞 毒 作 用 。结论 ： 株 雷公 藤 内生 真 菌
种 类 多样 ， 有很好 的研 究和应 用价值 。 具
Ｃ ｌ ｇ ｆＢｉｔｃ ｎ ｌｇ ｏｌ ｅ ｅ ｏ ｏ ｅｈ ｏｏ ｙ，Ｔ ａ ｊｎＵ ｉｅ ｓ ｙ ｏ Ｓ ｉ ｃ ｎ ｅ ｈ ｏｏ ｙ，Ｔ ａ ｉｎ３ ０ ５ ，Ｃ ｉａ ｉ ｎ ｉ ｎ ｖ ｒ ｉ ｆ ｃｅ ｅ ｄ Ｔ ｃ ｎ ｌｇ ｔ ｎ ａ ｉｎ ｉ ０ ４ ７ ｈ ｎ ）
Ｍ ＴＴ ｓ ａ ．Ｃｏ ｃｕ ｉｎ：ｔ ｅｅ ｄ ｐ ｙ ｉ ｆ ｎ ｉ ｎ Ｔ．ｗｉｆｏ ｄ ｉｗｅ ｅｄ ｖ ｒ ｉｙａ ｄｒｃ ａｓｙ ｎ ｌｓｏ ｈ ｎ ｏ ｈ ｔｃ ｕ ｇ ｉ ｌ ｒ ｉ ｒ ｉｅ ｓｔ ｎ ｉｈ，ｓ ｏ ｎ ｏ ｔｎ ｈ ｗｉ ｇｉ ｍｐ ｒａ ｔ
ｌｔｄ ｆｏ ｔ ｅｈ ａｔ ｙｒ ｏ 。ｓｅ ａ ｄ １ａ ｆＴ．ｗｉｆｏ ｄｉ，ｗｈｃ ｅｏ ｇ ｄｔ ｌｖ ｎ ｇ ｎ ｒ ，ｆ ｅｆｍｉ ｅ ， ａ ｅ ｒ ｍ ｈ ｅ ｌｈ ｏ ｔ ｔ ｍ ｎ ｅ ｆ ｏ ｌ ｒ ｉ ｉｈ ｂ ｌｎ ｅ ｏｅｅ ｅ ｅ ｅ ａ ｉ ａ ｌ ｓ ｖ ｉ
内生真菌 中可以筛选获得 具有抗 肿瘤 活性 的物 质 。 雷公 藤 （ ｗｉ ｏｄ ｉ 又名 黄 藤 、 ｌ ｒ ｉ） ｆ 黄藤 木 、 腊 黄
用 封 口膜将 培养 皿密 封 ， 置于 培养 箱 中 ，８ ２ ℃倒置 培
养 ， ４ｈ内完 成 内生 真 菌 的 分 离 工 作 。１ ２ ｈ观 察 １
关键 词 ：雷公藤 ； 内生真 菌 ； 肿瘤 活性 ； 抗 ＭＴＴ 法
中 图分类 号 ：￥ ６ ． ５ ７ ３ １ 文献标 志 码 ： Ａ 文章 编号 ：０ １７ ６ （ ０ １ ０ —１ ５０ １ ０ － ４ １ ２ １ ）５０ ４ — ４
Ｉｏａｉｎｏ ｎ ｏ ｈ ｔ ｕ ｇ ｒｍ ｉ ｔｒ ｇ ｕ ｌ ｏ ｄ ｉａ ｄ ｔ ｅ ｓｌｔ ｆ ｄ ｐ ｙ ｉ Ｆ ｎ ｉ ｏ Ｔｒｐ ｅｙ ｉ ｍ ｗｉ ｒ ｉ ｎ ｈ ｏ Ｅ ｃ ｆ ｆ
ｖ ｌ ｆｄｅ ｌ ｐｍ ｅ ． ａ ｕｅ ｏ ｖｅｏ ｎｔ
Ｋｅ ｒ ｓ ｙ ｗｏ ｄ ：Ｔｒｐ ｅｙ ｕ ｌ ｒ ｉ ；ａ ｔ ｔ ｍｏ ｃ ｉｉｙ；ｅ ｄ ｐ ｙ ｉ ｆ ｎ ｉ ＴＴ ｓ ａ ｉ ｔｒ ｇｉ ｎｗｉｆｏ ｄ ｉ ｎ ｉ ｕ ｒａ ｔ ｔ — ｖ ｎ ｏ ｈ ｔｃ ｕ ｇ ；Ｍ ａ ｓｙ
引起 明显危 害 的真 菌＿ 。植物 内生 真菌 的次 级代 谢 １ ］
产 物 种类 繁多 、 架新 颖 、 物活 性 多 样 ， 骨 生 已成 为 发
到 １ 木 霉 属 内 生 真 菌 ， 代 谢 产 物 对 肝 癌 细 胞 株 其
ＨｅＧ２具 有强 的体 外 抗 肿 瘤 活性 。张 玲 琪［ 等 首 ｐ ７
１ ６ ４ Biblioteka 西 北 林 学 院学 报
内生真 菌 Ｃ ａｔｍ ｕ ｌ ｏｕ Ｉ ＢＥ １ ， 代谢 产 ｈ ｅ ｉｍ ｇｏ ｓｍ Ｆ － ０ ９ 其 ｏ ｂ 物 ｃ ａｔｇｏ ｏｉｓ 人 鼻 咽 表 皮肿 瘤 Ｋ ｈｅｏ ｌｂ ｓ 对 ｎ Ｂ细胞 具 有 抑制 活 性 。Ｍ． Ｗａ ｅａｒ Ｍ． ｇｎ ａ 等从 薄 荷 类 植 物 Ｄ — Ｅ ｃｒｎ ｒ ｒｔ ｃｎ ｅａ ｄ ａｆ ｕｅ ｅｓ的 １ 内生 真菌 发 酵液 中得 到 ３ ｓ 株
西 北 林 学 院 学 报 ２ １ ，２ （ ） ４ ～ １ ８ ０ １ ６ ５ ：１ ５ ４
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆＮｏ ｔ ｗｅ ｔＦ ｒ ｓ ｒ ｉ ｅ ｓｔ ｏ ｒ ａ ｏ ｒｈ ｓ ｏ ｅ ｔｙ Ｕｎ ｖ ｒ ｉｙ
雷 公 藤 内生真 菌 的 分 离 鉴 定 及 抗 肿 瘤 活 性 菌 株 筛选