酵母展示系统 Fc诱导展示实验步骤

诱导培养基配制Selective scFv (or Fab or ligand) Induction Media

1x (SG-CAA)成分：

5 g/L casamino acids (-ade, -ura, -trp) (BD Bacto #223050)

1 g/L galactose

1 g/L raffinose（棉子糖是自然界中最知名的一种三糖，由半乳糖、果糖和葡萄糖结合而成）0.05 g/L glucose

7g/L YNB Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate w/out amino acids (BD Difco 233520)

2.7 g/L Na2HPO4

3.7 g/L NaH2PO4

配制方法：

10X 10%半乳糖

称取100g溶于1000ml水中

②推荐过滤除菌高压灭菌

10X 10%棉子糖

①称取100g溶于1000ml水中

将

②推荐过滤，高压灭菌即可

20%葡萄糖

①称取200g溶于1000ml水中

②推荐过滤除菌，根据经验，高压灭菌即可

10X 10%半乳糖

10X YNB

①称取70g溶于1000ml水中

过滤除菌

1X SG – CAA

①称取 5 g 酪蛋白水解物

2.7 g Na2HPO4(6.8g Na2HPQ4.12H2O)

3.7g NaH2PO4(

4.8. NaH2PO4.2H2O)

②加入500ml水中，定容至700ml高压灭菌

③加入10X 10%半乳糖100ml、10X 10%棉子糖100ml 、20%葡萄糖2.5ml、

10X YNB100ml混匀

4度保存。有效期为1-2个月

抗体诱导展示实验步骤：

对照设置：

pYD说明书参考对照设置：

可选对照：EBY100/pYD-Fv 不诱导（阴性对照）

步骤：

1.挑单克隆至10ml SD-CAA（葡萄糖生长培养基）中，250rpm，30℃，摇过夜。

2.第二天测菌液浓度，OD600应在2-5之间。

如果小于2，继续培养至OD600=2-5，或直接进行步骤3

如果大于5，进行步骤3

注：通常OD600<2，展示抗体的细胞数将减少，OD600<5，诱导展示抗体的时间将延长

3. 3000-5000 x g 室温离心5-10min。

4.用SG-CAA（半乳糖诱导培养基）重悬至OD600=1，以保证细胞继续处于对数生长期，例：如果OD600=2，则重悬在20 SG-CAA培养基中。

5.立刻取出2OD600的细胞，作为诱导起始点样本（0h）.例：OD600=1，应取

4ml。

6.250rpm，20℃，诱导培养。通常20℃会有更多的细胞展示抗体。

7.每隔12h取一次样，直到第48h（ie:0h,12h,24h,36h,48h）以确定最佳诱导时间。（取出的细胞4度保存，不要冻存细胞）

表达检测

1.各个时间点收集的细胞3000-5000 x g ，4℃离心5-10min。

2.用1XPBS重悬，再离心

3.收集细胞，用250ul 1XPBS，1 mg/ml BSA，and 1ug antibody重悬混匀

4.冰上放置30min，期间混匀几次

5.3000-5000 x g ，4℃离心5-10min

6.1XPBS洗一次

7.用1X PBS, 1 mg/ml BSA, and 1ug anti-mouse IgG重悬混匀

8.检测