454测序原理
454测序原理
454测序原理
454测序技术是一种基于测序仪器的高通量测序技术，其原理是通过将DNA 样本分离成小片段，然后将这些片段连接到载体上，最终通过测序仪器进行测序。
本文将详细介绍454测序的原理及其应用。
首先，454测序的原理是基于“串联测序”（pyrosequencing）技术。
在这种技术中，DNA样本首先被分离成小片段，然后这些片段被连接到载体上形成DNA文库。
接下来，这些DNA片段会被放置在微小的水滴中，每个水滴中只含有一种DNA片段。
然后，这些微小水滴会被放置在一个包含放射性同位素的试剂中，当DNA聚合酶合成新的DNA链时，会释放出能够被探测的放射性同位素。
其次，454测序的原理还涉及到核苷酸的测序。
在这个过程中，每个核苷酸会被加入到新合成的DNA链中，而且只有当正确的核苷酸被加入时，才会释放出能够被探测的放射性同位素。
因此，通过检测放射性同位素的释放量，就可以确定每个核苷酸的顺序。
另外，454测序的原理还包括数据分析。
在测序完成后，会得到大量的数据，这些数据需要进行分析才能得到最终的测序结果。
数据分析的过程包括对原始数据的处理、序列拼接、序列比对等步骤，最终得到DNA序列的信息。
最后，454测序技术在基因组学研究、疾病诊断、药物研发等领域有着广泛的应用。
通过454测序技术，可以快速、高效地获取DNA序列信息，为相关领域的研究提供了重要的数据支持。
总之，454测序技术是一种基于测序仪器的高通量测序技术，其原理是基于串联测序技术，涉及到DNA样本的分离、核苷酸的测序和数据分析等步骤。
该技术在基因组学研究、疾病诊断、药物研发等领域有着广泛的应用前景。
高通量测序技术简介
高通量测序技术简介
高通量测序技术又称“下一代”测序技术，以能一次并行对几十万到几 百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。目前用于微生物群 落多样性研究的高通量测序平台主要有来自罗氏公司的 454法、Illumina公 司Solexa法和 ABI 的 SOLiD 法
罗氏454法测序原理
GS FLX系统的测序原理是基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对DNA序列进 行检测。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下， GSFLX系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过 检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。
罗氏454法测序流程
Solexa测序法测序流程
• 1.添加接头：利用物理方法将待测 样品DNA打碎，在单链DNA碎片两端 加上接头
• 表面结合：Solexa的测序时利用微注 射系统将已经加过接头和待测片断随 机添加到玻璃Flow Cell内，每一个 Flow Cell又补分成8条Lane，每条 Lane的内表面上能与共价键的形式随 机固定单链接头序列和带接头的单链 待测DNA片断
四种荧光标记的染料应用边合成边测序（ Sequencing By Synthesis ） 的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。 互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。多余的核苷 被移走。这样每个单链 DNA 分子通过互补碱基的配对被延伸，利用生物发光蛋 白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来 提供检测信号。针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个 标记会释放出荧光。荧光信号被 CCD 采集，CCD 快速扫描整个阵列检测特定的 结合到每个片断上的碱基。通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就 有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。
454测序技术基本原理
454测序技术基本原理454测序技术是一种基于DNA串联式测序的高通量测序技术。
该技术利用PCR扩增的方式将DNA分子固定在微球上，然后将这些微球均匀地分散在pico流水仪上，通过单个核苷酸连续测序的方式得到DNA序列信息。
本文将从实验步骤、原理和优缺点三个方面阐述454测序技术的基本原理。
实验步骤1、DNA提取测序前需要从样品中提取目标DNA物质。
对于不同的样品，提取方法不同，通常采用化学试剂、机械破碎或针刺取等方法提取DNA。
2、PCR扩增PCR扩增是将DNA序列按照一定的温度循环条件进行复制的过程。
PCR扩增由若干次循环组成，通常可分为三步：a) 熔解（Denaturation）：高温（95℃~98℃）使DNA双链分离成两个单链，形成单链DNA模板。
b) 合成（Annealing）：温度回降（50℃~70℃），引物结合到单链DNA上，形成DNA 双链结构。
c) 延伸（Extension）：DNA聚合酶将双链DNA沿模板链向3'端延伸合成新的DNA链。
PCR扩增反应得到的DNA产物可分为两种类型：大量扩增的目标DNA和微球放置板上随机捕获的非模板DNA。
3、微球固定4、测序反应测序反应通过单个核苷酸的连续探测，对目标DNA序列进行识别和测序。
精细的光学和声学系统检测每次核苷酸加入后发出的光信号，然后排除错误数据并将相邻的场景、质量和信号强度合并以产生最终测序可靠的序列。
原理1、基于串联式测序在测序反应中，每个核苷酸单元依次加入为该反应产物的单一串联链的一部分。
这种串联式测序方式将初步测序的精度扩展到所有测序反应产物的终端序列。
2、基于荧光原理测序反应中每个核苷酸单元的加入和检测均通过荧光技术实现。
特殊荧光分子被加入到产物反应液中，随着核苷酸单元的加入和反应的进行，每个反应产生的荧光信号与特定的核苷酸单元有关。
3、基于高通量454测序技术结合了反应批处理和DNA克隆，大大增加了读取的序列数量。
454测序法在环境微生物生态研究中的应用 徐晓宇
#技术与方法#生物技术通报BI OTEC HNOLOG Y BULLETI N2010年第1期454测序法在环境微生物生态研究中的应用徐晓宇1刘和2(1江南大学医药学院,无锡214122;2江南大学环境与土木工程学院,无锡214122)摘 要: 传统的Sanger 测序技术虽已成熟,但其速度和成本的限制满足不了大规模测序的要求。
第二代高通量测序技术结合了乳胶微粒和皮升级反应的454焦磷酸测序法,作为一种高通量测序技术,具有分析结果准确、高速、高灵敏度和高自动化的特点。
对454测序法的技术原理和操作步骤进行了介绍,对近年来运用该方法在环境微生物生态研究领域的进展进行了综述。
关键词: 454测序 环境微生物生态 宏基因组Application of 454Se quencing i n Environ m entalM icrobial EcologyXu X i aoyu 1L i u H e2(1Sc hool of M e dicine and Phar mace uti cal,W ux i 214122;2School of Environ mentand CivilEngi neerin g J iangnan Uni versit y,Wux i 214122)Abstrac:t T here has been a des i re to i ncrease the t hroughput o f DNA sequenc i ng ev er since Sang er sequenci ng by cha i n te r m ina -ti on o r fragmentation techn i ques coupled w it h e l ectrophoretic size separa ti on 1454sequenc i ng is the py rosequenc i ng w hich comb i ned w ith m i crofl u i d i cs and p i co lite r reaction 1In th i s article ,t he deve lop m ent o f the 454sequenc i ng syste m was discussed ,and t he app licati on of 454sequenc i ng i n env i ron m enta lm icrob i a l eco l ogy w as rev i ew ed 1K ey words : 454sequenc i ng Env iron m ental m icrob i a l ecology M etagenom ics 收稿日期:2009-09-30基金项目:江苏省科技支撑计划社会发展项目(BE2008627)作者简介:徐晓宇,女,硕士,研究方向:环境微生物;E -ma i :l iist @ji angn an 1edu 1cn自Sanger 测序法1977年问世以来,因其准确、读长较长的优点而被广泛应用,但是这种测序方法效率较低,科学的发展需要更高通量的测序平台,包括454测序技术在内的新的测序方法应运而生。
454测序原理
454测序原理
454测序原理是一种被广泛应用于基因组学研究的高通量测序技术。
其原理基于荧光化学发光和低密度DNA固相扩增的方法，能够以高通量的方式快速获取大量的基因组信息。
首先，将待测DNA样品进行首次扩增，得到大量的单链DNA模板。
然后，将这些单链DNA模板固定在微小的玻璃球上，每个玻璃球上只有一个DNA模板。
之后，这些玻璃球会被封装在一个水油混合液中的微小水滴中，每个水滴中通常只有三个玻璃球。
接下来，这些水滴会被密封在一片透明的PicoTiterPlate™中，并在一组具有不同碱基的草酸序列上进行串联测序，这些草酸序列会与模板DNA上的碱基进行互补配对。
然后，454测序仪会从PicoTiterPlate™中释放出草酸序列，当这些草酸序列与模板DNA上的碱基配对时，会释放出一定量的能量。
这些能量会被测序仪检测到，并将其转化成可视化的荧光信号。
最后，经过相应的图像处理和数据分析，就可以得到原始的测序数据。
根据荧光信号的强度和先后顺序，可以确定每个DNA模板上的碱基序列。
总结来说，454测序原理基于荧光化学发光和低密度DNA固相扩增的方法，通过测量荧光信号的强度和先后顺序，快速获
得DNA模板的碱基序列信息。
这种技术具有高通量、高准确性和高灵敏度等特点，在基因组学领域有着广泛的应用。
下一代测序技术名词解释
下一代测序技术名词解释下一代测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）是一种高通量测序技术，能够同时对大量的DNA或RNA进行测序。
相比传统的测序技术，下一代测序技术具有更高的测序速度、更低的成本以及更强的分辨能力。
以下是一些常见的下一代测序技术名词解释：1. Illumina测序（Illumina Sequencing）：Illumina公司开发的一种基于桥式扩增（Bridge Amplification）的测序技术。
它通过光反应和荧光检测原理，将DNA片段扩增成固定桥结构，再通过碱基逐个加入的方式进行测序。
2. 454测序（454 Sequencing）：Roche Diagnostics公司开发的一种基于聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）和微滴化技术的测序技术。
它通过将DNA片段扩增成微滴并进行逐个碱基加入的方式进行测序。
3. Ion Torrent测序（Ion Torrent Sequencing）：Ion Torrent Systems公司开发的一种基于核苷酸测序的技术。
它通过检测DNA串联上新生链中释放的质子来确定DNA序列。
4. PacBio测序（Pacific Biosciences Sequencing）：Pacific Biosciences公司开发的一种基于DNA聚合酶反应的测序技术。
它利用单分子实时测序原理，通过测量聚合酶在 DNA模板上运动的时间来确定序列。
5. Nanopore测序（Nanopore Sequencing）：Oxford Nanopore Technologies公司开发的一种基于纳米孔技术的测序技术。
它通过电流信号检测DNA/RNA分子通过纳米孔时的不同电流变化，从而实现对序列的测定。
这些下一代测序技术在基因组学、转录组学、表观遗传学等领域中广泛应用，对于生物医学研究、疾病诊断和个体化医疗等方面具有重要意义。
seq测序的原理及应用
SEQ测序的原理及应用前言SEQ测序是一种重要的生物学技术，它通过测定DNA或RNA序列来揭示生物体内的基因信息。
本文将介绍SEQ测序的原理、应用以及相关的技术发展。
SEQ测序的原理SEQ测序通过反复复制DNA或RNA来获得大量的DNA或RNA片段，然后通过特定的测序方法分析这些片段的序列。
常用的SEQ测序方法包括Sanger测序、454测序、Illumina测序和Ion Torrent测序。
Sanger测序Sanger测序是最早被广泛应用的测序方法之一。
它使用特殊的核酸链终止剂（ddNTP）来阻止DNA链的延伸，然后利用电泳将延伸终止的DNA片段按照大小排序。
测序结束后，根据延伸终止的顺序就可以确定DNA的序列。
454测序454测序是一种高通量测序方法，它使用了一种称为“二代测序”的技术。
该方法通过将DNA片段连接到小珠上，并在小珠表面扩增，然后使用荧光标记的核酸链终止剂来测序。
测序过程中，每次加入一个碱基，都会释放出一个光信号，这些光信号被记录下来并转化为序列。
Illumina测序Illumina测序是目前最常用的高通量测序技术之一。
它利用凝胶上固定的DNA片段和特殊的引物来扩增DNA片段，并通过量子荧光标记的核酸链终止剂来测序。
这种方法可以同时进行数百万次测序，速度快、准确性高。
Ion Torrent测序Ion Torrent测序是一种基于离子检测的测序方法。
该方法使用特殊的压电离子探测器来测量水解反应产生的氢离子数目，从而确定DNA序列。
Ion Torrent测序速度快、成本低，适合快速测序。
SEQ测序的应用SEQ测序在生命科学研究、医学诊断和生物工程等领域有着广泛的应用。
基因组学研究SEQ测序是进行基因组学研究的重要工具之一。
通过测序方法可以获得生物体的全基因组序列，解析基因功能、研究基因组的结构和变异，并寻找与疾病相关的基因。
肿瘤学研究SEQ测序在肿瘤学研究中发挥着重要作用。
通过测序，可以鉴定肿瘤中的基因突变和基因重排等变化，为肿瘤的早期诊断、治疗和预后评估提供依据。
人类基因组测序方法
人类基因组测序方法人类基因组测序是获取个体基因组的DNA序列信息的过程。
随着技术的进步，出现了多种测序方法，其中一些主要的包括：1. Sanger测序（链终止法）：这是早期使用的一种测序方法。
它基于DNA合成链的终止原理，通过使用包含具有特定荧光标记的二进制链终止核苷酸，来逐步合成DNA链并测序。
2. Illumina测序（高通量测序）： Illumina是目前最常用的高通量测序技术。
它采用桥放大法，将DNA片段固定在表面上，通过逐步合成链来测序。
Illumina技术具有高通量、较低成本和相对较短的读长等优势。
3. 454测序（Pyrosequencing）： Roche 454测序使用焦磷酸测序技术，通过测量每个核苷酸加入时释放的焦磷酸，来确定DNA序列。
然而，这个技术相对于Illumina而言，已经较少被使用。
4. Ion Torrent测序： Ion Torrent测序基于半导体芯片，通过检测氢离子的释放来确定DNA序列。
这是一种相对新的测序技术，具有快速测序的特点。
5. PacBio单分子实时测序： Pacific Biosciences (PacBio) 提供了一种单分子实时测序技术，它基于测量DNA聚合物链上的荧光来进行测序。
PacBio测序的优势之一是较长的读长，有助于解决一些基因组中的结构性变异。
6. Oxford Nanopore测序： Oxford Nanopore Technologies 提供的测序技术使用纳米孔来测定DNA序列。
这种方法具有长读长和实时测序的优势，适用于一些复杂的基因组结构。
这些测序方法有不同的优缺点，适用于不同的研究目的。
研究人员根据项目需求、预算和技术要求选择合适的测序平台。
在实践中，通常会使用多种测序方法的组合，以获取更全面的基因组信息。
454测序
第二代测序技术（Next-Generation Sequencing）NGS之基础篇2001年，美、英、法、德、日、中六国合作，历时十年，耗资数十亿美元的人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）宣告完成。
转眼又是十年过去，在此期间，各国科学家仍在为解读基因的密码而不懈努力，这其中最大的突破，就是第二代测序技术的推出。
HGP的顺利完成证明了我们有能力对自身的遗传信息进行研究，然而，高昂的成本、漫长的时间、巨大的人力需求，无不限制着对遗传密码的进一步认识。
从HGP开始的第一天期，科学家们就在寻求更好的方法来对基因组进行研究，“鸟枪法”就是其中之一。
2006年，美国X大奖基金会（）设立了奖金高达1000万美元的基因组Archon X大奖，旨在奖励第一个在10天内以低于100万美元的成本完成100个人类基因组测序的民间团队。
而罗氏（Roche）、应用生物系统（Applied Biosystems，ABI）、Illumina三家公司先后推出了各自的第二代高通量测序平台，成为NGS领域的领头羊。
2005年底，454公司推出第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，这是核酸测序技术发展史上里程碑式的事件。
随后，罗氏公司以1.55亿美元收购了454公司，并在2006年推出了更新的GS FLX测序系统，该系统可在10小时的运行中获得100万条读长（reads），4~6亿个碱基信息（base pair），且准确率达到99%以上。
2008年，GS FLX系统再次升级，通量提高了5倍，读长和准确率也有所增加。
虽然454 GS测序平台也许不是市场占有率最高的测序仪，但截至2011年3月，利用该系统进行研究的论文已发表超过1000余篇，而它在读长上的优势明显胜于另两套系统，因此在从头测序（de novo）和宏基因组测序（meta genome）方面有着不可替代的地位。
454测序技术原理和流程
454测序技术原理和流程454测序技术是一种基于边合成边测序（Sequencing-by-Synthesis）原理的第二代高通量测序技术。
它于2003年由Roche公司（现被Illumina收购）推出，并在接下来的十几年中成为基因组学和转录组学研究中广泛使用的测序平台之一、下面将详细介绍454测序技术的原理和流程。
原理：454测序技术的原理基于DNA文库的融合PCR（emulsion PCR）扩增和荧光PCR测序的思想。
首先，DNA样本被切割成适当长度的片段，并在连接接头后构建成DNA文库。
然后，在微量水滴中将单个DNA片段与一组引物和酶进行PCR扩增。
每个水滴中只有一个DNA片段和其互补链，它们会形成单链的DNA模板。
接下来，这些微量水滴重新包装到小球形体内，称为水滴中合成（emulsion clonal amplification）。
在合成过程中，每个DNA模板被荧光标记的四种去氧核苷三磷酸（dNTPs）和DNA聚合酶引导下进行DNA合成。
每次加入一个碱基的dNTP，当它与DNA模板互补时，DNA聚合酶会将其连接到模板上，形成连续的DNA链。
而每个碱基加入后，会释放出焦磷酸酯，产生光信号，通过荧光探测器检测到这些光信号并记录。
这种碱基加入和荧光检测的过程会重复多次，直到DNA链达到所需长度或检测不到进一步的信号。
这样，通过记录每个碱基的荧光信号，就可以获得一条包含DNA片段顺序的测序读数。
流程：1.样本制备：首先，从样本中提取DNA，然后将其切割成适当长度的片段。
3.融合PCR扩增：将连接接头的DNA片段与引物、酶和其他反应物一起加入到微量水滴中，使每个水滴中只有一个DNA片段。
然后，在PCR反应中进行多轮扩增，使DNA片段复制为数以百万计的复本。
4.DNA合成：将融合PCR扩增产生的水滴中的DNA片段重新包装到小球形体内，形成单链DNA模板。
接着，在存在荧光标记的dNTPs和DNA聚合酶的条件下，进行边合成边测序，记录下每次碱基加入的荧光信号。
基因组学总结
Roche 454（GS FLX Titanium System）超高通量测序技术原理2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序的先河。
2007年又推出了性能更优的第二代基因组测序系统——Genome Sequencer FLX System。
2008年10月，454推出了全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件，让GS FLX的通量一下子提高了5倍，准确性和读长也进一步提升。
GS FLX 测序原理：GS FLX系统的测序原理和GS 20一样，也是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；在DNA 聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来(图1)。
通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。
此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。
Roche GS FLX System是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量基因组测序系统。
在测序时，使用了一种叫做“Pico TiterPlate”（PTP）的平板，它含有160多万个由光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。
测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。
如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。
这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。
此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。
有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。
关于ion torrent和454
技术特点
1、简单：基于半导体技术测序原理，不用荧光、化学发光和酶级联反应；消耗样本少；
2、快速：从文库构建到数据产出只需2天，上机测序只需2～3小时；
3、灵活性：可满足不同通量的测序需求。
314 TMChip（~10Mb/run），316 TMChip（~100Mb/run），318 TMChip （~1Gb/run），PI Chip （~10Gb/run），PII Chip （~100Gb/run）。
4、准确性：99.97%
Roche 454 GS FLX+ 测序平台是罗氏旗下的454生命科学推出的最新升级版测序仪，该仪器的最大读长能够达到1000bp，测序准确性高达99.997%，达到了与Sanger相当的长度与准确性，并降低了测序成本，从而集一代sanger 测序读长及质量优势与二代测序高通量特点于一身。
454 GS FLX+
介绍：
454 GS FLX+ 是基于焦磷酸测序(Pyrosequencing) 原理建立的高通量基因组测序系统，依靠生物发光进行DNA序列分析的技术：在多种酶的协同作用下，当碱基正确配对时，发生一个合成反应和一个化学发光反应的偶联，释放光信号。
光信号实时被高灵敏度CCD捕获，最终达到测序的目的。
性能参数：
测序流程：。
454技术培训
Library Quantitation
1 no dilution 2 2/3rd dilution of tube 1 3 2/3rd dilution of tube 2 4 2/3rd dilution of tube 3 5 2/3rd dilution of tube 4 6 2/3rd dilution of tube 5 2.50 × 109 1.67 × 109 1.11 × 109 7.41 × 108 4.94 × 108 3.29 × 108
Isolation and Enrichment of DNA Positive Beads
Bio
Bio Bio Bio
Bio Bio
Bio
Denature
Emulsification
Distribution
Amplification
Isolation and Enrichment of DNA Positive Beads
Four hundred million high quality bases in less than ten hours
P
P
T T
Small Fragment Removal
T T
Small Fragment Removal
454 Library
T T
Library QC
Average fragment length Between 600 bp and 900 bp Lower size cut-off <10% below 350 bp
7 2/3rd dilution of tube 6
8 2/3rd dilution of tube 7
2.19 × 108
454技术简介
技术简介GS FLX系统超高通量测序技术原理GS FLX系统的测序原理是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来(图1)。
通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。
此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点.图1：GS FLX 高通量测序方法原理示意图PCR产物，BAC，cDNA，小分子RNA等等。
2）样品DNA打断：样品例如基因组DNA或者BAC等被打断成300－800 bp的片段；对于小分子的非编码RNA，这一步骤则不需要。
短的PCR产物则可以利用GS融合引物进行扩增后直接进行步骤4)的工作。
3）衔接子连接：借助一系列标准的分子生物学技术，将A和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DNA片段上。
接头也将在后继的纯化，扩增和测序步骤中用到。
图中仅仅显示了后续步骤中要用到的单链的DNA片段4）一条DNA片段＝一个磁珠：接头使成百上千条DNA片段结合到它们自己唯一的磁珠上，此磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响；整个DNA片段进行平行扩增。
5）一个磁珠＝一条读长：经过PCR扩增后，每个磁珠上的DNA片段拥有了成千上万个相同的拷贝。
经过富集以后，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到PicoTiterPlate板中供后继测序使用了。
6）数据读取和分析工具：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得10多万个读长，读取超过1亿个碱基信息。
GS FLX 系统提供三种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用：例如多达3 GB序列的重测序，对比已知参考序列进行的扩增产物差异分析，及 120 MB的从头测序工作等。
GS FLX系统具备的卓越性能：1.一个测序反应耗时10个小时，获得超过4亿个的碱基数据2.单个序列的读长更长，平均可达到350－500碱基左右3.通量更高，每个反应可以得到超过100万个序列读长，成本大大降低4.读长超过350 bp时，单一读长的准确性可以超过99.5%5.测序结果一致性超过99.99%6.技术成熟，提供完整的解决方案GS FLX系统的应用一、全基因组测序1.多达120 Mb的未知基因组的测序1)生成基因组结构概图2)研究DNA序列的组织，分布和信息3)基因筛查：寻找新基因，定位和功能4)和其他基因组进行比较研究2.全基因组进行从头鸟枪法测序，例如微生物基因，BAC和YAC克隆测序。
454测序原理
454测序原理
454测序原理是一种DNA组学技术，它可以同时完成很多DNA片段的测序，并生成大量高质量、相对低成本的核酸序列数据。
这一原理最初由Roche公司研发，属于生物信息学中的宏基因组学技术，主要用于检测和解析微生物群落和病毒等未知样本中的DNA序列，也可以用于基因组解析、转录组分析等。
454测序是根据“重测序”技术而设计的，针对每个测序模板，其原理包括样品准备、DNA扩增、碱基电泳和DNA信号检测4个步骤。
首先，将待测样品者分装到每个孔中，在每个孔中进行核酸扩增，即通过聚合酶链式反应（PCR）获得多份一样的片段，这是测序的基础；接着，将PCR产物加入到碱基电泳仪中，在特殊环境中，碱基电泳仪可以将成对碱基，即A、C、G、T分离成四条独立的带电性带，再通过电泳实现碱基的排序，并可以检测碱基的核苷酸序列；最后，将检测到的电泳信号转换成技术文件，即可以得到DNA序列了。
454测序原理的优势在于可以同时完成大量DNA序列的测序，并以此来获取很多有价值的基因组学数据。
它的灵敏性较高，可以检测极小的变异。
当检测单一基因时，454测序平台能够提供高精度的核酸序列，同时具有传统测序技术无法替代的扩增片段深度，这对后续的研究特别有用。
此外，454测序也可以检测非编码RNA，通过它可以比较不同物种的一部分序列的保守性，帮助研究者了解分子进化的过程，以及基因的结构及功能。
454测序原理
454测序原理
454测序原理是一种高通量的测序技术，其核心原理是基于PCR扩增和荧光方法来实现。
具体操作过程如下：
1.剪切DNA：
首先，将长串的DNA分子经过特殊的酶切或机械剪切成数百个碎片，每个碎片一般长度在400-800bp之间。
2.链使用PCR扩增：
接着，将这些碎片的末端上添加连接器，并以连接器为起始点进行链使用PCR扩增放大，此时每个DNA分子就被扩增成数百万份。
3.单一DNA分子构建：
将单一的DNA分子分别放置在微小的水滴中，每个水滴只包含单一的DNA分子，然后分别分配在大量的PCR反应的微孔里面。
4.序列测定：
进行PCR扩增反应，测序端读出荧光信号并记录，每次只测定一种碱基，通常是A、C、G、T四种碱基，记录每种碱基的发光强度和出现时间。
对于每个DNA分子，都可以得到许多碱基信号的序列信息。
5.组装成序列：
经过大量的这样的测定，就可以获得巨量的碱基信息，将这些碱基信息通过计算机进行组装，就可以得到原始的DNA序列信息。
454测序原理主要有以下优点：
1.高通量：可以一次测定数百万个DNA分子，速度快、高效。
2.灵敏性：对于低浓度的DNA样品也可以进行高质量的测序，检测灵敏度较高。
3.序列长度长：能够读取长度较长的DNA序列，最长可达1kb。
4.配对末端技术：采用配对末端技术读取，可使序列可靠度更高。
综上所述，454测序原理主要是通过PCR扩增和荧光方法来实现的。
它具有高通量、灵敏性强、序列长度长等优点，因而被广泛应用于基因组研究、转录组研究、单细胞测序、微生物组等方面。
454微生物分析
454高通量测序方法取适量污泥发酵混合液在10000rpm条件下离心5min，然后使用OMEGA 公司E.Z.N.A Soil DNA试剂盒抽提基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA合格后，利用引物27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和533R(5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’) 对细菌的16S rRNA的V1-V3区域扩增。
PCR 采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20μl反应体系包括：4 mL 5× FastPfu Buffer, 2.0 mL 2.5 mM dNTPs, 0.4 mL 前引物, 0.4 mL 反向引物，10.0 ng DNA 模板以及0.4 mL FastPfu Polymerase (TransStart FastPfu DNA Polymerase,TransGen). PCR扩增程序如下：先在95℃反应2min，然后进入扩增循环，每一次扩增循环分别在95℃，55 ℃和72℃温度下保持30s，共进行循环25次，最后在72℃保持5min，最后在10℃条件下5min褪火结束反应。
每个样品3个重复，将同一样品混合后用2%琼脂糖凝胶电泳，使用AXYGEN 公司的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，Tris_HCL洗脱；将已构建好的PCR产物文库参照电泳初步定量结果，，借助Promega公司的QuantiFluor™ -ST 荧光定量系统，用PicoGreen® dsDNA 定量试剂盒(PicoGreen® dsDNA Quantitation Reagent) 进行检测；获得标准曲线并对PCR产物文库定量，然后按每个样品的测序量比例混合，并使用Roche 指定的（Roche emPCRAmp-Lib_L Kit）制备EmPCR产物，在Roche Genome Sequencer FLX + 进行上机测序。
罗氏454焦磷酸测序技术
仔猪肠道菌群的形成
新生动物肠道菌群形成可以划分为以下几个阶段 [3,4,5,6]。
第一阶段:新生动物出生两周以内，肠道内的细菌定 植方式基本相同。结肠内首先出现杆菌和肠链球菌，随之 很快出现双歧杆菌并成为优势菌，这个时期肠道菌群的特 点是不稳定，容易发生变化。
第二阶段:出生后两周到断奶以前，动物在母乳喂养 下，肠道内细菌主要以厌氧菌为主，主要为双歧杆菌，肠 杆菌和链球菌数量较少。这个阶段的特点是肠道菌群容易 受食物的影响，食物的微小改变就可以引起肠道菌群发生 较大的变化。
肠道菌群的研究方法进展（分子生态学研究方法）
DNA 指纹图谱技术依据分子大小、核酸序列等特征的不同，将代 表微生物群落中各物种的 DNA 分子标记物在凝胶上进行电泳分离，使 代表不同物种的分子标记迁移到胶上的不同位置，最终得到的电泳图 谱用于显示群落的组成结构。DNA 指纹图谱的最大优点是方便、快速、 直观，常用于检测微生物群落结构的动态变化或比较不同群落之间的 结构差异。最常用的 DNA 指纹图谱技术包括变性梯度凝胶电泳 （Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）[10,11,12]和末端片段长 度多态性（Terminalrestriction fragment length polymorphism, T-RFLP） 等。
UniFrac 是一种通过计算系统发育树上序列的进化距离，比较不同微生物群 落结构差异的系统发育进化方法。 UniFrac方法在比较不同微生物群落结构的差 异时，不仅考虑物种的丰度，更考虑序列之间的进化距离。
参考文献
1. Zoetendal E, Koike S, Mackie R, et al. Molecular ecological analysis of the gastrointestinal microbiota: A review. J of Nutrition, 2004, 134:465-472.
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454生命科学公司所研发的新一代测序平台基于光纤微流体技术和包裹了待测DNA片段的乳化液滴技术（炸药中的表面活性剂来维持乳液的热稳定性）。
基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序（sequencing-by-synthesis）的先河。
GS FLX系统是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术：在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来 (见下图)。
通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。
此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。
454高通量测序方法原理示意图
优缺点：
1）454平台的突出优势是读长，每轮测序能产生100万个读长片段，读长可达到400-500bp；
2）通量为0.4-0.5Gb；
3）读出的片段较短，而且不能提供配对端点测序信息；
4）不需要任何克隆；但是这也造成了这一技术的一些缺陷：无克隆反应导致无法获得材料来覆盖序列缺口，而且在基因组测序完成过程中的一个重要部分就是补充低丰度区域。
应用：
包括基因组学的从头测序和重测序、小RNA的研究、转录图谱的分析以及染色体结构表观遗传学等
GS FLX系统的工作流程
GS FLX系统的流程概括起来，就是“一个片段= 一个磁珠= 一条读长（One fragment = One bead = One read）”。
1）样品输入并片段化：GS FLX系统支持各种不同来源的样品，包括基因组DNA、PCR产物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。
大的样品例如基因组DNA或者BAC等被打断成300－800 bp的片段；对于小分子的非编码RNA或者PCR扩增产物，这一步则不需要。
短的PCR产物则可以直接跳到步骤3)。
2）文库制备：借助一系列标准的分子生物学技术，将A和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DNA片段上。
接头也将用于后续的纯化，扩增和测序步骤。
具有A、B接头的单链DNA片段组成了样品文库。
3）一个DNA片段＝一个磁珠：单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上。
每一个磁珠携带了一个独特的单链DNA片段。
磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。
4）乳液PCR扩增：每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响。
整个片段文库的扩增平行进行。
对于每一个片段而言，扩增后产生了几百万个相同的拷贝。
随后，乳液混合物被打破，扩增的片段仍然结合在磁珠上。
5）一个磁珠＝一条读长：携带DNA的捕获磁珠随后放入PTP板中进行后继的测序。
PTP孔的直径（29um）只能容纳一个磁珠（20um）。
然后将PTP板放置在GS FLX中，测序开始。
放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。
如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。
这个焦磷酸在ATP硫酸化酶和萤光素酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将萤光素氧化成氧化萤光素，同时释放出光信号。
此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。
有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。
这也就是大名鼎鼎的焦磷酸测序。
6）数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息。
GS FLX 系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用：达400 MB的从头拼接和任何大小基因组的重测序。
GS FLX系统的准确率在99%以上。
其主要限制来自同聚物，也就是相同碱基的连续掺入，如AAA或GGG。
由于没有终止元件来阻止单个循环的连续掺入，同
聚物的长度就需要从信号强度中推断出来。
这个过程就可能产生误差。
因此，454测序平台的主要错误类型是插入-缺失，而不是替换。