抗原偶联选择方法

载体的选择：

1.载体表面应首先应具有化学活性基团，这些基团可以直接与抗生素或农药分子偶联，这

是化学偶联制备抗原的前提；

2.其次,载体应具备一定的容量,可以偶联足够的分子；

3.载体还应该是惰性的,不应干扰偶联分子的功能；

4.而且载体应具有足够的稳定性,且应该是廉价易得的.

载体蛋白质有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等

这些蛋白质分子中的α和ε-氨基（等电点8和10）、苯酚基、巯基（等电点为9）、咪唑基（等电点为7）、羧基（等电点2～4,大部分来自天冬氨酸或谷氨酸的β-和γ-羧基）等在等电点pH条件下,一部分成为质子,另一部分未质子化的亲核基团则具有反应活性,可与半抗原中的对应基团结合.当然,这些基团的反应性也取决于蛋白质各种氨基酸残基的微环境.牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HAS）分子中含有大量的赖氨酸,故有许多自由氨基存在,且在不同pH和离子强度下能保持较大的溶解度.此外,这些蛋白质在用有机溶剂（如吡啶、二甲基甲酰胺）溶解时,其活性基团仍呈可溶状态,因此,这两种蛋白质是最常用的载体蛋白质.近年来,有研究报道用人工合成的多聚肽(最常用的是多聚赖氨酸)作载体,表现出能增加半抗原的免疫原性,从而使产生征对半抗原的特异性抗体可能性增加,被广泛应用。

人工抗原合成方法：

小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会到偶联物的浓度及其相对比例、偶联剂的有效浓度及其相对量、缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH以及半抗原的稳定性、可溶性和理化特性等因素的影响.通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合,不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行.一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法,常用的方法如下：

分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联

1）混合酸酐法（mixed anhydride method）：也称氯甲酸异丁酯法。偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride)，然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。

2）碳二亚胺法（CDI）：碳二亚胺(EDC)使羟基和氨基间脱水形成酰胺键,半抗原上的羧基先与EDC反应生成一个中间物,然后再与蛋白质上的氨基反应,形成半抗原与蛋白质的结合物（见图）.EDC被称作零长度交联剂之一,因为它作为酰胺键的形成介质并没有形成手臂分子.

此连接方法十分简便,只需将载体蛋白质和抗原按一定比例混合在适当的溶液中,然后加入水溶性碳化二亚胺,搅拌1～2h,置室温24h,再经透析即可。如果半抗原分子中不含羧基,可通过某些化学反应引入羧基.在引入羧基后,也可用上述方法进行偶联。

含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联

1）戊二醛法：双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形成schiff 键(-N=C<，在半抗原和蛋白质间引入一个5碳桥。这一反应条件温和，可在4～40℃及～内进行，操作亦简便，因此应用广泛。戊二醛受到光照、温度和碱性的影响，可能发生自我聚合，减弱其交联作用，因此最好使用新鲜的戊二醛。

2）重氮化法：用于活性基团是芳香胺基的半抗原，芳香胺基与NaNO2和HCl反应得到一个重氮盐，它可直接接到蛋白质酪氨酸羧基的邻位上，形成一个偶氮化合物。

含羟基半抗原的偶联

1）琥珀酸酐法：半抗原的羟基与琥珀酸酐在无水吡啶中反应得到一个琥珀酸半酯(带有羧基的中间体)，再经碳二亚胺法或混合酸酐法与蛋白质氨基结合，在半抗原与蛋白质载体间插

入一个琥珀酰基。

2）羰基二咪唑法：N，N’-羰基二咪唑是引入羰基的高活性试剂，在肽合成中首次表明了是形成极好的酰胺键试剂[33]。含羟基的分子同羰基二咪唑反应，形成中间体咪唑基甲酸酯，它能和N-亲核试剂反应，得到N-烷基化的甲酸酯键，通常蛋白质通过N-端(α-氨基)和赖氨酸侧链的(ε-氨基)和分子形成不带电的类似尿烷的衍生物，具有极好的化学稳定性。

含巯基半抗原的偶联

可用马来酰亚胺方法与蛋白偶联。此外，将载体蛋白用溴乙酰胺激活。或将载体蛋白与半抗原在的醋酸缓冲液中，通过过氧化氢的作用形成二硫键，也可以将半抗原连接到蛋白质分子上。

影响人工抗原质量的因素主要有： 1) 偶联比 2) 偶联桥 3）半抗原的分子空间结构

人工抗原的质量评定：

1.浓度测定（mg/ml，每ml抗原溶液中含有蛋白质多少mg）紫外吸收法、Folin-酚法、

双缩脲法、微量凯式定量法、染色结合法和荧光法

2.纯度鉴定和结构分析分配层析和电泳技术

3.偶联比的测定分光光度法标记抗原示踪法

反应实例

氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法

1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。

2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。

3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。

4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。

碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤

1、取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液）

2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)

3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III液）

4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下）

5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液

6、 4度搅拌12小时

7、静置10小时（4度）

8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原

芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤

1、用mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L浓度的半抗原。

2、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。

3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。

4、用、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。

5、边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到。

6、冰箱中搅拌反应2小时，不断