土壤酶指标测定

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土壤生物化学指标测定

一、土壤脱氢酶(dehydrogenase)活性测定(比色法)

(一)分析意义脱氢酶能酶促脱氢反映,它起着氢的中间传递题的作用。在土壤中,碳水化合物和有机酸的脱氢酶作用比较活跃,他们可以作为氢的工体。脱氢酶能自基质中析出氢而进行氧化作用。

(二)方法选择与原理Lenhard(1956)最先提出用TTC作为氢的受体生成红色的TF,进行闭塞测定,以溶液的光密度值表示酶活性。

后来对上述的方法做了不同的改进和完善。用土壤有机质作为氢的供体或用葡萄糖做氢的供体,用生成的TF数量或换算成氢的体积来表示脱氢酶的活性。

(三)试剂配制

1、0.5%TTC溶液

2、甲苯

3、Tris-HCl缓冲液Ph7.6:0.1M三羟甲基氨基甲烷(12.114g/L)50ml 与0.1MHCl

38.5ml混合后,用水稀释至100ml。

4、硫化钠

5、0.1mol/L葡萄糖溶液。

(四)实验步骤

1、标准曲线的绘制:称取相当于50mg纯品量的已烘干的TTC于50 ml比色管中,定容,制成1 mg/L的母液。分别向6支50ml比色管中依次注入1、

2、

3、

4、

5、6mL mg/ml 标准TTC溶液,用蒸馏水定容,是为工作液:取7只带塞比色管(50ml)依次加入2 mL Tris-HCl演算缓冲液,1 mL不同浓度的TTC工作液,1 mL10%硫化钠新配溶液,摇匀,放置20分钟;反应完全后,准确加入10ml甲苯,振摇。完全提取TF,稳定数分钟,取上层有机溶液在紫外分光光度计492nm处闭塞(在比色皿中也需稳定2分钟)绘制标准曲线。

2、操作过程:取0.5g新鲜土壤,置于50ml 比色管中,依次加入2mlTris-HCl盐酸缓冲液、1ml 0.1mol/L葡萄糖溶液、1ml 0.5% TTC溶液,震荡均匀,离心(4000转/分)5分钟后,将甲苯提取液在分光光度计492 nm处闭塞测定。同时设无土壤和无TTC的对照(以蒸馏水替代)。

3、结果计算:脱氢酶活性=TF含量/0.5g —土壤含水量

脱氢酶活性,以24h后1g干土中TF的生成量表示。

二、土壤过氧化氢酶(catalase)活性的测定(滴定法)

(一)分析意义过氧化氢酶广泛存在于土壤汇总和生物体内。土壤过氧化氢酶促过氧化氢

的分解有利于防止它对生物体的毒害作用。过氧化氢酶活性与土壤有机质含量有关,与微生物的数量也有关。一般认为,土壤中催化过氧化氢分解的活性,有30%或40%以上是耐热的,即非生物活性,常由锰、铁引起催化作用。土壤肥力因子与不耐热的即过氧化氢酶活性成正比。

(二)方法选择与原理本法是基于用高锰酸钾滴定酶促反应前后,过氧化氢的量,由二者

之间的差求出分解H2O2的量,以此来表示酶的活性。

2KMnO4+5 H2O2+3H2SO4------2MnSO4+K2SO4+8H2O+5O2

(三)试剂配制

1、0.3% H2O2

2、3N硫酸

3、0.1N高锰酸钾(优级纯)溶液。

(四)实验步骤

1、操作过程:取2g 新鲜土壤,置于小口100 ml小口三角瓶中,并注入40ml 蒸馏水和5ml 0.3% H2O2,塞上塞子,将三角瓶放在恒温振荡机上(25 0C),震荡20 分钟。而后迅速加入5ml 3N硫酸,以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中的悬液用慢速型滤纸过滤。然后,吸取25ml滤液,用0.1N高锰酸钾滴定至淡粉红色终点。

2、结果计算:用于滴定的、土壤滤液所消耗的高锰酸钾量为B,用于滴定25ml原始过氧化氢混合液的所消耗的高锰酸钾量为A。

过氧化氢酶活性=(A—B)/2g —土壤含水量

酶活性以1g敢图分钟内消耗0.1N高锰酸钾ml数表示。

三、土壤多酚氧化酶(polyhphenol oxidase)活性的测定(比色法)

(一)分析意义多酚氧化酶参与土壤有机组分中芳香族化合物的转化作用。土壤中的酚类物质在多酚氧化酶作用下氧化生成醌。醌与氨基酸等通过一系列生物化学过长鞥

所合成最初的胡敏酸分子。所以,多酚氧化酶是腐殖化的一种媒介,他是土壤氧化

还原酶中了解的较多的一种酶。

(二)方法选择及原理在空气存在的情况下,多酚氧化酶能酶促一元酚、二元酚、三元酚氧化成醌。根据基质的变化,测定多酚氧化酶的三种方法如下:

1、比色法:多酚氧化酶酶促邻苯三酚,用乙醚提取生成的紫色没食子素;比色着色的

乙醚相,用紫色没食子素表示酶活性。此种方法具有速度快的优点,闭塞技术要求

求严,培养PH值要准确,并且范围较窄。是目前广为应用的一种方法。

2、碘量滴定法:本法根据多酚氧化酶酶促基质生成的醌,在酸性条件下,用标准碘液

滴定生成稳定的蓝色络合物,以碘的体积表示酶的活性。此法要注意保证反应所需

要的酸度,对碱性土壤应加过量的酸,才易于判断滴定终点。

3、测压法:本法用Warburg呼吸器,测定在多酚氧化酶作用下消耗用于氧化多酚化合

物的氧量,表示酶活性。此法要求仪器设备,且测定样品所需要时间较长。测定

多酚氧化酶常用的基质有邻苯二酚和邻苯三酚,由于测定多分氧化酶是基于测定加

入土壤的多酚的演化速度,一般邻苯三酚氧化得最快,故常用邻苯三酚为基质,以

比色法进行测定。

(三)试剂配置

1、1%邻苯三酚溶液

2、乙醚

3、0.5N盐酸

4、重铬酸钾标准溶液:取0.75g K2Cr2O7 (优级纯)溶解於1L0.5N HCl(相当于50ml醚中

含5mg紫色没食子素)

5、PH4.5柠檬酸—磷酸缓冲液:0.2M磷酸氢二钠.2 H2O(分子量=178.05,35.61g/L)

9ml与0.1N柠檬酸. H2O(分子量=210.14,21.01g/L)11ml混合而成。

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