2015-1 第6章 植物内生菌资源

3.1 植物内生真菌
依据其宿主类别、定殖方式 、生态功能、进化关系可
将其分为两大类：即麦角类内生真菌 （clavicipitaceous endophyte)和非麦角内生真菌 （nonclavicipitaceous endophyte)。
麦角类内生真菌：一些与禾草、牧草等共生的内生真
菌；（分泌麦角碱，致人畜中毒，无症状、系统和、 种子携带） 裸子和被子植物等维管植物中分离获得的内生真菌。
要处理方法要求。 2、植物内生菌样品预处理的基本方式有哪些（列举即可） 3、查网络资源，写出下列培养基的配方。TSA; R2A ; SNA
附SNA：SNA培养基是synthetic low nutrient agar的缩写，即合成低营养
琼脂，是用来培养串珠镰刀菌的。在SNA上培养产生小型分生孢子， 成链状或假头状。 配方：磷酸二氢钾 1.0g/L，硝酸钾1.0g/L，七水硫酸镁0.5g/L，氯化 钾0.5g/L，葡萄糖0.2g/L，蔗糖0.2g/L，琼脂15g/L。 使用：将菌株接种到SNA平板上，持续的黑光灯（Philips TL 40W/08），17℃培养。经过10~14天后检查：取1平方厘米左右的带菌 培养基涂片，在显微镜下观察。记载小孢子产生与否及其产生方式， 大型分生孢子的形状和大小，足孢有无，顶细胞特点以及产孢细胞的 性状，子囊壳的产生及色泽等，按其分种检索特征初步鉴定到“种”。
Strobel教授的研究成果：从巴塔哥尼亚北部植物心叶 船型果木中分离到一株粉红黏帚菌（G.roseum)可以产 生数十种中等碳链长度的碳氢化合物，而且这类化合 物正是很好的生物能源材料。
参考资料：生物燃料（biofuel）泛指由生物质组成或萃取的固体、液
4.1 植物内生菌的天然产物 4.2 植物内生菌在农林业生产中的应用 4.3 内生菌在环境植物修复（phytoremediation)中的应用 4.4 植物内生菌在生物能源开发中的应用
4.1 植物内生菌产生的天然产物
植物内生菌与宿主相互作用及应用情况图（222页）
（一）选择植物来源 Strobel：理性进行内生菌分离和天然产物开发的策略
4.1 植物内生菌产生的天然产物
紫杉醇类：红豆杉属植物、落羽松等中广泛存在紫杉
醇产生菌，同时这些菌也分属许多不同的属中。（教 材225页）
生物碱类：主要从传统药用植物中提取，如雷公藤、
长春花、喜树、……，也还包括一些内生放线菌。 （四）其他类活性物质
4.2 植物内生菌在农林业生产中 的应用
R2A培养基也是沉 降法检测环境微 生物的标准配方
http://www.hopebiol.com/standard/kingsb.htm
2.4 分离培养基
（二）放线菌分离培养基
在内生放线菌的分离中，由于放线菌的生长缓慢，通
常培养一个月左右才在植物表面有菌落长出。因此， 想获得尽可能多的放线菌，既要尽量抑制真菌和其他 细菌的生长，同时也要尽可能避免影响内生放线菌的 生长。
（一）促生作用
内生菌促进植物生长的机制多样化，包括促进矿物质
和营养物质的吸收和利用，释放促进植物生长的激素， 调节植物自身激素的合成，提供氮、磷元素，或协助 增强植物与菌根真菌或根瘤菌的共生作用。提高植物 对病原菌的抵抗能力，对环境压力的护等也最张达到 促进植物生长的效果。 1）提高营养状况 2）发酵提取物 3）产生促进植物生长的物质（含某些小分子的代谢物）
Entophytic Relationship
第一节 植物内生菌的发现及其研究意义
一、内生菌现象及概念
1879年 De Bary对这一现象进行了描述。 Stone的定义：植物内生菌（endophyte)指这样一类微
生物，即被它们所感染的宿主植物不会或至少暂时不 会表现出明显的症状，能超乎在植物组织内观察到或 是从严格表面消毒的植物组织中分离得到，抑或是从 植物组织中直接扩增到其核酸DNA。
（一）内生菌协助植物修复有机污染环境
注意：利用基因工程改造的内生菌回接植物组织从而
提高植物修复效率的策略（图6-4） （二）内生菌协助植物修复有毒金属污染环境 （三）协助植物修复复合污染环境
4.4 植物内生菌在生物能源开发 中的应用前景
2008年11月微生物学杂志报道了美国蒙大拿州立大学
通常这类内生真菌可以促进植物生物量的积累，提高
其耐旱能力，产生一些对动物有毒害的化学物质。
3.1 植物内生真菌
（二）非麦角类内生真菌
至今有超过1000篇文献对非麦角类内生真菌的报道 分为三类：
1）包含丰富物种，通常能在植物体根、茎、叶部位形
成广泛的定殖；通过种种或地下茎传播；在根际分布 少；可赋予植物非环境适应性和环境适应性；生长于 恶劣环境中的植物被此类内生真菌感染的频率高达 90%~100%。
因此：目前内生微生物的定义涵盖性上看，实质上包
括了定殖于植物组织内部的任何微生物。
第一节 植物内生菌的发现及其研究意义
二、研究意义
生态学意义：多种营养形式，影响到植物与食草动物
之间的关系。
相关的研究方向（请掌握）：群落组成、生物学特性、
生物多样性、种群生态学、进化生物学、内生菌与宿 主及草食动物的相互作用及它们所产生的代谢产物多 样性。 巨大的遗传多样性宝库，大量丰富新物种的来源。
本节为重点掌握内容。
2.1 样品的采集
1.植物样品的鉴定与采集地点的具体定位与记录；
2.根据研究目的与经验采集植物的不同部位； 3.样品的预处理：①修剪成长短适宜的组织块，用75%
乙醇擦拭样品表面，或短时间浸泡、灼烧，使表面干 燥后，用石蜡封住切口，放入无菌塑料袋，并保存于 低温盒中带回实验室；②将乙醇初步处理后的样品保 存于磷酸缓冲液中。 4. 样品的保存：通常保存于4℃中，并尽量缩短从采 样到分离操作的时间，减少组织表面腐生菌对内生菌 的影响。
4.1 植物内生菌产生的天然产物
（二）抗生素类物质 植物内生菌产生的抗生素不仅对大量植物病原菌具有抑制或致
死作用，同时对许多引起人类和动物疾病的细菌、真菌、病毒 和原生动物也同样有防治作用。 例：内生真菌-雷公藤中分离的内生真菌、佛罗里达榧树中分离 到的小孢拟盘多毛孢、卷柏、青蒿、玉米；内生细菌-绿黄假单 孢菌、赤杨、蛇藤、银桦、蓬莱蕉、姜科植物…… （三）抗肿瘤物质 最典型的例子：1993年美国学者Stierle等首次从短叶紫杉的树皮 中分离获得一株能产紫杉醇(taxol)和其他紫杉烷类化合物的内 生菌新物种-安德紫杉菌。这一发现的意义在于，为利用微生物 发酵法生产紫杉醇，并为解决紫杉醇药源危机提供了一条新途 径，由此掀起了从药用植物中分离内生菌的热潮。
4.2 植物内生菌在农林业生产中 的应用
（二）生防作用 1. 内生真菌在生防中的应用 2. 内生细菌在生防中的应用 （1）产生抗菌物质 （2）酶解活性 （3）竞争优势 （4）诱导宿主系统抗性 （三）增强宿主抗逆性 （四）植物生长抑制剂
4.3内生菌在环境植物修复中的应 用
3.3 植物内生放线菌
云南大学云南省微生物所放线菌研究室开展药用植物
内生放线菌的资源研究。 部分成果见教材。 研究进展讨论（基于16sRNA，基因的免培养技术；马 铃薯、水稻、滇南美登木等，放线菌。）
3.4 影响内生菌分布的因素
（一）地理环境 （一个实验；两个地理区域中分布最多 的物种：恶臭假单孢菌、巨大芽孢杆菌；同种菌在不同环 境遗传特征已经发生变化，体现了菌株的适应性与遗传变 迁）
应该注意四个方面：
4.1 植物内生菌产生的天然产物
①生物于独特甚至极端环境条件下，并拥有自身独特
的生存机制的植物； ②具有民族、土著药用历史的植物，以及药用化学成 分已经被详细研究过的植物，其内生菌有可能产物和 宿主细胞相同或类似或比植物本身活性更强的活性化 合物； ③本土植物，拥有较长的生长时期，或者生长在某个 较为古老的地带； ④生物多样性丰富地区的植物，如生长于热带或亚热 带地区的植物各类比生长于干旱和寒冷地区的植物各 类丰富，其内生菌的多样性也相对较高。
（二）植物物种（植物物种不同意味着根构型、表面结 构、根分泌物成分及菌根化损伤等非植物体因素也不相同， 直接导致最初从根部入侵的细菌种类。） （三）植物基因型（不同基因型的宿主植的生物化学
成分的差异，直接影响到其内生细菌的群落组成。）
思考题
1、说明内生菌分离纯化时，样品采集及表面消毒时的主
2.3 样品预处理
（一）组织块分离法
（二）组织浸渍法 （三）组织离心法
（四）真空与压力抽取植物体液
（五）其他方法
2.4 分离培养基
（一）细菌分离培养基
TSA：大豆酪蛋白琼脂培养基。 酪蛋白胰酶消化物 15g 大豆粉木瓜蛋白酶消化物 5g 氯化钠 5g 琼脂 15g 纯化水 1000ml
3.2 植物内生细菌
（一）植物内生细菌分布（典型的植物、 典型的部位，
216页，表6-1） （二）内生固氮细菌（一些不形成根瘤的类别） （三）潜在人体病原菌（植物组织中分离到病原细菌, 如蜡状芽孢杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、黏质沙雷氏菌、 嗜麦芽寡养单胞菌；1995年由紫花苜蓿幼苗内的沙门 氏菌引起的疾病爆发，种子已经感染）
这一概念为目前比较接受，即教材所说：一切生活在
植物体内的腐生、寄生或共生的真菌、细菌、放线菌 等，也包括了那些潜伏在宿主体内的病原微生物。
第一节 植物内生菌的发现及其研究意义
Petrini 1991:内生微生物的定义应该强调，感染寄主时
不表现出症状，但是经过一段潜伏期后，可能也会引 起病害。 Hirsch & Braun 1992：定殖于于活体植物组织内，且 不引起任何即时的、明显的负面影响的真菌。
2.2 表面消毒
1.Samish等总结比较总结不同的消毒技术后，推荐的
标准消毒技术程序：首先用自来水或商品净化剂反复 冲洗植物材料表面，按照材料的不同决定不同次氯酸 钠、乙醇或是升汞的最佳消毒时间，再用无菌水冲洗， 最后，用无菌滤纸吸干水分。其中次氯酸钠与乙醇联 用，是最常用的表面消毒程序。 2.特殊的处理：吐温20、吐温80和TritonX-100等表面 活性剂，可以减少溶剂的表面张力，使其充分作用于 植物表面的凹陷处 3.检验表面消毒效果的方法：3种方法（教材208页）
3.1 植物内生真菌
2）主要或只在植物地上部分的组织内在在 水平传播；
形成高局部性的感染；对宿主植物的有益或有害作用 不存在环境特殊性；多样性水平高。
3.1 植物内生真菌
3）专指深色有隔内生真菌。即一群定殖于植物根内的
小型土壤真菌，包括功能和分类上都不确切的多种真 菌。这类真菌在定殖模式在不同的植物中相似，即菌 丝颜色较深、具有明显的横隔，广泛存在于健康植物 根的表皮、皮层、甚至维管束组织的细胞内或细胞间 隙，能够在植物细胞内或细胞间隙形成“微菌核”， 但不会在根组织内形成病原菌所引起的病理学特征。
许多研究者认为，一些贫营养的培养基和土壤放线菌
分离常用的部分经典培养基，在内生放线菌的分离中 均取得了较好的效果。
2.4 分离培养基
（三）真菌分离培养基
（四）特殊目的菌选择性分离培养基 （五）添加抑制剂
推测地球上每一种植物，无论是单子叶还是双子叶植物都有内 生菌存在。 植物内生菌资源的研究主要采用纯培养（culture-dependent)和 免培养（culture-ihdependent)技术与手段。
非麦角类内生真菌：能从无症状的非维管植物及蕨类、
3.1 植物内生真菌
（一）麦角类内生真菌
一小部分进化上相关的麦角菌物种，比较难于培养，
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
且仅与一些冷暖型草种共生，通常能在植物的茎内形 成细胞间的系统性感染，主要通过垂直形式传播，从 植物母体通过种子传播给下一代。 Clay &Schardl又将这一类内生真菌分为Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ型。 （含义掌握）