风疹病毒包膜糖蛋白E1的原核表达及条件优化
2021年河北省高考生物预测试卷解析版
2021年河北省高考生物预测试卷1.丙型肝炎病毒（HCV）是一种单股正链RNA病毒，其宿主细胞是肝细胞。
整个病毒体呈球形，在核衣壳外包含有衍生于宿主细胞的脂双层膜（包膜），膜上插有病毒基因组编码的糖蛋白，包膜糖蛋白E1和E2暴露在表面。
下列相关叙述正确的是（）A. 包膜和核衣壳构成HCV的生物膜系统B. HCV进入人体内环境中即可大量增殖C. HCV的遗传物质水解产生4种核糖核苷酸D. HCV与它的宿主细胞能发生的可遗传变异类型相同2.磷酸肌酸是一种主要分布在肌肉组织中的高能化合物，是能量的暂时储存形式。
它能在肌酸激酶的催化下，将自身的磷酸基团转移到ADP分子中，合成ATP。
下列说法错误的是（）A. 磷酸肌酸直接为肌肉收缩提供能量B. ATP可以作为RNA的合成原料之一C. 磷酸肌酸和ATP均储存大量能量D. 肌肉收缩时，ATP的含量保持相对稳定3.如图为A、B 两种溶质分子的跨膜运输。
结合图示分析，有关说法错误的是（）A. A、B两种溶质分子均由高浓度向低浓度运输B. B溶质分子的运输速率只取决于膜两侧B的浓度差C. A、B两种溶质分子的运输均不消耗细胞呼吸产生的ATPD. 图中通道蛋白和载体蛋白的运输过程体现了膜具有选择透过性4.细胞分裂过程中可能出现DNA的损伤，引发细胞癌变。
p53是一种转录因子，DNA的损伤会导致p53的含量上升，激活DNA的修复系统，同时启动很多下游基因的转录，其中包括p21基因，p21基因的表达产物p21能够与各种cyclin-CDK复合物结合，抑制它们的活性，阻滞细胞周期，等待DNA完成修复。
在DNA严重损伤不能完成修复的情况下，p53可诱导细胞程序性死亡。
相关说法错误的是（）A. p53基因是一种原癌基因B. 癌变后的细胞周期变短C. 溶酶体参与了细胞程序性死亡过程D. p21基因可能与肿瘤的发生有关5.脑脊液是包围着脑和脊髓的无色透明液体，是脑与血液进行物质交换的媒介。
风疹病毒E1基因的克隆及原核表达
风疹病毒E1基因的克隆及原核表达马强;黄茂梁;林冠峰;邹丽萍;吴英松;李明【摘要】目的构建风疹病毒E1基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白表达.方法通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)风疹病毒E1基因高活性片段,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后连接于原核表达载体PET-28a(+),并于大肠杆菌中诱导目的重组蛋白表达.结果成功扩增出399 bp的目的基因,有效表达出E1重组蛋白.结论在大肠杆菌中成功表达风疹病毒E1基因重组蛋白,为风疹病毒的血清学检测提供了一种新的抗原.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2011(003)003【总页数】3页(P152-154)【关键词】风疹;E1基因;原核表达【作者】马强;黄茂梁;林冠峰;邹丽萍;吴英松;李明【作者单位】南方医科大学生物技术学院抗体工程研究所,广东,广州,510515;武警福州总医院内科,福建,福州,350003;南方医科大学生物技术学院抗体工程研究所,广东,广州,510515;南方医科大学生物技术学院抗体工程研究所,广东,广州,510515;南方医科大学生物技术学院抗体工程研究所,广东,广州,510515;南方医科大学生物技术学院抗体工程研究所,广东,广州,510515【正文语种】中文风疹病毒（Rubella virus, RV）属单股、正链RNA病毒，人类是其唯一宿主，尤其在妊娠期感染最为危险，可导致流产、死产或胎儿感染，从而引起严重的出生缺陷，包括白内障、耳聋、心脏病或智力低下，即为先天性风疹综合症（CRS），因此风疹病毒感染的正确诊断显得尤为重要[1,2]。
风疹病毒主要包含衣壳蛋白C和包膜糖蛋白E1、E2。
其中E1的免疫原性最强[3]，在特异性免疫应答中起主要作用，也是风疹病毒血清学诊断的主要靶抗原。
同时，相对于天然提取抗原，应用基因重组技术生产的RV抗原无论在特异性和稳定性上都有着无可比拟的优势。
因此，本研究通过分子生物学技术克隆基因的高活性表位区段，表达重组蛋白，为风疹病毒的血清学检测提供了一种新的抗原。
乙脑病毒E蛋白的原核表达、纯化及初步鉴定
乙脑病毒E蛋白的原核表达、纯化及初步鉴定作者：高淑娴，张伟，任君萍，雷迎峰，丁天兵，宋建华，马文煜，徐志凯【Abstract】AIM: To construct gene encoding Japanese encephalitis virus (JEV) envelope glycoprotein and to express E protein in BL21(DE3). METHODS: Using RT PCR, the gene encoding E protein was amplified. The gene was cloned into pET28a(+) and the recombinant plasmid pET286His E was transformed into BL21(DE3). The 6HisE protein expressed in BL21(ED3) was determined by SDS PAGE and Western Blotting. The expression product in inclusion body was purified by Ni NTA chromatography. RESULTS: Sequencing of E gene revealed that the mutation rate was 0.2﹪(3/1500) and the base mutation didn t change the amino acid nonsense. The recombinant expression vector pET286His E was constructed and the 6His E protein was successfully expressed in an insoluble form. After expression and purification by metal chelate affinity chromatography, purified 6His E fusion protein was obtained. CONCLUSION: The E protein can be expressed in prokaryotic cell and would be useful for further research on the receptor of JEV and its infection mechanisms.【Keywords】encephalitis virus, Japanese; viral envelope proteins; recombinant fusion proteins【摘要】目的：构建乙脑病毒（JEV）E蛋白重组载体并在原核细胞BL21(DE3)中表达. 方法：采用RT PCR扩增片段,定向克隆入pET28a(+)中；重组载体pET28a6His E转化BL21(DE3),通过酶切、SDS PAGE和Western Blotting检测其载体构建和蛋白表达；表达产物包涵体经Ni NTA亲和层析纯化. 结果：构建得到原核融合重组载体pET28a6His E；诱导后表达得到6His E融合蛋白，纯化得到表达产物并进行了初步的鉴定. 结论：表达并纯化得到JEV E蛋白原核表达产物.【关键词】脑炎病毒，日本；病毒包膜蛋白质类；重组融和蛋白质类0引言流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis, JE）简称乙脑，是由嗜神经的乙脑病毒（JEV）所致的中枢神经系统性传染病［1］. JEV 属包膜病毒科黄病毒属，呈球型，直径20～30 nm，核心含单股RNA，有衣壳，有三个结构蛋白，即E蛋白、核蛋白C和膜蛋白M. E蛋白为糖蛋白，包裹在病毒的表面，它决定着病毒的毒力及其宿主范围，不仅在与宿主细胞受体结合及随后的膜融合中发挥重要作用，而且可刺激产生中和抗体［2］. 我们对E蛋白进行了原核表达、纯化及鉴定，为进一步研究病毒的受体和病毒的感染机制提供了有利条件.1材料和方法1.1材料pET28a(+)表达载体和XL10, BL21(DE3)宿主菌为本试验室保存. P1，P2引物合成及序列测定由三博远志生物技术有限责任公司完成；限制性内切酶、PMD18T，EX Taq聚合酶和连接试剂盒（宝航公司）；逆转录试剂盒（Invitrogen公司）；JEV鼠源性mAb和兔源多克隆抗体由本实验室制备；猴抗鼠红外标记二抗、羊抗兔红外标记二抗（Rockland公司）；红外成像系统（LI COR公司）；高速低温离心机（BECKMAN公司）；恒温摇床（上海智城公司）.1.2方法1.2.1片段的扩增及表达载体的构建用Trizol提取JEV RNA，以8 μL RNA为模板,1 μL P1为引物,1 μL dNTP 65℃水浴5 min,冰浴1 min, 2 μL 10×RT缓冲液,4 μL 25 mmol/LMgCl2,1 μL RNaseout Recombinant Inhibitor, 42℃水浴2 min；加1 μL superscriptTM混匀；42℃水浴50 s；70℃水浴15 min；加1 μL RAaseH混匀；37℃水浴20 min；将得到的产物进行PCR扩增，5′端引物：5′CGCTCGAGTTAAGCATGCATTGGTCGCTAA3′；3′端引物：5′CGGAATTCTTTAATCGTTGTCTGGGAATGGGCAATCGTGAC 3′. 反应条件为：94℃5 min，94℃50 s；55℃1 min；72℃1 min 30 s, 30个循环，72℃15 min.10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，回收目的片段. 将回收的PCR产物克隆入PMD18T载体中转化Ecoli E..XL10感受态细胞，EcoRⅠ和XholⅠ酶切鉴定，阳性克隆送公司测序；测序正确后，EcoRⅠ和XholⅠ双酶切PMD18T E质粒和表达载体pET28a,回收目的片段,连接；转Ecoli E..XL10感受态细胞；挑克隆；提取质粒；酶切鉴定载体构建. 阳性克隆质粒转化表达宿主菌BL21(DE3)；提取质粒；酶切鉴定；阳性克隆保留菌种.1.2.2工程菌的诱导表达及可溶性分析用载体构建成功的菌种划抗性平板，挑取单克隆在37℃培养至A600 nm为0.4～0.6，加入100 mg/L IPTG诱导4 h. 1000 r/min, 4℃10 min离心收菌. 弃上清后用PBS洗菌体，用去离子水重悬菌体. 加入2×SDS上样缓冲液进行样品处理. 另离心收集菌体，以溶液STE(50 mmol/L Tris﹒Cl (pH 8.0) ,1 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl)重悬菌体，超声破菌（间隔10 s,超声8 s,共15 min）. 分别收集上清和沉淀，上清用5×SDS上样缓冲液处理，沉淀用1×SDS上样缓冲液处理后彻底重悬. 取上述各样品做SDS PAGE用2.5 g/L考马斯R25溶液室温染色2 h后脱色.1.2.3重组蛋白的鉴定同上取上清和沉淀样品分别进行处理并做SDS PAGE，随后将电泳蛋白转移到NC膜上（转移缓冲液：甘氨酸39 mmol/L,Tris碱48 mmol/L,SDS 3.7 mg/L,甲醇200 ml/L），100 V转移80 min 后用25 mmol/L TBS平衡NC膜10 min,用0.5 g/L的脱脂奶4℃封闭5 h ，用TBS·T洗膜3次,10 min/次，1∶200稀释JEV鼠源性mAb，1∶100稀释JEV兔源性多抗，4℃孵育过夜，然后用TBS·T洗膜3次，10 min/次，再与1∶2500稀释的猴抗鼠抗体和羊抗兔抗体分别孵育，4℃作用90 min后洗膜3次，10 min/次，然后进行扫描分析.1.2.4重组蛋白的纯化参照Qiagen公司镍离子亲和层析柱（NiNTA）操作说明进行. 离心收集500 mL诱导宿主菌，冰浴15 min；按5 mL/g湿菌的比例加入含8 mol/L尿素的缓冲液B(pH 8.0),室温下轻轻搅拌使细菌裂解至溶液清亮，4℃, 8563 g离心收集上清，弃去沉淀；将500 mL/L的Ni NTA树脂悬浮液1 mL与一定量的清亮裂解上清于室温轻柔混匀（100 r/min摇动60 min）后，将混合液装柱；收集穿过峰，留小样进行SDS PAGE；然后用缓冲液W(20 mmol/L咪唑,pH 8.0)洗柱，再用缓冲液E(250 mmol/L咪唑,pH 8.0)洗脱，收集洗脱液. 取不同峰值样品进行SDS PAGE分析.2结果2.1重组表达载体的构建阳性重组质粒酶切产物在大小约1500 bp处出现条带（图1），与预期大小相符. 序列测定结果有三个碱基突变（第30位碱基C突变为T，第705位碱基A突变为G，第1298位碱基T突变为A），皆为无意义突变.M: DL2000 DNA marker; 1: 空pET28a; 2: pET28a E双酶切产物.图1pET28a E的酶切鉴定（略）2.2融和蛋白E的表达与溶解形式的分析经SDS PAGE检测，在Mr约53 000处有明显的条带，与预期的6HisE融和蛋白大小一致. 融和蛋白主要以包涵体形体存在于沉淀中，但上清中也有少量的诱导表达的融和蛋白. 薄层扫描显示其占菌体总蛋白的40%（图2）.M: 标准蛋白质marker; 1: 空pET28a未诱导细胞; 2: 空pET28a诱导细胞; 3: 重组载体pET28a E未秀导细胞; 4: 重组载体pET28a E诱导细胞; 5: 重组载体pET28a E诱导细胞裂解上清; 6: 重组载体pET28a E诱导细胞裂解沉淀.图2E蛋白的表达及可溶性分析（略）2.3融和蛋白E的大量表达及纯化利用Ni NTA agarose 柱通过金属螯合亲和层析进行纯化，从大肠杆菌BL21(DE3)表达菌体的沉淀中变性、纯化得到6His E融合蛋白. 纯化的蛋白经PEG4000浓缩后经透析除去尿素，应用紫外光吸收法定量分析表明获得蛋白的浓度约为0.759 g/L（图3）.2.4E蛋白的Western Blotting用Odyssey扫描，在预期大小处可见清晰条带，提示纯化的E蛋白较好地保持了与抗JEV的多抗和单抗的结合活性（图4,5）.M: 标准蛋白质marker. 1: 空pET28a未诱导细胞; 2: 空pET28a诱导细胞; 3: 重组载体pET28a E诱导细胞裂解上清; 4: 重组载体pET28a E诱导细胞裂解沉淀; 5~9: 纯化的融和蛋白.图36His E蛋白的纯化（略）1, 2: pET28a E诱导细胞; 3: pET28a E未诱导的细胞; 4: 空pET28a诱导的细胞; 5: 空pET28a未诱导的细胞.图4融合蛋白6His E的JEV多抗Western Blotting鉴定（略）1, 2: pET28a E诱导细胞; 3: pET28a E未诱导的细胞.图5融和蛋白6His E的JEV mAb Western Blotting分析（略）3讨论JEV与西尼罗病毒（West Nile virus, WNV）、登革病毒（Dengue virus, DV）同属黄病科黄病毒属成员［3］，其E蛋白有着与JEV E 蛋白有着相似的结构和功能，例如它们都有着三个结构域，即Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ［2，4］. 蛋白结构域Ⅰ主要承担着整个蛋白结构的形成；结构域Ⅱ包含一个融合环，推测其与病毒与宿主细胞的膜融合有关；而结构域Ⅲ则被认为是病毒与宿主细胞受体结构的部位［2，5］. Chu等［4］用WNV E 蛋白结构域Ⅲ蛋白不仅能抑制WNV对C6/36细胞、V ero细胞的侵入，还能够抑制DV2对这两种细胞的入侵.作为同属病毒它们有着很相似的结构和交叉的功能，但它们又有着种的特异性. 例如，研究已证明WNV E蛋白是三聚体，而不是像DV E 蛋白是二聚体，并且揭示和分析了WNV E蛋白的表位抗原位点［3］，揭示了DV2型E 蛋白晶体结构，明确了DV 2 E 蛋白各区的功能［4］. 另外，已有报道用黄病毒科的其他病毒的E蛋白和E蛋白Ⅲ区蛋白成功的筛选到受体蛋白或受体复合物［6-8］.目前JE仍然威胁着人类的健康，在亚洲国家每年仍有JE 50 000例，其中有10 000例死亡［9］. 然而关于JEV的致病机制到目前为止仍不明确. JEV的E蛋白在病毒与敏感细胞结合过程中起着重要的作用，JEV敏感细胞表面有病毒的相应受体，但其性质和结构尚未明确. 由于E蛋白的真核表达糖基化过多，严重影响了E蛋白的生物学活性，我们力图用原核表达系统表达E蛋白，在多次尝试不同表达载体与宿主菌之后，成功的构建了E蛋白的原核表达载体. 对原核表达产物的可溶性分析结果表明，表达的E蛋白主要以包涵体的形式存在于菌体裂解后的沉淀中（占表达总量的95%左右）.表达的E蛋白经纯化后用SDS PAGE和Western Blotting 鉴定，结果表明其Mr大约为53 000,与预期大小一致；表达的E蛋白均能与JEV的单抗和多抗结合，表明其具有较好的反应原性. 实验中观察到E蛋白与多抗的结合要强于与单抗的结合，分析其原因，可能是由于多抗所针对的抗原表位多，而单抗只针对单一抗原表位，因此蛋白与单抗的结合受到一定影响.基金项目：国家自然科学基金（30400378）【参考文献】［1］冯国和,窦晓光,王玉梅，等. 流行性乙型脑炎DNA 疫苗研究新进展［J］. 国外医学流行病学传染病学分册，2005,(32):368-370.［2］Lin CW, Wu SC. A functional epitope determinant on domain III of the Japanese encephalitis virus envelope protein interacted with neutralizing antibody combining sites ［J］. 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风疹病毒研究进展(综述)
风疹病毒 （ ｕ ｅａ ｉ ｓ Ｖ） Ｒ ｂｌ ｒ ， 是披膜病毒科风疹 ｌｖ Ｒ ｅ 病毒属的惟一成员 ， 人是其惟一的 自然宿主。风疹 本身并不严重 ，但 Ｒ Ｖ对公众健康最大的威胁是它 的致畸性 。 孕妇感染 Ｒ Ｖ可对婴儿产生先天 ｌ损害 ， 生 尤其是妊娠前 ３ 个月如感染 Ｒ ，病毒可经血侵犯 Ｖ 胎儿 ， 导致 自 发流产 、 死产或胎儿感染 ， 而引起严 从 重的出生缺陷 ， 包括 白内障、 耳聋 、 心脏病 或智力低 下 ， 即为 先 天 性 风 疹 综 合 征 （ｏｇｎ ａ ｍｂｎ Ｃｎｅｉｌ ｅａ ｔ ｓ ｄｏ ｅ，Ｒ ） ｙ ｒ ｓ Ｓ 。虽然风疹病毒通过疫苗接种是可 ｎ ｍ Ｃ 以预防的 ， 但一旦感染 临床上无特效治疗 ， 因此在 临床上对风疹病毒 的感染 、 实验室诊断及其流行特
作者单位 ： 合肥市第一人 民医院检验科 安徽 ２ ０ ６ ３０ １ ２ ０ －９ １ 收稿 ， ０ ８ １一 ３修 回 ０８ ０—８ ２０ — １Ｏ
Ｒ Ｖ是一单股 、 正链 、０ ４Ｓ的 Ｒ Ａ病毒 ， 披膜 Ｎ 是 病毒科（ ｇｖ ｉ ） Ｔ ａｉｄ 、 ｏ ｒ ｅ 风疹病毒属（ｕｉｍｓ Ｒｂｉ ） ｖ 的唯一成 员。 与披膜科 的其它病毒无交叉抗原。 Ｖ病毒体呈 Ｒ 球形 ， 直径 ６ ～ ０ｍ， ０ ７ ｎ 外层为一松散 囊膜 ， 面有 表 ５ ６ ｍ的小刺 突，中央为 ２ —ｎ ０面体的核壳体 ，直径 ３ ４ ｎ 分 子 量 为 ３８ ０， 因组 长 ９５ ０～ ０ｍ， ．×１６基 ７７个 核 苷 酸左 右 ， 富含 Ｇ （ ．％）。Ｒ 的基 因组 Ｒ Ａ包 Ｃ６ ５ 翻 Ｖ ９ Ｎ 括两个长的开放读码框架（Ｒ ） Ｏ Ｆ， 一个是 ５一近端的 ’ Ｏ Ｆ 编码两种非结构蛋 白 Ｐ ５ Ｒ， １０和 Ｐ０ ９ ，参 与病毒 的复制 ； 另一个是 ３一近端 的 Ｏ Ｆ 编码结构蛋 白。 ’ Ｒ ， 其编码的 ３种结构蛋 白为衣壳蛋 白 ｃ和 ２种包膜 糖蛋 白 Ｅ 、２ 其分子量分别为 ３ 、８４ ～ ７ Ｄ ｌＥ ， ３５ 、２ ４ Ｋ ， 它们是 Ｒ Ｖ的主要蛋白抗原 。抗原表位主要存在于 Ｅ 膜 蛋 白上 。Ｅ 为 包 膜糖 蛋 白 ， Ｅ ｌ ｌ 与 ２共 同构 成病 毒包膜的刺突，在 Ｅ 和 Ｅ 的 Ｎ端分别有 ２ 个和 １ ２ ０ ２ 个疏水性氨基酸残基 ， ３ 它们可以作为信号肽将 ２ 种糖 蛋 白转运 到 内质 网腔 。衣壳 蛋 白 Ｃ及 Ｅ １和 Ｅ ２ 糖蛋 白之间的切割都是 由信号肽酶来完成的。研究 表明 Ｅ 蛋 白基 因序列的株间变异程度与全株基 因 ｌ 序列变异程度相近。因此各 国研究人员多将 Ｅ 蛋 １ 白基 因作为 Ｒ Ｖ某一病毒株代表基因进行分析翻 Ｅ 。１ 相对分子质量为 ５ ０ 由 ４ ２ ４ ８ ７ ０ ， １ ～ １ 个氨基酸残基 ０ 组成， 富含脯 氨酸和半胱氨 酸 ， 其不 同株 间氨基酸 序列有差异 ， 但抗原决定簇聚集区的氨基酸序列相 同。Ｅ 蛋 白分为 ３ １ 个部分 ， 即膜外 区（ ｌ Ｌ４ ） Ｅ ～ ４６ ， 跨 膜 区 （ ４ ７～Ａ ６ ） 膜 内 区 （ ４ ９～Ｒ ８ ） Ｇ４ ４８和 Ｋ６ ４ １。迄 今 已发 现 Ｅ１ 白的 ４ １ 氨 基 酸残 基 中只 含 有 ３ 蛋 ８个 个 Ａｎ ｓ 连接 的 Ａ ｎＸ Ｔ ｒ ｓ— — ｈ 形式 的 Ｎ 一糖基化位点 ，
DC-SIGN在病毒感染中的作用机制研究进展
DC-SIGN在病毒感染中的作用机制研究进展张莉【摘要】树突状细胞(DCs)表面特异性细胞间黏附分子3结合非整合素(SIGN)主要分布在DCs表面,通过依赖Ca2+的碳水化合物识别区域(CRD)识别与结合内源性和外源性抗原,介导细胞与细胞之间的相互作用,参与DCs对病原体的识别和捕获,在HIV、HCV、登革热病毒(DENV)以及肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)等的感染和传播中发挥重要作用.本文就DC-SIGN与病毒感染相关研究进展作一综述.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2013(031)008【总页数】4页(P599-602)【关键词】树突状细胞;表面特异性细胞间黏附分子3结合非整合素;病毒感染【作者】张莉【作者单位】苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213001【正文语种】中文【中图分类】R392;R37树突状细胞(dendritic cells, DCs)是据目前所知体内功能最强大的专职抗原提呈细胞，主要通过模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)捕获、处理和提呈抗原，参与初始T细胞激活、增殖和分化，引发机体产生相应的免疫应答。
DCs 表面特异性细胞间黏附分子3 结合非整合素(DC-specific intercellular adhesionmolecule-3-grabbing nonintegrin，DC-SIGN)是一种Ⅱ型跨膜蛋白，属C型凝集素家族成员，能识别并结合富含甘露糖和LewisX碳水化合物结构的分子。
DC-SIGN可介导HIV、HCV、EV71、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, HP)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)、利什曼原虫等病原体进入DCs，并通过诱导某些机制，影响DCs分化成熟，下调免疫应答。
由于DC-SIGN参与免疫功能的调控，研究其与病原体感染的信号通路机制，探索药物作用靶点，可为预防及治疗病原体感染提供新的途径。
毛冠鹿AIF-1原核载体的构建及表达
毛冠鹿AIF-1原核载体的构建及表达周楠楠;杨振;罗丽芸;宋菲;白敏;曹祥荣【摘要】The TdAIF-1 cDNA was cloned from the testis cDNA library of the Tufted deer( Elaphodus cephalophus) and analyzed by bioinformatic methods. Primers were designed according to cDNA sequence to clone the gene. The gene was cloned into pMD19-T vector for sequencing. The right sequence was digested by restriction enzyme and subcloned into the expression vector pET-28a(+). After transformed into E. coli BL21(DE3),the recombinant plasimid was induced to express by IPTG. The E. coliBL21(DE3)expressed recombinant protein was broken by ultrasonic to show whether the re-combinant protein was soluble or not. Lastly,the soluble protein was purified. The recombinant protein was analyzed and identificated by SDS-PAGE electrophoresis and Western blot. Analysis of sequence showed that the TdAIF-1 cDNA contained a 438 bp open reading frame encoding 145 amino acids. The recombinant plasimid was correctly constructed according to sequencing and restriction enzyme analysis. The recombinant protein was about 20 kD and soluble mainly. When the recombinant protein was purified,using elution buffer containing 50 mmol/L or 100 mmol/L imidazole could get purified protein. The TdAIF-1 Prokaryotic Expression System was constructed successfully and recombinant protein was obtained,which was helpful for the future study of its biological function.%从毛冠鹿睾丸cDNA文库中筛选出毛冠鹿AIF-1基因,对其进行生物信息学分析,设计引物克隆毛冠鹿AIF-1 cDNA,连入pMD19-T载体,测序正确后酶切,与表达载体pET-28a(+)连接,转化E. coli BL21(DE3), IPTG诱导表达,将诱导表达重组蛋白的菌体超声破碎后,进行可溶性分析,并对可溶性蛋白进行纯化, SDS-PAGE电泳,Western Blot分析以及鉴定重组蛋白.结果表明,毛冠鹿AIF-1(TdAIF-1)含有1个438bp的开放阅读框,编码145个氨基酸,经测序和酶切鉴定后,成功构建重组质粒pET-28a(+)-TdAIF-1,表达大小约20 kD的重组蛋白,主要以可溶形式存在,提高洗脱缓冲液中咪唑浓度至50 mmol/L、100 mmol/L能够得到较纯的蛋白.成功构建毛冠鹿AIF-1原核表达体系,获得重组蛋白,为研究AIF-1蛋白的生物学功能奠定了基础.【期刊名称】《南京师大学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(000)002【总页数】7页(P85-90,95)【关键词】毛冠鹿;AIF-1;原核表达【作者】周楠楠;杨振;罗丽芸;宋菲;白敏;曹祥荣【作者单位】南京师范大学生命科学学院，江苏省分子医学生物技术重点实验室，江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院，江苏省分子医学生物技术重点实验室，江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院，江苏省分子医学生物技术重点实验室，江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院，江苏省分子医学生物技术重点实验室，江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院，江苏省分子医学生物技术重点实验室，江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院，江苏省分子医学生物技术重点实验室，江苏南京210023【正文语种】中文【中图分类】Q28同种异体移植炎症因子(Allograft inflammatory factor 1，AIF－1)，又称离子钙结合适配器分子(Ionized calcium－binding adapter molecule 1，Iba1)，最初克隆自发生慢性排斥反应的大鼠心脏移植物［1］，参与调节巨噬细胞的活化及功能.AIF－1是亲水蛋白，蛋白质分子量大小为17 kD，可被γ干扰素(IFN－γ)诱导表达，含有可结合Ca2+的EF－hand结构域［2］.到目前为止，许多不同物种的AIF－1或AIF－1类似基因被克隆出来，其中包括无脊椎动物如海绵［3］、盘鲍［4］，鱼类如鲤鱼［5］，哺乳类如小鼠［6］和人［7］等.AIF－1 能够绑定并交联肌动蛋白成束，在调节巨噬细胞/小胶质细胞肌动蛋白骨架的重组中发挥非常重要的作用［8－10］.AIF－1蛋白特异性表达于大鼠睾丸长形精子细胞的胞质中，暗示AIF－1可能参与精子形成的最后阶段［11］.在动脉损伤或炎症刺激下的血管平滑肌细胞(VSMCs)中，AIF－1也可被诱导产生［12］，并能促进VSMCs的增殖与迁移［13，14］.此外，研究还发现，AIF－1与自身免疫性疾病、中枢神经系统疾病、动脉粥样硬化、移植排斥反应等疾病密切相关.毛冠鹿(Elaphodus cephalophus)属鹿科(Cervidae)、麂亚科(Muntiacinae)、毛冠鹿属(Elaphodus)，是我国二类保护动物，主要分布于东南和西南各省.麂亚科动物的细胞遗传学研究一直备受关注，主要集中在染色体多态、性别鉴定、分子进化［15］、cDNA文库构建［16］等方面.关于毛冠鹿AIF－1基因的研究，国内外尚未见报道.本研究首次克隆毛冠鹿AIF－1基因，对序列进行生物信息学分析，构建原核表达体系，获得重组蛋白，分析表明毛冠鹿AIF－1基因与人类AIF－1基因高度同源，为研究其蛋白质特性和制备检测抗体，以及人类疾病的检测和治疗奠定了前期基础.1 材料与方法1.1 材料毛冠鹿睾丸组织cDNA文库由本实验室构建，质粒和菌种由本实验室保存;原核表达载体pET－28a(+)购自Novagen公司;大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)感受态细胞由本实验室制作并保存.rTaq酶、pMD19－T载体、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DL2 000 Marker、DL15 000 Marker均购自TaKaRa公司;质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Biomiga公司;X－gal、IPTG、氨苄青霉素钠、卡那霉素购自南京生兴生物技术有限公司;Ni2+亲和层析柱(HisTrap HP)购自GE Healthcare公司.引物由生工(上海)股份有限公司合成.1.2 试验方法1.2.1 毛冠鹿AIF－1序列比对及分析毛冠鹿睾丸cDNA文库测序结果在NCBI网站进行ORF分析并进行BLAST比对.DNAMAN软件分析蛋白分子量、等电点.Signal P3.0和NLS预测程序用于预测信号肽和核定位信号.PROSITE数据库预测蛋白结构域.1.2.2 原核表达载体的构建根据原核表达载体pET－28a(+)的克隆位点，选择酶切位点NdeⅠ和BamHⅠ来设计引物，上游引物P1(包含酶切位点NdeⅠ):5′－CCGAATTCCATATG GCTTCTTCTGATATCCAG－3′，下游引物 P2(包含酶切位点BamHⅠ):5′－AATGGATCC TTAGTCGGCTTCAGTCTCATC－3′，以pTriplEx2重组质粒为模板扩增毛冠鹿AIF－1 cDNA序列.割胶回收PCR产物，在T4连接酶的作用下，与PMD19－T载体16℃连接1h，连接产物转化DH5α感受态细菌，接种于含Amp、X－gal和IPTG的LB平板上进行蓝白斑筛选，37℃倒置培养过夜后挑取白色菌落，进行PCR及NdeⅠ+BamHⅠ质粒双酶切鉴定，进一步确认目的片段插入载体中，菌样送生工(上海)有限公司测序.将测序正确的质粒和pET－28a(+)同时进行NdeⅠ+BamHⅠ双酶切，酶切产物经割胶回收纯化后，在T4连接酶的作用下16℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细菌，接种于Kan抗性平板，37℃倒置培养过夜后挑取单克隆菌落，经PCR及NdeⅠ+BamHⅠ质粒双酶切鉴定后，确定阳性重组质粒，命名为 pET－28a(+)－TdAIF－1.1.2.3 重组质粒原核表达、鉴定分别将空载质粒 pET－28a(+)和重组质粒 pET－28a(+)－TdAIF－1转化大肠杆菌BL21(DE3)，接种于Kan抗性的平板上，37℃倒置培养过夜，挑取阳性克隆在LB 培养基中37℃振荡培养，按1∶100的比例接种于Kan抗性的LB液体培养基中，摇菌至OD600值为0.6～0.7时，分别加入终浓度1.0 mmol/L IPTG，对照组不加，诱导表达4 h，各取2×2 mL菌液，离心收集菌体，200 μL缓冲液重悬，然后加入50 μL 5×SDS上样缓冲液，吹匀，99℃煮沸5 min，用于SDS－PAGE电泳.目的蛋白用SDS－PAGE电泳和Western Blot进行鉴定，蛋白样品经SDS－PAGE电泳后，考马斯亮蓝R250染色20 min，脱色液中脱色至出现明显条带，凝胶成像仪中拍照，Western Blot所用一抗为山羊来源的抗AIF－1单克隆抗体，与HRP标记的抗山羊二抗结合后，加入TMB显色液，室温避光显色，拍照.1.2.4 重组蛋白表达的条件优化于37 ℃ 1.0 mmol/L IPTG 诱导不同时间(0、2、4、6、8、10)h，收集菌体，SDS－PAGE 电泳分析不同时间诱导下蛋白表达的差异.选取最佳诱导时间，在不同终浓度 IPTG(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0)mmol/L，37 ℃诱导表达相同时间，收集菌体，SDS－PAGE电泳分析不同浓度IPTG诱导下蛋白表达的差异.1.2.5 重组蛋白的可溶性分析及纯化在优化条件下诱导并收集2 mL菌体，加入200 μL缓冲液重悬，再加入PMSF(终浓度为1 mmol/L)，冰水浴中超声破碎，程序为破碎2 s，间隔4 s，功率40 W，持续3 min～5 min.然后4℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清和沉淀分别进行SDS－PAGE分析.蛋白纯化时，将200 mL诱导表达的菌体重悬于20 mmol/L Tris－Cl(pH 8.0)中，加入 PMSF(终浓度1mmol/L)，150 W 超声破碎，4 ℃ 12 000 r/min 离心 15 min，转移上清，用Ni2+亲和层析柱进行纯化(步骤参考说明书)，纯化后的蛋白用于SDS－PAGE检测.2 结果2.1 毛冠鹿AIF-1序列分析通过ORF及BLAST分析，筛选出一cDNA与小鼠、人的AIF－1(Allograft inflammatory factor 1)/Iba1(I－onized calcium－binding adapter molecule 1)高度同源，命名为毛冠鹿 AIF－1(Tufted deer’s AIF－1，Td AIF－1)，其CDS区为438 bp，编码145个氨基酸(如图1).该cDNA序列已提交GenBank(序列号:JX861371).DNAMAN预测蛋白质的分子量为16 599.4 Da，理论等电点为6.03.20种氨基酸中含量最高的是赖氨酸Lys(13.79%)，以下依次是亮氨酸 Leu(13.10%)、谷氨酸 Glu(11.03%)、丝氨酸 Ser(8.28%)、甲硫氨酸Met(6.90%)、甘氨酸 Gly(6.21%)、天冬氨酸 Asp(6.21%)、丙氨酸 Ala(4.83%)、谷氨酰胺 Gln(4.83%)、苯丙氨酸 Phe(4.14%)、异亮氨酸 Ile(4.14%)、脯氨酸Pro(4.14%)、酪氨酸 Tyr(2.76%)、精氨酸 Arg(2.76%)、苏氨酸 Thr(2.76%)、天冬酰胺 Asn(2.07%)、缬氨酸 Val(1.38%)、组氨酸 His(0.69%).经分析，毛冠鹿AIF－1氨基酸序列中不含半胱氨酸Cys，所以在其蛋白质空间结构中不会形成二硫键，这对大肠杆菌表达重组蛋白具有重要影响.图1 毛冠鹿AIF-1 cDNA编码区核酸序列及预测氨基酸序列(登录号:JX861371)Fig.1 Td AIF-1 cDNA coding sequence and deduced amino acids sequence(accession number:JX861371)信号肽和核定位信号预测结果表明，毛冠鹿AIF－1蛋白没有潜在的信号肽和核定位信号.结构域分析发现氨基酸序列中45～78位是Ca2+结合EF－hand结构域，58～67位为Ca2+结合位点，但是与完整的EF－hand Ca2+结构域相比，毛冠鹿AIF－1蛋白在65位和66位氨基酸之间缺少E(Glu)或D(Asp)氨基酸，这可能导致其结合Ca2+的能力减弱.2.2 原核表达载体的构建及鉴定毛冠鹿AIF－1扩增片段为447bp(如图2)，经割胶纯化后连入pMD19－T载体，菌落PCR结果1#～8#均与目的条带大小相符合(如图3)，选取1#～3#经测序证实读码框架正确.选取3#重组pMD19－T质粒，与pET28a(+)同时经NdeⅠ+BamHⅠ双酶切后，用T4连接酶连接，经Kan抗性筛选后，提取质粒酶切鉴定，重组质粒酶切片段大小与预期相符(如图4)，命名为pET－28a(+)－TdAIF－1(如图5).图2 TdAIF-1 cDNA扩增片段Fig.2 PCR products of TdAIF-1 cDNA图3 重组质粒pMD19-T-TdAIF-1的菌落PCR鉴定Fig.3 Identification ofpMD19-T-TdAIF-1 by colony PCR图4 重组质粒pET-28a(+)-TdAIF-1的酶切鉴定Fig.4 Enzyme digestion ofpET-28a(+)-TdAIF-1图5 重组质粒pET-28a(+)-TdAIF-1图谱Fig.5 The map of pET-28a(+)-TdAIF-1 recombinant plasmid2.3 重组蛋白的表达及鉴定转化空载质粒 pET－28a(+)和重组质粒 pET－28a(+)－TdAIF－1的大肠杆菌BL21(DE3)，摇菌培养至OD600值为0.6时，加入1 mmol/L IPTG诱导表达4 h，对照组不加，收集菌体，处理后进行SDS－PAGE电泳，结果如图6A所示，在约20 kD处有一明显蛋白条带，而对照组均没有.重组蛋白经IPTG诱导表达后，进行SDS－PAGE电泳，电转移至PVDF膜上，与山羊源抗AIF－1单克隆抗体结合，再结合HRP标记的抗山羊二抗后，TMB避光显色，进行蛋白印记分析，结果显示，在约20 kD处有一明显的蛋白条带(如图6B)，从而证明毛冠鹿AIF－1重组蛋白表达成功.图6 重组蛋白的表达分析(A)和Western Blot鉴定(B)Fig.6 Expression analysisof recombinant protein(A)and Western Blot identification(B)2.4 重组蛋白表达的条件优化转化重组质粒 pET－28a(+)－TdAIF－1 的大肠杆菌 BL21(DE3)经1mmol/L IPTG 诱导不同时间(0、2、4、6、8、10)h，收菌进行SDS－PAGE电泳，发现4 h后重组蛋白表达量无明显变化(如图7A)，因此固定诱导时间 4 h，不同浓度IPTG(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0)mmol/L 诱导蛋白表达，发现重组蛋白表达量没有显著差异(如图7B).图7 不同时间1 mmol/L IPTG诱导重组蛋白的表达(A)和不同浓度IPTG诱导4 h 后重组蛋白的表达(B)Fig.7 Expression of recombinant protein induced by 1 mmol/L IPTG at differernt time(A)and induced for 4 h in different concentration of IPTG(B)2.5 重组蛋白的可溶性分析及纯化根据条件优化，重组质粒在37℃ 0.01mmol/L IPTG诱导4 h后，超声破碎菌体，取上清和沉淀分别电泳，发现目的蛋白主要存在于上清中(图8A).经Image J软件分析，上清中目的蛋白约占目的蛋白总量的91.4%.在此条件下大量诱导，收集200 mL菌体，超声破碎，离心后取细胞破碎液上清，将其通过镍柱进行纯化.按顺序依次加入样品流出液、结合缓冲液流出液、漂洗缓冲液流出液W1－4和洗脱缓冲液流出液E1－4，并分别收集过柱后样品进行SDS－PAGE电泳.在加入洗脱缓冲液之后的E1、E2的目的条带非常明显，但存在少许杂带，提高漂洗缓冲液中咪唑浓度至50 mmol/L、100 mmol/L能够除去部分杂带(图8B).图8 重组蛋白的可溶性分析(A)和纯化(B)Fig.8 Soluble analysis of therecombinant protein(A)and purification(B)3 讨论通过对毛冠鹿AIF－1蛋白结构域的分析，发现关于其具有Ca2+结合EF－hand 结构域，但是其Ca2+结构域并不完整，缺少重要的与Ca2+结合的位点，导致其结合Ca2+的能力减弱.所以AIF－1蛋白功能是否依赖Ca2+还存在争议，一种观点认为在胞膜边缘波动和吞噬过程中是必需的［8］，另一种观点则认为AIF－1的功能不依赖于Ca2+［10］.尽管如此，AIF－1能够聚合肌动蛋白成束，参与巨噬细胞/小胶质细胞胞吞及血管平滑肌细胞迁移中的Rac信号通路［8，3，13，17］，且与炎症、神经系统疾病，甚至生殖相关，具有重要的研究价值.大肠杆菌系统是表达许多外源蛋白的首选系统，其遗传背景清晰、容易培养、费用低廉，能够对外源蛋白进行高水平表达.但是大肠杆菌不能够对蛋白进行糖基化修饰，其胞质是一个相对还原性的环境，不利于二硫键的形成，其中表达的蛋白大多没有折叠，易形成不溶解的包涵体，需要进行变复性处理.同时影响蛋白表达速度的因素也会影响蛋白的折叠，如温度、诱导剂浓度和摇床转速等.pET－28a(+)是一个相对成熟的大肠杆菌表达载体，含有T7强启动子，多克隆位点两端均含有一个His标签.在IPTG诱导下能够表达His融合蛋白，通过镍柱亲和纯化.His－tag 分子量较小，融合于目的蛋白的N端或C端一般不会影响蛋白活性，因此纯化后大多不需要去除.His－tag还可用于目的蛋白的检测.氨基端的His标签在蛋白纯化后可以被凝血酶切除.本研究将目的序列置于大肠杆菌表达载体pET－28a(+)N端His－tag下游，成功构建毛冠鹿AIF－1的原核表达载体并进行诱导表达.优化表达条件发现1 mmol/L IPTG诱导4 h后，重组蛋白表达量趋于稳定，不同浓度的IPTG诱导4 h也没有发现重组蛋白的表达量有明显差异.在任何系统中表达长度大于100个氨基酸残基的胞质蛋白都非常困难.在大肠杆菌中，这些蛋白质常常不稳定或形成包涵体，在0.01 mmo/L IPTG少量诱导4 h后，菌体超声破碎发现重组蛋白主要存在于上清中(如图8A)，表明是可溶性的，没有形成包涵体.毛冠鹿AIF－1蛋白缺少半胱氨酸，不会产生二硫键，所以在大肠杆菌中进行表达时，不会因为无法正确折叠形成二硫键而产生包涵体.另外，AIF－1蛋白含有的疏水性氨基酸较少(约占氨基酸总数的38%)，可能也有利于减少包涵体的形成.大量诱导表达重组蛋白进行纯化，洗脱样品中大部分为重组蛋白.提高漂洗缓冲液中咪唑浓度至50 mmol/L、100 mmol/L可以去除部分杂带，因此如要获得纯度更高的目的蛋白，可能需要优化漂洗缓冲液成分或者选择离子交换层析.［参考文献］［1］ Utans U，Arceci R J，Yamashita Y，et al.Cloning and characterization of allograft inflammatory factor－1:a novel macrophage factor identified in rat cardiac allografts with chronic rejection［J］.Journal of Clinical Investigation，1995，95(6):2 954－2 962.［2］ Imai Y，Kohsaka S.Intracellular signaling in M－CSF－induced microglia activation:role of Iba1［J］.Glia，2002，40(2):164－174.［3］ Kruse M，Steffen R，Batel R，et al.Differential expression of allograft inflammatory factor 1 and of glutathione peroxidase during auto －and allograft response in marine sponges［J］.Journal of Cell Science，1999，112(23):4 305－4 313.［4］ De Zoysa M，Nikapitiya C，Kim Y，et al.Allograft inflammatory factor－1 in disk abalone(Haliotis discus discus):Molecular cloning，transcriptional regulation against immune challenge and tissue injury ［J］.Fish and Shellfish Immunology，2010，29(2):319－326.［5］ Fujiki K，Shin D H，Nakao M，et al.Molecular cloning ofcarp(Cyprinus 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风疹病毒E1蛋白克隆表达及应用
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风疹 病 毒 Ｅ 蛋 白克 隆表 达及 应用 １
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风疹病毒E1包膜糖蛋白的结构与功能研究进展
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一种重组风疹病毒蛋白及应用[发明专利]
![一种重组风疹病毒蛋白及应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/cf67d61dfab069dc502201f5.png)
专利名称：一种重组风疹病毒蛋白及应用专利类型：发明专利
发明人：包洪,于庭,金玉芬,常静,肖霞,高艺航申请号：CN201010106102.3
申请日：20100205
公开号：CN101781360A
公开日：
20100721
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了的一种重组风疹病毒蛋白，它包括：风疹病毒蛋白RV的优势抗原表位E1片段，和C片段，并以其作抗原制备的风疹病毒抗体IgG免疫检测试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了风疹病毒感染临床诊断的需要。
本发明一种重组风疹病毒蛋白，抗原具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，在RV疫苗研制领域具有实际应用价值。
申请人：吉林大学
地址：130012 吉林省长春市朝阳区前进大街2699号
国籍：CN
代理机构：长春市四环专利事务所
代理人：张铁生
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麻疹病毒N蛋白原核表达纯化条件的优化
麻疹病毒N蛋白原核表达纯化条件的优化侯丹丹;王云龙;张怡青;孙新城;李玉林;米海;王继创;程蕾【摘要】通过构建重组表达质粒，诱导表达纯化麻疹病毒 N 蛋白．将麻疹病毒 N 蛋白基因片段与载体pET -32a（＋）相连接，通过 PCR 方法扩增获得重组质粒pET -32a（＋）/N，然后将重组质粒转入大肠杆菌 E．coli BL21（DE3）内，并优化诱导表达时间、温度、诱导剂浓度等条件．SDS -PAGE 和 West-ern blot 蛋白印迹检测表明，麻疹病毒 N 蛋白分子质量约为60 kD，表达产物用 Ni -NTA 亲和层析和DEAE 纯化后，纯度达90％．%In order to construct a recombinant expression plasmid which induced express purification mea-slesvirus(MV)N protein,the recombinant plamised of pET-32 a (+)/N amplified by PCR from MV N protein genes was inserted into expression vector pET-32 a (+),then it was transformed into E.coli BL21 (DE3).The condition of time,temperature and concentration of IPTG were optimized.The results of SDS-PAGE and Western blot tests showed that MV N protein molecular was 60 kD.The prot ein′s purity was 90% after being purified by Ni-NTA and DEAE.【期刊名称】《郑州轻工业学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(000)006【总页数】4页(P32-34,47)【关键词】麻疹病毒;核壳蛋白;原核表达;蛋白纯化【作者】侯丹丹;王云龙;张怡青;孙新城;李玉林;米海;王继创;程蕾【作者单位】河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007;河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007;河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007;郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州 450001;河南省生物工程技术研究中心，河南郑州 450001;河南省生物工程技术研究中心，河南郑州 450001;河南省生物工程技术研究中心，河南郑州 450001;河南省生物工程技术研究中心，河南郑州 450001【正文语种】中文【中图分类】Q786.4麻疹是一种高度传染的呼吸道疾病，具有典型的临床症状，包括斑丘疹、发热、咳嗽、鼻炎和结膜炎.麻疹病毒是麻疹的病原体，分类上属于副黏病毒科麻疹病毒属.麻疹病毒可以划分为8个基因组(A—H)，21个基因型，核壳蛋白(N蛋白)是麻疹病毒的主要抗原，可产生中和(Nt)抗体.在研究基因工程麻疹疫苗中，N蛋白基因是首选的病毒抗原［1］，它是麻疹病毒颗粒中含量最多的蛋白，并且是麻疹病毒在繁殖和转录过程中第一个被合成的蛋白，一般由525个氨基酸残基组成，分子量为60 kD.N蛋白主要是以磷酸化的形式存在，并同病毒的RNA结合形成多聚复合物，该复合物表现相当稳定，可以抵抗高盐的环境.当前利用基因工程方法表达麻疹病毒蛋白已有不少报道［2-5］.N蛋白诱导表达主要采用载体pET-28a(+)并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行，通过Ni-NTA亲和层析获得的高纯度目的蛋白用于ELISA检测.本实验拟选择麻疹病毒N蛋白基因片段，构建原核表达载体，以期经诱导表达和纯化，获得目的蛋白.1.1 材料1.1.1 质粒和宿主菌 pUC19/N由河南省生物工程技术研究中心提供;载体pET-32a(+)，购自Novagen公司;E.coli BL21(DE3)大肠杆菌菌株由本实验室保存.1.1.2 引物的设计依据表达质粒和N蛋白基因编码区设计引物，上游引物5'—CGCGGATCCATGTTGGAGGTTGTCCAG—3'(含BamHⅠ酶切位点)，下游引物5'— CCCAAGCTTCTAGTCTAGAAGGTCTCT—3'(含XhoⅠ酶切位点)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.1.1.3 主要试剂BamHⅠ，HindⅢ限制性内切酶，T4 DNALigase连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司;DNA胶回收试剂盒、异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)购自Sigma公司.1.2 方法1.2.1 重组质粒pET－32a(+)/N载体构建及转化 1)依据N蛋白基因编码区设计引物，建立30 μL PCR反应体系(20×buffer，1.5 μL;MgCl2，0.3 μL;dNTP，0.3μL;上游引物，0.2 μL;下游引物，0.2 μL;DNA聚合酶，0.3 μL;模板，0.5 μL;ddH2O，4 μL)扩增目的基因片段，扩增产物与pET-32a(+)载体经BamHⅠ，XhoⅠ双酶切后，由T4 DNA连接酶连接双酶切产物而构建重组质粒pET-32a(+)/N;2)将质粒转入宿主细胞大肠杆菌中，接种于1 mL LB液体培养基中，37℃摇床培养1 h，然后取菌液50 μL转接于3.5 mL LB(含Amp 30 mg/mL)液体培养基中，培养至OD600约为0.3～0.5，加IPTG至终浓度为0.2 mmol/L，诱导表达5 h，分别进行12%SDS—PAGE分析;3)将表达菌送上海生物工程技术服务有限公司测序.1.2.2 重组菌的小样诱导表达及条件的优化1)温度诱导:在IPTG浓度为0.2mmol/L下，分别于30℃，37℃和42℃诱导表达5 h.2)IPTG浓度诱导:在37℃，IPTG浓度分别为0.1 mmol/L，0.2 mmol/L，0.5 mmol/L，1.0 mmol/L，2.0 mmol/L，诱导表达5 h.3)时间诱导:在IPTG浓度为0.2 mmol/L，37℃条件下，分别诱导3 h，4 h，5 h，6 h，7 h，8 h.取表达产物各1 mL以1 000 r/min破碎离心5 min，离心后取上清进行12%SDS-PAGE分析.1.2.3 重组菌大样的诱导表达按小样最佳诱导条件，取表达稳定的菌液1 mL接于1 000 mL LB液体培养基(含Amp 30 mg/mL)，进行大样诱导表达，收集菌液，4 500 r/min离心15 min，弃上清，加入0.05 mol/L PB洗涤沉淀，再次离心后收集沉淀.1.2.4 N蛋白的纯化及Western blot蛋白印迹验证将收集的沉淀用0.05 mol/L PB(pH=7.8)溶解，在冰浴条件下超声破碎，将破碎的菌液8 000 r/ min离心15 min，取上清过Ni-NTA亲和层析柱和DEAE柱纯化，Western blot蛋白印迹验证.2.1 N蛋白基因的克隆及pET－32a(+)/N表达载体构建PCR产物电泳结果见图1，在1 452 bp左右有一条目的带，与测序结果相符.诱导表达结果见图2，与BL21空菌和未诱导重组菌相比，上清中约在60 kD处有目的条带，大小与预期值相符.测序结果表明表达菌含N蛋白基因片段，即重组质粒构建成功.2.2 目的蛋白的表达及条件的优化温度梯度诱导结果见图3，37℃表达量最大; IPTG梯度诱导结果见图4，IPTG浓度为0.2 mmol/L时最优;时间梯度诱导结果见图5，4 h时菌体表达量最优.综上可知，37℃，IPTG浓度为0.2 mmol/L，诱导4 h条件下，目的蛋白的表达结果最佳.2.3 目的蛋白的纯化及Western blot蛋白印迹验证目的蛋白经Ni柱和DEAE纯化后SDS-PAGE检测结果见图6.Western blot免疫印迹结果见图7.纯化后蛋白浓度的测定结果为A280=2.704，根据标准N蛋白吸光度值与蛋白浓度之间的转换关系，A =0.963时相当于蛋白浓度为1.0 mg/mL，可粗略计算出所纯化的N蛋白浓度约为3.0 mg/mL，最终收集纯化后N蛋白的体积约为35 mL，Ni柱亲和层析纯化所得蛋白质量约为105 mg.由图7可见，纯化后的麻疹N蛋白与相应抗体产生特异性反应，证明该蛋白有较好的抗原性.本研究将麻疹病毒核壳蛋白基因导入到大肠杆菌中，选择pET-32a(+)载体，得到重组表达质粒pET-32a(+)/N.同时对温度、时间、诱导剂浓度等诱导条件进行优化.实验发现，在温度37℃，诱导时间4 h，IPTG浓度0.2 mmol/L的条件下目的蛋白表达量最高.选择Ni2+配体亲和层析和DEAE柱纯化后，蛋白纯度高达90%.此蛋白表达纯化系统的建立和优化将会对MV病毒N蛋白的纯化和进一步探讨其功能提供依据.【相关文献】［1］马雷钧，陈志慧.麻疹病毒流行株主要结构蛋白的基因变化［J］.国外医学预防诊断治疗用生物制品分册，2002，25:6.［2］王伟，王海梅.RT-PCR法检测尿液标本中麻疹病毒核蛋白(N)基因的临床应用及意义［J］.山西医科大学学报，2012，43(12):118.［3］ Sousa E，Agudelo-Suárez A，Benavides F G，et al.ITSAL project:Immigration，work and health in Spain:the influence of legal status and employment contract on reported health indicators［J］.Publ Health，2010，55(5):443.［4］陈寅，卢亦愚.麻疹核蛋白基因的表达及检测应用的研究［J］.中国卫生检验杂志，2009，19(5):123.［5］ Willen S.How is health-related“deservingness”reckoned? Perspectives from unauthorized immigrants in Tel Aviv［J］.Soc Sci Med，2012，74(6):812.。
RT-PCR诊断风疹及E1膜蛋白基因序列分析
RT-PCR诊断风疹及E1膜蛋白基因序列分析白立石;孟仁;陶伟英;David Brown【期刊名称】《中国公共卫生》【年(卷),期】2002(18)3【摘要】目的应用RT -PCR方法扩增风疹病毒E1膜蛋白的核苷酸片段作为检测该病毒感染的靶目标。
方法对发疹后 4周 ,ELISA检测风疹病毒感染 (IgM阳性 )的病人血清样品提取RNA ,用RT -PCR方法扩增风疹病毒E1膜蛋白的 142bp核苷酸片段。
测序并与英国代表株Thomas株的相应核苷酸序列进行比较。
结果 10份样品中 ,4份样品扩增到一条DNA片段。
测序结果分析表明 3份样品扩增的风疹病毒E1膜蛋白的核苷酸片段序列与英国代表株Thomas株的相应核苷酸序列有 3个核苷酸的变异。
一份样品扩增的风疹病毒E1膜蛋白的核苷酸片段序列与英国代表株Thomas株的相应核苷酸序列 4个核苷酸的差异。
结论该片段的核苷酸序列很稳定 ,适用于作为RT -PCR方法检测该病毒感染的靶目标。
【总页数】3页(P304-306)【关键词】风疹病毒;RT-PCR;DNA序列分析;风疹;E1膜蛋白;基因【作者】白立石;孟仁;陶伟英;David Brown【作者单位】黑龙江省疾病控制中心;Virus Reference,PHLS Central Public Health Laboratory【正文语种】中文【中图分类】R511.204【相关文献】1.风疹病毒JR23株E1包膜糖蛋白的基因克隆与序列分析 [J], 王志玉;薛永磊;王小凡;宋艳艳2.利用RT-PCR法进行风疹病毒的临床检测及基因序列分析 [J], 时雪梅;刘晓明;金俐;卫风蕾;周梅娟3.风疹病毒毒株的分离鉴定及其E1基因部分序列分析 [J], 王燕;姜昕;谷鸿喜;郭彩玲4.中国人丙型肝炎病毒膜蛋白和非结构区1(E1,E2/NS1)的基因克隆和序列分析 [J], 曾蔚蓝;阮力5.用金标卡与RT-PCR对猪瘟的快速诊断及其病毒E2基因的序列分析 [J], 汤德元;黄涛;梁仕岩;徐健;王彬;张顺洪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
风疹病毒包膜糖蛋白细胞融合的分子机制研究的开题报告
风疹病毒包膜糖蛋白细胞融合的分子机制研究的开题报告题目：风疹病毒包膜糖蛋白细胞融合的分子机制研究一、研究背景及意义风疹病毒是一种单股RNA病毒，属于图病毒科，是引起风疹病的主要病原体之一。
风疹病毒的包膜糖蛋白（E蛋白）是介导病毒进入宿主细胞并进行细胞融合的关键蛋白。
近年来，对E蛋白进行功能和结构研究，揭示了其重要性以及细胞融合的分子机制，为风疹病毒病理生理和疫苗研发提供了参考数据。
二、研究对象及内容本研究拟以风疹病毒E蛋白为研究对象，通过分子生物学、生物化学、细胞生物学等手段，研究其与宿主细胞膜上蛋白的相互作用、E蛋白结构与细胞融合之间的关系等，探究其分子机制，具体研究内容包括：1. 风疹病毒E蛋白与宿主细胞膜上蛋白的相互作用。
2. 风疹病毒E蛋白的结构和构象变化在细胞融合中的作用。
3. E蛋白介导的细胞融合过程中的信号转导和调节机制。
4. 探究单个E蛋白与细胞膜的相互作用的分子动力学机制。
三、研究方法及技术路线本研究的主要实验室技术包括分子生物学、细胞生物学、生物化学、蛋白质纯化和晶体学等技术，主要实验流程如下：1. 实验室基础搭建建立病毒细胞培养体系，培养、分离和纯化感染风疹病毒所需细胞系。
2. E蛋白的表达和纯化采用重组表达技术生产纯化具有细胞膜融合活性的E蛋白和E蛋白突变体。
3. E蛋白与细胞膜的相互作用测定采用表面等温反向吸附测定法（SPR），Isothermal titration calorimetry（ITC），荧光共振能量转移法（FRET）等技术，研究E蛋白与宿主细胞膜上蛋白的相互作用。
4. 风疹病毒E蛋白介导细胞融合的研究通过将E蛋白与细胞膜样品在不同条件下进行调节，如改变pH、离子浓度、温度等，探究E蛋白介导的风疹病毒细胞融合反应过程和相关环节。
5. 分子动力学模拟采用分子动力学模拟手段研究单个E蛋白与细胞膜的相互作用的分子动力学机制。
四、预期成果及意义本研究预期可以探究风疹病毒E蛋白介导的细胞融合的分子机制，为研发针对风疹病毒的疫苗提供参考，同时也能对其他相关病毒的研究有所启示。
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基 … １Ｄ硫代半乳糖苷（Ｐ ｃ 浓度 和诱导时间对 目的蛋 白表达产 量的影响 。结果 ３ Ｉｒ ） 达 ４ｈ可获得最佳 表达量 。结论
获得相 对分 子质 融合蛋 白， ｓ ｒ ｌ 证明其具有 良好 的抗原性 ， Ｗｅｔ Ｂｏ ｅ ｎ ｔ 并确定该 蛋白在 ３ Ｏ℃、 ． ｍ ｌＬＩ ０ ６ｍ ｏ ／ ｍ
摘要 ： 目的
为风疹病毒 （ Ｖ） Ｒ 感染提供特异性及 敏感性高 的检 测手段。方法 采用 Ｐ Ｒ扩增 Ｒ Ｃ Ｖ包膜 糖蛋
白 Ｅ 基 因 ２ ２— ５ ａ片段 ， ｌ ０ ３ ３ａ 并将其插入表达 载体 ｐ Ｔ ０ （ ， Ｅ ３ ａ ＋） 构建 ｐ Ｔ ０ （＋）Ｅ ， 化 Ｂ ２ （ ｌ ｓ 菌株 ， Ｅ ３ａ － １转 Ｌ １ ｐｙ ） ｓ 十 二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（ Ｄ －Ａ Ｅ） Ｗｅｔ ｌ 初 步分析蛋 白表达及抗原性 ； Ｓ ＳＰ Ｇ 和 ｓ ｒ Ｂｏ ｅ ｎ ｔ 并探讨 温度 、 异丙
性 和敏感性 的 Ｒ Ｖ检测试剂盒提供了实验依据 。
本研 究为 Ｒ Ｖ包膜糖蛋 白 Ｅ １抗原纯化及应用奠定了基础 ， 亦为研制生产高特异
关键 词 ： 风疹病毒 ； 包膜糖蛋 白 Ｅ ； １ 大肠杆菌 ； 表达条件 ； 优化
中图分类 号 ：３ １ １ Ｒ ７ ． 文献标志码 ： Ａ 文章编号：０２２ ６ ２ １ ） ３０ １ － １０ － Ｘ（０ ０ ０ － ８０ ６ ０ ２
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山东 医药 ２ １ ０ ０年第 ５ Ｏ卷第 ３期
风 疹病 毒包 膜 糖蛋 白 Ｅ １的原 核 表 达及 条 件 优 化
岳盈盈 ． 李 鹏。 李志会 。 宋楠楠 。 赵元昊， 纪 璇， 孟 红’
（ 山东省医学科学院基础医学研 究所 ， 山东省现代 医用药物与技术 重点 实验 室 ， 南 ２０ ６ 济 ５０２）