第一章：基因打靶概述

二，什么是转基因动物（transgenic animal)
美国FDA：A transgenic animal is defined as an animal which is altered by the introduction of recombinant DNA through human intervention. This includes two classes of animals; those with heritable germline DNA alterations, and those with somatic nonheritable alterations. （转基因动物就是一种GE animal！）
猪
“十一五”和“十二五”期间
“863”计划 以技术探索为目标
国家重大科技专项（转基因新品种培育） 以家畜育种为目标（猪、牛、羊） 十三五继续滚动支持
第三节 转基因技术和基因打靶技术的用处
一，基因功能研究
分子水平-细胞水平-个体水平的有机结合： 基因的生理学功能 启动子、内含子等调控序列的作用 组织特异性和发育阶段特异性表达功能与机制 复杂的生物学过程：
生长发育、脑功能、行为学、免疫学
二，疾病模型（医学）
用于观察疾病发生过程，评估治疗效果 遗传病 如：LAM2敲除导致肌肉营养失调综合症
但目前世界上尚无一例转基因家畜品种获得商业化许可
转基因鱼—目前唯一一种获得商业许可的、用于食品 消费的转基因动物
转生长激素基因的Atlantic salmon (rDNA: opAFP-GHc) AquaBounty Technologies, Inc
四，医药（生物反应器）
第一个种获得商业许可的转基因动物产品 (转基因山羊产 生的Recombinant Antithrombin, rAT or ATryn®，GTC Biotherapeutics )
2,20世纪80年代：转基因技术建立
1980, Gordon, et al. PNAS, 小鼠, 原核注射 1982，Palmiter, et al. Nature, 小鼠，高表达rGH 1985, Hammer, et al. Nature, 转基因家畜（兔, 绵羊, 猪）
3, 20世纪90年代前半期：转基因技术在家畜的广泛应用 （主要是生物反应器）
基因工程（或遗传工程）：(Genetic Engineering, GE)
美国FDA： Genetic engineering is a process in which scientists
use recombinant DNA (rDNA) technology to introduce desirable traits into an organism. Genetic engineering involves producing and introducing a piece of DNA (the rDNA construct) into an organism so new or changed traits can be given to that organism .(明确：主要使用重组DNA技术来改变 生物性状）。 GM和GE可以用于动物、植物、微生物及其产品，是比较 正式的专业术语。
二， 基因打靶技术
1，20世纪80年代前半期：胚胎干细胞技术发明
1981, Evans and Kaufman , 1984， Bradley et al. Nature Nature
2, 20世纪80年代后半期：小鼠基因打靶技术发明
1987， Doestschman T，et al. Thomas and Capecchi, 1989， Trompson, et al. Schwartzberg, et al. Nature Cell Cell Science
三，什么是基因打靶（Gene 源自文库argeting)
基因打靶是对染色体上的特定基因位点进行精确修饰 的一种技术。又称定向基因转移技术，故基因打靶可以被 看做是一种特殊的转基因技术。基因打靶和转基因的共同 之处是都通过将外源重组DNA导入动物体来产生可遗传的 基因修饰。基因打靶技术在早期也称为同源重组技术。 基因打靶包括：
在科学界，转基因动物被定义为“由于外源DNA导入动物基因组而产 生了可遗传的改变，这样的动物叫转基因动物”（陈永福，《转基因动 物》）。科学界对转基因动物的狭义定义主要指外源DNA被整合到生殖系 中（即可遗传），而不包括非生殖系整合的体组织基因导入。 具体含义： －转基因动物体内含有导入的外源DNA片段 －外源DNA必须整合到动物的基因组中 －动物的所有细胞基因组中都应含有导入的DNA －外源DNA可通过生殖细胞遗传给后代
属于转基因动物范畴的基因改变 1，外源DNA片段至少整合到一条染色体的一个位点上； 2，外源DNA的插入使基因组中任何一个基因的结构发生改变 3，外源DNA的插入使染色体发生重排 4，导入可持续存在的遗传实体，如人工染色体 不属于转基因动物范畴的基因改变： 1. 由于化学品诱发的基因改变 2. 由于辐射导致的基因改变 3. 胞质细胞器的转移, 如线粒体. 4. 通过核移植交换遗传物质 5. 使用基因治疗技术导入DNA
4. 20世纪90年代后半期：体细胞克隆转基因技术诞生 1997，Wilmut，et al. Nature, 绵羊 1997, Schnieke, et al. Science,绵羊 1998，Cibelli，et al. Science,牛
5. 21世纪至今：以体细胞克隆技术为基础的家畜转基因迅速发展
基因敲除（knock out)，删除特定位点的基因(主要应用）
基因敲入（Knock in )，在特定位点增加基因
四，转基因技术与基因打靶技术的区别
1，目的 基因打靶：灭活基因功能 转基因：增加基因功能 2，基因来源 基因打靶：内源性 转基因：外源性 3，整合方式 基因打靶：定点整合 转基因：随机整合 4, 载体 基因打靶：打靶载体，主要考虑重组效率 转基因：表达载体，主要考虑表达效率 5，载体来源 基因打靶：侧翼序列必须与靶动物/细胞同源 转基因：调控序列与靶动物/细胞可以是异源的 6，技术路线 基因打靶：ES-嵌合体途径；体细胞克隆途径 转基因：显微注射；精子介导；反转录病毒载体， ES－嵌合体途径；体细胞克隆途径
第四节 我国的转基因和基因打靶技术
1. 猪、鱼基因工程育种 “ 863”七五、八五计划, 转羊MT/猪GH基因:
转大马哈鱼和草鱼GH基因： 2. 乳腺生物反应器 “863”九五、十五计划重大专项,
3. 异种器官移植 “ 863”九五计划, 转hDAF基因：
猪(1989), 兔(1990) ， 绵羊(1991), 鱼(1986) （1995-2005）
第二节 发展简史
一，转基因技术
1，20世纪70年代：早期的转基因研究
1971, Brackett, et al. PNAS, 兔, 精子载体 1974, Jaenisch, et al. PNAS, 小鼠,反转录病毒囊胚注射 1976, Jaenisch, et al. PNAS, 小鼠，反转录病毒感染
转SV40病毒大T 抗原基因导致小 鼠脑部肿瘤
转c-Myc基因导 致小鼠乳腺肿瘤
转Fos基因导致 小鼠骨肿瘤
三，育种（农业）
加快生长速度 相关基因：GH，Igf-1， Myo-D ， myostatin（敲除） 提高饲料利用率 相关基因：xylanase 改善肉质 相关基因：Fat1，Fad2, 增加有益脂肪酸（Ω -3 fatty acids） LDL-受体基因，leptin（降低脂肪和胆固醇） 提高抗病力 相关基因：MHC（提高免疫力），Mx1（抵抗流感病毒） lysostaphin（抗乳房炎） PrP(敲除） 特异性病毒基因（RNAi) 改善奶成分 相关基因：lactoferrin，lysozyme βand κcasein lactase 改善羊毛品质 相关基因：Igf-1，keratin 提高繁殖力： 相关基因：ESR，FecB 环境保护： 相关基因： phytase
五，异种器官移植
修饰猪的基因组，降低免疫排斥
六，伴侣动物
低致敏猫（敲除Fel-d1) 彩色鱼类
存在问题及争议
1. 效率低
理论上的限制（常常不能获得预期表型） 技术上的限制（技术上的固有缺陷）
2. 生物安全性
环境安全性 产品安全性(作为食品、药物和饲料）
3. 动物福利
转基因对动物的伤害 动物遗传修饰是否合理
3. 20世纪90年代：小鼠基因打靶技术开始广泛使用 4. 21世纪：家畜基因打靶技术诞生
2000， McCreath, et al. 2002， Lai et al. Dai et al. 2007， Richt et al. Nature 绵羊 Science; 猪 Nature Biotechnology，猪 Nature Biotechnology, 牛
CFTR突变导致囊性纤维炎 renin转基因导致高血压症
传染病，表达细菌或病毒的识别或受体基因
如：表达人CD46对疱疹病毒敏感 人U-plasminogen activator gene对肝炎病毒敏感 表达CD4，CCR5对HIV敏感
癌症
如：病毒基因SV40大T抗原基因 原癌基因 c-Myc, Ras,Fos等 抑癌基因突变
第一章
基因打靶概述
第一节 基因打靶的概念
一，什么是基因修饰（或遗传修饰）（ Genetic Modification，GM)
欧盟：Genetically modified organism (GMO) means an organism, with the exception of human beings, in which the genetic material has been altered in a way that does not occur naturally by mating and/or natural recombination （利用 非自然发生的方式导致生物遗传物质发生改变，即人为故意方式） 所采用的方式包括：
1. 体外重组核酸技术 2. 将体外重组核酸直接导入生物体的技术 3. 细胞融合技术（非自然的） 但不包括： 1.体外受精 2.自然方式的接合、转导、转化等 3.多倍体诱导
诱导突变和植物常规育种技术也属于广义上的基因修饰技术，但往往不包 括在欧盟法律定义的GMO范畴内，因为这些技术不涉及重组核酸技术