内生真菌研究进展

植物内生真菌研究进展

植物内生真菌（Endophytic fungus）是指在生活史中某一阶段或整个阶段存在于健康植物组织内部，对植物组织没有引起明显病症或对宿主没有造成明显伤害的真菌。内生真菌在植物组织中普遍存在，具有丰富的物种多样性。它是生活在植物组织内的一类微生物, 是植物微生态系统中的天然组成成分，且长期生活在植物体内的特殊环境中, 与寄主协同进化, 根据内共生理论, 内生真菌可能产生与宿主相同或相似的具有生物活性的次生代谢产物。1898年，Vogl等人从黑麦草Lolium temulentum L. 种子内分离出第一株内生真菌，引起了人们对植物内生真菌的注意。特别是美国学者从短叶红豆杉Taxus brevifolia的韧皮部分离到一株产抗癌物质紫杉醇的内生真菌，更是掀起了各国学者对内生真菌的研究热潮。

1 植物内生真菌的研究方向

内生真菌活性成分的筛选有两条思路。一是根据部分内生真菌具有合成和宿主植物相同或相似活性成分的能力这一特点，从药用植物中寻找具有合成确定化合物的内生真菌，常用方法是对分离得到的内生真菌培养液提取物通过色谱技术、单克隆抗体免疫检测等手段来确定该内生菌是否有产生目的化合物的能力。这一思路目标明确、针对性强、工作量相对较小，是目前从内生真菌中筛选活性物质的主要方法，采用这种方法已从多种资源缺乏的药用植物的内生菌中分离得到了和宿主植物相同或相似的活性物质。这种思路具有一定的偶然性，因为不能证实所有的植物中都存活着具有合成和宿主植物相同或相似活性物质的内生真菌。二是按照传统的化合物分离纯化鉴定的思路，寻找未知但具有特定活性的化合物。首先是按照目的选择不同的筛选模型进行活性菌株的筛选。其次是对筛选出的活性菌株发酵培养、分离纯化活性物质，再对活性物质进行理化研究及结构鉴定。

2 内生真菌药用活性物质及其生物学作用

2.1 抗肿瘤活性物质

2.1.1萜类化合物

紫杉醇是存在于各种紫杉属植物树皮和树叶中的萜类化合物, 被当今世界上认为是广谱、活性最强的抗癌药物。由于紫杉属植物中紫杉醇含量极低，加之紫杉属植物生长极其缓慢，自然资源非常缺乏。1993 年美国学者Stierle 等首次从短叶紫杉( Taxus brevifolia) 的韧皮部中分离出一种新的内生真菌( Taxomyces an2dreanae)，可在半合成培养液中产生紫杉醇和紫杉烷类化合物。这一发现为用微生物发酵法生产紫杉醇以解决紫杉醇药源危机提供了一条新途径，并成为从药用植物中分离内生菌热潮的开端。2006年, 田仁鹏等从生长在

湖北的南方红豆杉树皮中韧皮部分离出一株能产紫杉醇的菌株TPF6, 其发酵液中紫杉醇含量为84.5 g /L。2008年, 孙端方等从罗汉松中分离到了1株产紫杉醇内生真菌EPTP1, 对Vero 细胞表现出明显的致细胞凋亡作用。赵凯等从东北红豆杉中分离筛选到1株能够产生紫杉醇菌株HD18123,发现其紫杉醇产量为206.34 g /L, 而且该菌株的发酵提取纯化产物对HeLa细具有较强的抑制作用。产生紫杉醇的内生真菌具有丰富的物种多样性。这些内生真菌既有新种, 如安德紫杉菌; 也有新记录种, 如树状多节孢菌; 更多的则是常见的真菌, 如链格孢菌、头孢菌等。当前, 对产紫杉醇内生菌的开发利用研究正在进行之中, 已在菌株生产、发酵条件、分子生物学等基础研究方面取得了较大的进步。

2.1.2生物碱类

如从长春花茎皮中分离到能产生长春新碱的内生真菌, 从雷公藤中分离到产生细胞松弛素的内生真菌, 从美登木Naytenus hookerii Loes的茎和叶中分离到可产球毛壳甲素的内生真菌。由于美登木自身合成的抗癌活性成分是美登素(maytensine)，这一研究表明，植物内生真菌不仅能产生与宿主成分相同或相似的活性物质，有的还能产生与宿主成分结构不同而作用相似的活性物质。

2.1.3苯丙素类

如从桃儿七的茎中，南方山荷叶，川八角莲中分离到可产鬼臼毒素的内生真菌, 鬼臼毒素能够抑制微管蛋白的解聚作用和阻断中期相细胞分裂，并具有抑制DNA 拓扑异构酶活性，是合成多种抗癌药物的前体，其糖苷衍生物etoposide 和teniposide毒性较低，对小细胞肺癌、淋巴癌等多种肿瘤疾病均有很好的疗效而被美国FDA 批准上市。从野茼蒿Crassocep halumcrepid ioides中分离到能产生异香豆素类似物的内生真菌等。

2.2 植物生长调节物质类

内生真菌长期和宿主植物生活在一起, 对植物的生长发育具有很重要的作用。许多植物内生真菌可产生吲哚乙酸、吲哚乙腈和细胞激动素等植物生长激素，能够促进植物生长，从而表现出感染内生菌的植株一般比未感染内生菌的植株生长速度快的现象。袁志林等研究发现, 大戟科植物内生真菌B3分泌吲哚乙酸和脱落酸等植物生长调节剂。勇应辉等把大戟内生真菌接种到大戟组培苗, 将建立共生后的组培苗移栽室外, 生长1年后检测生物量和萜类的量, 结果发现内生真菌E4和E5均促进了宿主植物生长, 并能同时促进其萜类的合成。张集慧等从天麻、石斛等兰科药用植物中分离到的5 种内生真菌中，检测到赤霉素、吲哚乙酸、脱落酸、玉米素、玉米素核苷等植物激素。从假单孢菌属、肠杆菌属、葡萄球菌属及固氮菌

属内生细菌的一些菌株分离到乙烯、生长素、细胞激动素等生长调节物质。研究表明，内生菌产生的此类物质，能够增强宿主对环境胁迫如干旱、低温、环境污染等的抗逆性,维持宿主在非生物胁迫环境下的正常生长。

2.3 其他作用药用植物内生真菌具有一些其他有益的生理作用, 如抗结核、抗疟疾、防虫害、保鲜等。

3 内生真菌的研究方法

培养基的选择在内生真菌的分离过程中是非常重要的，通常是应用“非选择性”培养基，以利于尽可能的分离到更多的真菌，目前内生真菌可以在所有的人工培养基上生长，如麦芽提取物琼脂培养（MEA），马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）等。但是一些快速生长的和容易产孢的菌株经常覆盖了生长缓慢的菌株，所以需要通过一些方法减慢或限制真菌的快速生长，便于分离到生长较慢的菌株，以达到更全面的调查内生真菌群落的组成。现在的方法是在琼脂培养基中加入一些具有轻微杀真菌的试剂以限制菌株的快速生长，但是它们并不引起细胞的死亡，如放线菌酮（cycloheximide）等。

与一般微生物鉴定相比, 内生菌的鉴定较为复杂, 例如很多内生真菌离开植物体就不易产生孢子, 这给鉴定工作带来相当的难度。因此可以结合现代分子生物学手段进行内生菌鉴定。分子技术在内生真菌的分类学中也有广泛的应用，在对真菌系统发育进化研究中，主要采用片段分析如RAPD、PCR-RFLP和DNA序列分析等分子技术，这些技术是当前比较成熟和主流的技术。

4. 植物内生真菌在天然药物研究中的存在的问题和发展前景

近二十年来，虽然内生真菌的研究的到重视，并在内生真菌的入侵机理、系统学、生态学和资源开发方面开展了一系列研究工作，但是对很多问题还不是很清楚，缺乏全面系统的研究，而且绝大多数植物的内生真菌还没有被研究。