离体血脑屏障模型的建立

（１）内皮细胞之阈存在非常复杂的紧密连接ｍｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＴＪ）【２】，它可阻断血 液承载物质弥散透过屏障。当将电子致密示踪剂辣根过氧化酶注入脑的供血动脉 时，很快在脑内血管充盈，但全部被内皮细胞间的紧密结合所阻挡，不能进入脑 实质。当将辣根过氧化酶注入蛛网膜下腔时，可很快弥散到血管周围的胶质细胞 的足突之间并通过管腔外的基底膜，但不能穿过细胞间的紧密连接。内皮细胞的 紧密连接是血脑屏障的最基本的解剖基础。所有内皮细胞之间都有复杂的连接， 但通常电阻很低（５．１０ Ｄ．／ｃｍ２），而血脑屏障紧密连接处的电阻却很高（２００ ｆ／／ｃｍ２），
式提出了血脑屏障（ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ．ｂａｒｒｉｅｒ ＢＢＢ）的概斜”。但直到２０世纪６０年代，
电子显微镜的研究才揭示了斑脑屏障的解剖学基础。
１．１．Ｉ．１血脑屏障的解剖学特征
脑毛细血管是由内皮细胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）和周皮细胞（ｔｘ，ｉｅｙｔｅｓ，具有类似 平滑肌性质的细胞）构成，星形胶质细胞（ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）足突包绕毛细血管外周， 覆盖其９５％－９９％的表面。人们原以为星形细胞足突构成了血脑屏障，但是电子 显微镜研究证实（１９６０年），脑毛细血管内皮细胞是构成血脑屏障的关键解剖位 点。血脑屏障的功能是由于脑毛细血管内皮细胞的特殊性质所决定的，脑和周围 器官的毛细血管超微结构的特点有所不同。
（ＢＢＢ）ｗｈｉｃｈ ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ ａ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ
ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｉｎ ａ ｆｉｒｓｔ ｓｔｅｐ，ｂｒａｉｎ ｒｎｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｎｅＷ
血管允许物质无选择地弥散透过血管壁。位于四个脑室内的脉络丛的脑毛细血管 通透性较高，这是因为，此处的脑血管内皮细胞具有窗孔样结构。高度血管化的
Ｔｈｅ ａｉｍ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｗａｓ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ，ａｂｕｎｄａｎｔｌｙ ａｖｍｌａｂｌｅ，
ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ
ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ｉｔｓ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｂｙ ｓｏｍｅ ｔｅｓｔｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｍｅａｓｕｒｅ ｏｆ
ｔｍｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ＴＥＥＲ）ａｎｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ． Ｒｅｍｉｔｓ：（１）Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｆｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅ—ｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ
Ⅶ
浙江ｆ：业人学学位论文原剖性声明
本人郑重卢明：所提交的学何论文是本人在导师的指导Ｆ，独立进行研究Ｉ：作所取得的研究 成果。除文中已经加以标注引＿ＬＩｊ的内弈外，本论文不包含其他个人或集体己经发表成撰弓过 的研究成果，，也不含为获得浙江ｌ：业人学或其它教育机构的学位证ＩＳ而使＿ＬＩｊ过的材料。对 本文的研究作出重要贡献的个人雨Ｉ集体，均己在文中以明确方式标明。本人承担本卢明的法 律责任。
浙江工业大学 硕士学位论文 离体血脑屏障模型的建立 姓名：吴非 申请学位级别：硕士 专业：微生物与生化药学 指导教师：宋必卫
20070501
浙江Ｔ业人学硕ｌ：学位论文
离体血脑屏障模型的建立
摘要
血脑屏障（ＢＢＢ）是隔离中枢神经系统与外周组织的生理性屏障，大多数的 小分子物质和几乎所有的大分子物质都无法穿越ＢＢＢ入脑。因此ＢＢＢ是中枢神 经系统药物开发的主要限制因素。由于在体状态下对ＢＢＢ的研究存在技术困难， 建立ＢＢＢ体外模型（ＢＢＢＭ），对中枢神经系统药物的研发有重要意义。．
本文的目的在参阅文献的基础上，建立一种由脑微血管内皮细胞与星形胶 质细胞共培养，具有良好的形态和结构功能，便于大量培养和复制的体外血脑屏 障模型。实验方法：首先，通过匀浆，过滤，密度梯度离心，胶原酶消化等步骤 分离ＳＤ新生大鼠的脑微血管内皮细胞进行培养，第二步，分离大鼠大脑皮质中 的星形胶质细胞进行培养，最后，将两种细胞分别接种于多孔滤膜的两面进行共 培养。模型建立后，通过跨细胞膜电阻（ＴＥＥＲ）的测量以及通透性测试等对模 型的功能特点进行评估。实验结果：（１）对分离的脑微血管内皮进行了形态观察， 并对生长曲线进行了测定，细胞在培养７—９天后显示了典型的“铺路石”样形 态并形成细胞单层。（２）星形胶质细胞显示了良好的生长形态和胶质纤维酸性蛋 白ＧＦＡＰ）表达。（３）两种细胞共同培养建立的血脑屏障模型显示了较低的通透 性和较高的跨细胞膜电阻（ＴＥＥＲ）。结论：通过脑微血管内皮细胞和星形胶质 细胞的共培养，可建立符合生理，药理学研究要求的高质量体外血脑屏障模型。 养，可建立符合生理，药理学研究要求的高质量体外血脑屏障模型。 关键词：血脑屏障，血脑屏障模型，脑微血管内皮细胞，星形胶质细胞。
ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ仃ａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｈｉｇｈ
ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ＴＥＥＲ）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：Ａ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ｍ够ｓ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＢＢＢ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ
浙江工业大学顾Ｉ：学位论文
Ｋ＋因而不能通过。
Ａ：ＴＪ的分子基础及信号调节
利用冰冻断裂复型技术发现，玎象围绕在细胞四周的“焊接线”，相邻细胞
细胞膜被焊接线“焊接”在一起，形成了绳索样的连接物。一般认为该连接物是由 成串排列的特殊跨膜蛋白组成，相邻细胞的“嵴线”相互交联封闭了细胞之间的空
隙。
Ｂ：ＴＪ的分子构成 ＴＪ主要由跨膜蛋白和胞质附着蛋白两种成分组成，细胞骨架（主要是微丝）
作者签名：莹辞｝
日期：弘Ｄ了年ｆ月罗口日
学位论文版权使用授权１５
本学｛帚论文作者完全了解学校有关保留、使川学位论文的规定，同意学校保留井向国家有天 部ｆ ｊ或机构送交论文的复印什币Ｉ电子版，允许论文铍布阅羊¨借阅。本人授权浙江Ｉ‘业人学可 以将本学位论文的全部或部分内弈编入有天数据库进行检索，可以采刚影印、缩印或扫描嚣 复制手段保存平¨汇编本学位论文。
浙江Ｔ业大学硕ｔ学位论文 ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｌｏｏｋｅｄ ｌｉｋｅ ｔｙｐｉｃａｌ‘＇ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅｓ”ａｆｔｅｒ ａｂｏｕｔ ７～９ ｄａｙ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ
本学传论文属丁．
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２、不保密口。
（请在以上相应方框内打。√”）
作者签名：
剔币签氢尔乎己
日期：
年
月
日
日期咖刁年ｆ月７口日
浙江丁业人学颂Ｉ：学位论文
第一章文献综述
１．１血脑屏障
１．１．１血脑屏障的结构与功能
由血液运载的物质在进入脑组织的途中需通过一道屏障，人们对它的认识至 少已经有一个世纪的历史。１９世纪末，德国细菌学家Ｅｈｒｌｉｃｈ发现注入机体的染 料可以将全身所有器官染色，却独独不能将大脑染色。后来，Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋｙ和 Ｇｏｌｄｍａｎ观察到只有将酸性活体染剂注入到蛛网膜下腔才能使脑组织染色，而 注入到血流中却不能，于是人们找到了血脑屏障存在的证据。由此，Ｇｏｌｄｍａｎ正
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Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ．Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ（ＢＢＢ）ｉｓ ａ ｂａｒｒｉｅｒ ｓｏｐａｒａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＣＮＳ）ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ，Ｓｉｎｃｅ ｉｔ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ＞９８％ｏｆｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ～１００％ｏｆ ｌａｒｇｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ（ＢＢＢ）ｉｓ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ （ＣＮＳ）．Ｂｅｃａｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｖｉｖｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｓｔｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｆｏｒ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｍｏｄｅｌ（ＢＢＢＭ）ｔｈａｔ ｐｒｅｓｏｒｖｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ＣＮＳ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．
ｇｒｏｗｔｈ．（２）Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）．０）Ｔｈｅ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ
ｂｏｒｎ ＳＤ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ａｎｄ ｓｕｂ－ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂｙ ｈｏｍｏｇｅｎａｔｃ，ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ， ｄｅｎｓｉｔｙ ｅｅｎｔｒｉｆｉｇｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｌｏｒａ
ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ
ｃａｎ ｂｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｙ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ，Ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｍｏｄｅｌ，ｂｒａｉｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，ａｓｌｒｏｃｙｔｅｓ．
ｎｅｗ ｒｏｏｍ ＳＤ ｒａｔｓ ｆｏｒ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ．Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ，ａ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｂｒａｉｎ
ａｓｔｒｏｃ螂Ｏｌｌ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ（ＢＭＥＣ）ｏｎ ｔｒａｎｓｗｅｔｌｓ，ｗｉｔｈ
ｔｈｅ ｂｏｔｔｏｍ
ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｏｆ ｌｒａｎｓｗｅｌｌ Ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｂｅｓｉｄｅｓ，ｗｈｅｎ ｔｈｅ ＢＢＢ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ
也是组成ＴＪ的重要组成部分。在１了的下方存在粘着连接，通过粘着斑连接蛋 白与为钙粘素的延伸形成跨膜网架。ＴＪ与粘着连接在维持ＢＢＢ稳定方面共同发
挥作用。
Ｃ：ＴＪ的信号调节
许多胞质信号分子聚集在ＴＪ复合物上并参与信号级联反应以调控ＴＪ的形
成和分解。其中Ｃａ２＋调节ＴＪ活性【３】，磷酸化调节ＴＪ结构的完整性１４１，另外胶 质细胞，ＰＫＣ，异源三聚体Ｇ蛋白和小ＧＴＰ结合蛋白也参与对ＴＪ的调节净７】。
（２）屏障毛细血管内皮细胞相对缺乏饮液囊泡（ｐｉｎｏｅｙｔｏｔｉｅ）及窗孔 （ｆｅｎｅｓｔｒａｔｉｏｎ）。在周围器官及脑内缺乏血脑屏障的部位（如脑室系统），血液承载的 极性物质是被动地扩散穿过细胞间隙，以及通过特殊的胞浆窗，液相或受体调控
的入胞作用（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）而透过毛细血管壁。
。
（３）为支持耗能转运，线粒体数目增加。这些解剖学特点与特殊的转运系统 造成了屏障对水溶性化合物选择性的通透。周围器官的毛细血管内皮细胞则含有 窗孔和较多的饮液囊泡，且细胞之间缺乏紧密结合，这就决定了周围器官的毛细