蛋白质相互作用

Y
t h u s f o r m i n g a f u n c t i o n a l t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t o r . . . X
Y
do we get expression of the reporter?
r e p o r t e r g e n e
t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t o r
a c t i v a t i o n d o m a i n
D N A b i n d i n g d o m a i n
U A S ( u p s t r e a m a c t i v a t i o n s e q u e n c e )
实验的关键
1.实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同 和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用 在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别 是多抗的特异性是问题。 2.为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液 必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。 3.考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出 抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上 清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原 被稀释。
t r a n s c r i p t i o n m a c h i n e r y
g e n e
and now back to the question...
Yeast two-hybrid system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions Regulation of gene expression in yeast
And now we introduce genes coding for two hybrid proteins.....
r e p o r t e r g e n e
Yeast two-hybrid system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions Regulation of gene expression in yeast
利用western blot 确定捕获蛋白
通过质谱确定捕获的蛋白
实验注意事项
（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有 蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（np40或 triton x-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确 定。不能用高浓度的变性剂（0.2 sds)，细胞裂解液中要加各 种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。 （2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用 （3）使用对照抗体： 单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗； 兔多克隆抗体：正常兔IgG (4) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外 源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生； (5) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加 抗体后不会引起共沉淀； (6) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的 溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。
To understand the method we must first consider how gene expression is regulated in yeast......
Yeast two-hybrid system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions Regulation of gene expression in yeast
试 验
亲 和 印 迹
免 疫 共 沉 淀
荧 光 共 振 转 移 技 术
Pull down
噬 菌 体 展 示 技 术
酵 母 双 杂 交 技 术
基 因 外 抑 制 子
合 成 致 死 筛 选
融合蛋白pull-down实验
融合蛋白pull-down技术基本原理是将 一种蛋白质固定于某种基质上(如 Sepharose),当细胞抽提液经过该基质时， 可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸 附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液 流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液 或洗脱条件而回收下来。
t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t o r
a c t i v a t i o n d o m a i n
D N A b i n d i n g d o m a i n
U A S ( u p s t r e a m a c t i v a t i o n s e q u e n c e )
t r a n s c r i p t i o n m a c h i n e r y
g e n e
D o thBiblioteka Baidue s e p ro te in s b in d ?
Y
X
X
X Y
o u r t w o h y b r i d p r o t e i n s b i n d !
yes, we have expression of the reporter indicating that the proteins bind!
GST-Pulldown Assay
GST pull-down assay
免疫共沉淀 (co-IP)技术
基于与蛋白质 X 与 Y的生理性相互作用，如果用蛋白 X 的抗体免 疫沉淀X，则蛋白质Y也可能沉淀下来。Y的这种免疫沉淀被称为免 疫共沉淀(co-immunocipitation, Co-IP)，此法最常用于测定两种目标 蛋白质在体内的结合。
A Y B
裂解细胞 免疫共沉淀蛋白质X
Y
原
理
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation） 是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础 的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。 是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相 互作用的有效方法。
原
理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞 内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保 留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那 么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。这种 方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合； 也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
酵母双杂交
Yeast Two Hybrid Assay
• Benefits:
– Simple
– Inexpensive – Scalable and automatable
Yeast two-hybrid system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions
蛋白质相互作用的研究方法
数量有限 DNA 转录 复 杂 的 调 控 复杂性 蛋白质 培养条件 多变性 直接 反应 生命 现象 基因
结构相对 稳定
细胞特 异性基 因表达
mRNA 翻译
蛋白质 生理状态 蛋白质相互作用 温度
应激 状态
药物作用
有一些蛋白质可以以单体的形式 发挥作用，但是大部分的蛋白质 都是和伴侣分子或是与其他蛋白 质一起发挥作用的。
Co-IP工作示意图
Co-immunoprecipitation
Y
Y
binding
wash
elution
实验步骤
1. 收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂）， 冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°c， 最大转速离心30 min 后取上清； 2. 取少量裂解液以备western blot分析，剩余裂解液加1μg相 应的抗体加入到细胞裂解液，4°c缓慢摇晃孵育过夜； 3. 取10μl protein a 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次， 每次3,000 rpm离心3 min； 4. 将预处理过的10μl protein a 琼脂糖珠加入到和抗体孵育 过夜的细胞裂解液中4°c缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与 protein a琼脂糖珠偶连； 5. 免疫沉淀反应后，在4°c 以3,000 rpm 速度离心3 min，将 琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解 缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×sds 上样缓冲液，沸 水煮5分钟； 6. sds-page, western blotting或质谱仪分析。
人类蛋白质组相用
蛋白质－蛋白质 蛋白质－核酸间相互作用研究
蛋白质-蛋白质相互作用的形式
1、蛋白质亚基的聚合
2、交叉聚合 3、分子识别 4、分子的自我装配 5、多酶复合体
蛋白质之间的相互作用力
• 氢键
• 范德华力
• 疏水键 • 离子键
蛋白质相互作用研究方法
生物物理学方法 分子生物学方法 遗传学方法
一是鉴定与已知融合蛋白相互作用的 未知蛋白质 二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存 在相互作用
实验方法：
1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一明确的重 组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译cDNA表达得到的 未知蛋白） 2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4º C 2h 3）离心弃上清 4）沉淀加入2× 蛋白Loading Buffer煮沸，离心 5）取上清进行SDS-PAGE电泳， 6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析 确 定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做Western Blot来确定沉降 的蛋白中是否有目的蛋白 该实验设立GST对照，反应均在4º C进行
优
点
1. 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的， 处于天然状态； 2. 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的， 可以避免人为的影响； 3. 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复 合物。
缺 点
1. 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－ 蛋白质相互作用 2. 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而 可能有第三者在中间起桥梁作用； 3. 如用western blot检验，必须在实验前预 测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗 体，若预测不正确，实验就得不到结果。
Suppose we have two proteins...
X
Y
and the question, do these two protein bind each other?
One way of answering this question is to use the yeast two hybrid method.
酵母双杂交系统 常用的DNA结合结构域: GAL4（1-147） LexA（E.coli 转录抑制因子）
常用的转录激活结构:
GAL4（768-881） B42（ E.coli ）
VP16（疱疹病毒）
工 作 原 理
t r a n s c r i p t i o n m a c h i n e r y
g e n e
D ot h e s e t w o p r o t e i n b i n d ?
Y
X
We start with yeast possessing a reporter gene (a gene making a product that is easy to detect).
固定诱 饵蛋白 （1）
洗脱 （2）
结合
（3）
检测 （6）
收集
洗脱 （4）
（5）
为了更有效地利用pull-down技术，可以将待纯化地蛋白以融合蛋 白地形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化地配体蛋白相融合。
GST Pull-down方法 此方法的基本原理是：利用重组技术将诱饵蛋白 与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋 白通过GST与固相化在载体上的GTH （Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白 有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合 物混合时就可被吸附而分离
t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t o r
a c t i v a t i o n d o m a i n
D N A b i n d i n g d o m a i n
U A S ( u p s t r e a m a c t i v a t i o n s e q u e n c e )