血脑屏障模型的建立与评价

血脑屏障模型的建立与评价

作者：田成林

作者单位：解放军总医院神经内科 100853

刊名：

国外医学(神经病学神经外科学分册)

英文刊名：FOREIGN MEDICAL SCIENCES SECTION ON NEUROLOGY & NEUROSURGERY

年，卷(期)：2002，29(2)

被引用次数：5次

1.Gaillard PJ;Voorwinden LH;Nielsen JL Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier,comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes 2001(03)

2.FISCHER S;Wobben M;Kleinstuck J Effect of astroglial cells on hypoxia-induced permeability in PBMEC cells 2000(04)

3.A kiyama H;Kondoh T;Kokunai T Blood-brain barrier formation of grafted human umbilical vein endothelial cells in athymic mouse brain 2000(01)

4.Franke H;Galla H;Beuckmann CT Primary cultures of brain microvessel endothelial cells:a valid and flexible model to study drug transport through the blood-brain barrier in vitro 2000(03)

5.Biegel D;Spender DD;Pachter JS Isolation and culture of human brain micro-vessel endothelial cells for the study of blood-brain barrier properties in vitro 1995(1-2)

6.Kuchler-Bopp S;Delaunoy JP;Artault JC Astrecytesinduce several blood-brain barrier properties in non-neural endothelial cells 1999(06)

7.Gargett CE;Bucak K;Rogers PA Isolation,characterization and long-term culture of human myometrial micro-vascular endothelial cells 2000(02)

8.Gaillard PJ;vander Sandt IC;Voorwinden LH Atrocitiesincrease the functional expression of P-glycopretein in an in vitro model of the blood-brain barrier 2000(10)

9.Sobue K;Yamamoto N;Yoneda K Induction of bloed-brain barrier properties in immortalized bovine brain endothelial cells by astrocytic factors 1999(02)

10.Yamagata K;Tagami M;Nara Y Astrocyte-conditioned medium induces blood-brain barrier properties in endothelial cells 1997(24)

11.Hurst RD;Fritz LB Properties of an immortalized vascular endothelial/glioma cell co-culture model of the blood-brain barrier 1996(01)

12.Scism JL;Laska DA;Horn JW Evaluation of an in vitro coculture modelfortheblood-brain

barrier:comparison of human umbilical vein endothelial cells(ECV304) and rat glioma cells(C6) from two commercial sources 1999(10)

13.Tan KH;Dobbie MS;Felix RA A comparison of the induction of immortalized endothelial cell impermeability by astrocytes 2001(07)

14.Schroeter ML;MullerS;Lindenau J Astrocytes induce manganese superoxide dismutase in brain capillary endothelial cells 2001(11)

endothelial cells:a possible use of aortic endothelial cell forin vitro BBB model 1996(5-6)

1.学位论文范祥血脑屏障体外模型的建立及冰片对其影响的研究2004

目的使用体外血脑屏障模型,观察冰片对血脑屏障的影响,探讨冰片促进其他物质透过血脑屏障的方式,阐述冰片的"开窍"机制.方法采用大鼠脑微血管内皮细胞、星型胶质细胞共培养技术,建立血脑屏障体外模型,以跨内皮细胞间电阻、多药耐药相关基因表达等指标,观察冰片对血脑屏障体外模型的作用.同时,应用分析化学(高效液相与质谱联合应用)的方法,检测冰片对丹酚酸B通过血脑屏障的影响.结果1.成功培养大鼠脑微血管内皮细胞,应用细胞共培养池,进行脑微血管内皮细胞与星型胶质细胞共培养,建立血脑屏障体外模型.2.星型胶质细胞与脑微血管内皮细胞共培养可以提高血脑屏障特异性酶--γ-谷胺酰胺转肽酶、碱性磷酸酶的表达.3.星型胶质细胞可提高脑微血管内皮细胞跨细胞间电阻,促进血脑屏障中内皮细胞紧密连接的形成.4.冰片在

60min和24h内对血脑屏障体外模型跨细胞间电阻均没有明显改变.5.冰片与丹酚酸B联合应用可显著抑制血脑屏障体外模型脑微血管内皮细胞多药耐药相关基因的表达,而二者分别应用时无此作用.结论1.冰片对血脑屏障紧密连接无直接的开放作用.2.冰片与丹酚酸B联合应用抑制脑微血管内皮细胞上多药耐药相关基因的表达,可能是其促进其他物质透过血脑屏障、发挥"开窍"作用的机制之一.

2.期刊论文冯洁.叶丽亚.张文健.刘杰文.娄晋宁.李成辉.FENG Jie.YE Li-ya.ZHANG Wen-jian.LIU Jie-wen.LOU

Jin-ning.LI Cheng-hui人血脑屏障体外实验模型的建立及缺氧-复氧对其通透性的影响-中国医药生物技术

2008,3(2)

目的 建立人血脑屏障体外实验模型,并探讨缺氧-复氧对血脑屏障模型通透性的影响.方法 将分离、纯化的人脑微血管内皮细胞(HB-MVEC)在细胞插入器上培养至汇合状态,以液面试漏试验确定血脑屏障模型的形成,并通过形态学检查、跨内皮细胞电阻(TEER)测定和辣根过氧化物酶(HRP)通透率对血脑屏障模型进行鉴定;以未达汇合状态的HB-MVEC及培养至汇合状态的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为对照.观察缺氧.复氧处理(缺氧2h和复氧1、2、4、8、24h)和缺氧-复氧时存在白细胞激活产物(缺氧2 h后在有白细胞激活产物存在情况下复氧1 h)对血脑屏障模型通透性的影响,以及前列腺素E、α1抗胰蛋白酶和丹参单体764-3对血脑屏障模型的保护作用.各项实验均观察3孔细胞.结果 HB-MVEC在细胞插入器培养至汇合状态后,液面试漏试验呈阳性;扫描电镜观察显示细胞间无间隙,透射电镜检查证实细胞间存在紧密连接.血脑屏障模型、未达汇合状态HB-MVEC和HUVEC的TEER分别为(46.0±1.3)、

(30.8±1.4)、(7.5±2.1)Ω/cm2;向细胞插入器内加入含HRP的培养基培养1 h后,HRP通透率分别为0.17%±0.03%、0.26%±0.04%和0.94%±0.07%;缺氧

2h和复氧1、2、4、8、24h HRP通透率分别为3.97%±0.94%、6.06%±0.75%、7.17%±0.18%、7.96%±0.47%、8.57%±0.62%、10.37%±0.78%.血脑屏障模型缺氧2 h后在有白细胞激活产物的情况下复氧1 h,其HRP通透率为8.87%±0.76%,明显高于无白细胞激活产物组(7.20%±0.87%);而前列腺素E、α1抗胰蛋白酶和丹参单体764-3能够减弱这种情况下的血脑屏障模型通透性增加,3组的HRP通透率分别为7.08%±0.89%,6.01%±0.57%和5.53%±0.62%.结论 应用HB-MVEC可以构建血脑屏障体外模型,缺氧.复氧明显增加血脑屏障模型的通透性,前列腺素E、α1抗胰蛋白酶和丹参单体764-3具有保护血脑屏障模型的作用.

3.学位论文杨钰楠微泡联合诊断超声波开放血脑屏障及促药跨膜转运的研究2008

背景与目的：

Vykhodtseva首次发现超声波能开放血脑屏障，开创了利用超声技术穿颅骨治疗的新领域，且对脑组织损伤甚微，扩大了无创性开放血脑屏障的研究前景。这一超声技术不同于以往的超声治疗领域，而是利用具有诊断作用的超声波频率和强度在一定剂量的超声造影剂作用下无创性开放辐照区的脑部血脑屏障，且这种作用为可逆性开放，达到了最低危险程度开放血脑屏障。故超声联合微泡开放血脑屏障成为近年国内外研究的热点。

血脑屏障本身的特殊解剖学结构达到了对外来物质通过的严格选择性，从而维持了脑内环境的稳定，确保脑的正常代谢和生理功能，对人体大脑起到了很好的保护作用。在脑部疾病的治疗方面，BBB又被认为是阻止化疗药物进入脑组织进而影响疗效的主要原因，导致抗癌等药物无论是静脉注射还是动脉灌注，都难以在脑组织达到有效浓度，不能充分发挥疗效，如原发性脑瘤或继发性脑瘤等疾病的治疗，均需要药物直接在脑部发挥作用。因此药物在脑组织的疗效不仅取决于病灶对药物的敏感性，更主要的是取决于血脑屏障对药物的通透性，从有创性鞘内或脑室穿刺直接给药产生的技术操作要求较高且感染风险的限制性应用，到对药物进行脂溶性化学修饰、改变分子量大小和电荷，设计出对BBB内皮细胞的天然载体如葡萄糖、氨基酸、肽类载体，均是具有高度亲和力的水溶性药物，无创性促进药物跨过BBB，使之在脑内能达到有效的浓度，是神经医学发展的重点。而通过超声波技术构建多功能的跨BBB药物转运系统也逐步走向新的超声治疗研究领域。

超声联合微泡辐照脑组织，是基于静脉注射用于增强血管显影的微泡造影剂后，以一定强度与频率照射脑部，通过一系列示踪手段与检测方法证实血脑屏障开放，达到无创性可逆开放血脑屏障。

以上关于超声联合微气泡开放BBB的确切机制尚不明确，还需进一步的深入研究论证，但可以肯定的是，其原理不同于高渗性溶液和其他有创性开放BBB的方法。本研究的目的是通过建立体外血脑屏障模型，探讨超声联合微泡辐照作用下，血脑屏障通透性发生改变的机理与安全性，结合动物在体实验研究，对比分析超声联合微泡对BBB的影响，为将来的临床治疗提供试验依据。

方法：

1.小鼠脑微血管内皮细胞的分离与传代培养：BALB/c小鼠脑组织块经0.1％胰酶消化后，筛网机械分离，最后不同密度Percoll液分层得到脑微血管内皮细胞，在含有高浓度内皮细胞生长添加剂的内皮细胞专用培养基纯化培养后传代，得到稳定的脑微血管内皮细胞源；倒置显微镜常规观察细胞形态及生长规律；BMVEC接种于涂有明胶的盖玻片上，待生长呈单层后采用链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物法检测内皮细胞特有VIII因子表达，鉴定分离培养的细胞是否为内皮细胞；透射电子显微镜观察细胞内部结构；四甲基偶氮唑比色实验描绘细胞生长曲线。

2.将BMVEC培养在具在特殊质材和孔径的Transwell小室上建立BBB体外实验模型；试漏实验初步判断BBB的形成；实时电阻测量BBB体外模型跨内皮细胞电阻；体外BBB模型HRP实时通透性实验；细胞内部结构、表面形态与分布、紧密连接蛋白-1行透射电镜、扫描电镜、激光共聚焦显微镜检测。建立体外经人颞骨标本血脑屏障细胞模型：颞骨片经福尔马林消毒后涂抹上耦合剂置于细胞小室上，模拟经颅骨超声声窗条件，供体池注入微泡后进行超声辐照。

3.超声联合微泡开放血脑屏障通透性的可逆性及安全性评价：应用水听器对研究中所应用的超声探头进行声学相关参数的测定，筛选出最佳超声频率与强度，为研究超声引发相关生物学效应提供量化考查指标；探讨跨内皮细胞电阻实时测定与通透性发生改变的关系；实验后细胞再培养3 d，观察表面形态结构改变以及电镜观察超微结构的变化，以考察微泡介导下超声辐照对血脑屏障通透性影响的发生机制与安全性；免疫组化检测紧密连接ZO-1蛋白表达是否与通透性相关；酶标仪检测辣根过氧化物酶的通透量，描绘通透曲线，探讨通透性增加的规律。

4.超声联合微泡提高BBB模型通透性的机理研究：根据分组在模型中加入自制的脂膜氟烷超声造影剂，约2.0×107个左右微泡；采用经颅超声诊断仪辐照，时间10 min。分为4组，每组4个样本：(1)对照组；(2)微泡组；(3)超声组；(4)超声联合微泡组。经上述处理后，光镜和电镜观察BBB细胞膜及超微结构改变，免疫组化检测紧密连接ZO-1蛋白表达；在不同的时间点检测TEER和HRP的通透性，探讨可逆性开放BBB的机理。

5.微泡介导诊断超声波辐照促顺铂跨血脑屏障转运的实验研究：根据是否加入微泡和超声辐照，分为四组：(1)对照组；(2)超声组；(3)微泡组

；(4)超声联合微泡组。每组添加浓度为5ng/μl的生物素胶体金50μl和顺铂，顺铂达到9μg/cm2，供池定容在460μl，分别于超声辐照后再培养

48h，并于再培养不同时间点从受池中取样，待所有取样结束后，采用高效液相色谱检测顺铂的通透量；透射电镜观察细胞膜与细胞内超微结构的变化以及胶体金的分布；实验前后细胞小室行扫描电镜能谱分析。

6.伊文思蓝示踪实验：Sprague-Dawlty大鼠，固定麻醉消毒铺巾，去除大鼠颅骨，加载经处理后的人颞骨标本：将各组动物按分组给予相应处理

30min后开胸，插管，灌注，直至从剪开的右心房内流出的液体变澄清，开颅取出脑组织，称重，浸于含甲酰胺液体中，淬取，并用DU800紫外分光光度仪测定淬取液在EB溶液最大吸收峰处的光密度值得到EB的通透量。

7.超声联合微泡促顺铂跨血脑屏障转运的体内实验研究：同EB检测实验过程与步骤处理后，解剖开颅，冰台上取出脑组织，迅速在液氮中冷冻，称