赤魟软骨血管生成抑制因子的制备【开题报告】

开题报告

药学

赤魟软骨血管生成抑制因子的制备

一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义

作为拥有1.8万公里海岸线的国家，我国的渔业资源非常丰富，赤魟就是这丰富资源中的一种。

魟鱼[1] (Ray)俗称鯆鱼，草帽鱼，蒲扇鱼，黄貂鱼。英文名：Red stingray。它属暖温类底层鱼，属于脊椎动物门Verterata，软骨鱼纲Chondrichthyes，板鳃亚纲Elasmobranchii，鳐目(或魟目)Rajiformes，魟科Dasyatidae和燕魟科Myliobatidae。全世界共有六个科158种。赤魟主要分布于我们南海和东海，长江口咸谈水中亦有分布。浙江沿海拥有丰富的海洋资源，其中以赤魟（Dasyatis akajei）资源最为丰富。

魟软骨味尚佳，皮厚实，无血有光泽，含丰富的胶质，水发后烹制成“大扒鱼皮”，味道鲜美，是宴席上的珍品。此外，作为药用，其肉性味甘、咸平，无毒，具有健脾补气、滋补强身之功效。用其熬油，主治小儿疳积。尾毒的毒液是一种氨基酸和多肽类的蛋白质，其药性咸、寒，有小毒，对于中枢神经和心脏具有一定的效应，有清热消炎、化结、除癥之功效。尾刺研末入药，对治疗胃癌、食道癌、肺癌、乳腺炎、咽喉炎、疟疾、牙痛、魟鱼尾刺刺伤均有一定疗效。其肝除作为制作鱼肝油的原料外，煮食后能治夜盲症。

但是，国内外对赤魟的生物活性研究还处于起步阶段，其应用研究和应用基础几乎空白，资源量丰富、营养药用价值高的赤魟仅处于被人们日常食用的阶段。上文所述赤魟的药用价值大多都是对赤魟尾刺提取物、赤魟肝脏活性蛋白、赤魟软骨多糖或其软骨活性蛋白的研究。

如肖湘等对赤魟肝脏活性蛋白体外抗氧化作用的研究[2]，采用硫酸铵沉淀、Sephadex-G150柱层析的方法从赤魟肝脏分离活性蛋白，测定活性蛋白清除超氧阴离子自由基、羟自由基和抑制脂质过氧化作用，结果显示分离得到的三个蛋白峰均具有很强的抗氧化作用。

罗红宇等对赤魟软骨黏多糖的制备研究[3]，探索利用碱浸提和酶法去蛋白从赤魟

软骨中提取分离纯化黏多糖的技术,并对该多糖进行了含量测定。结果表明:当NaOH浓度为6% ,40℃提取6h ,利用中性蛋白酶在40 ℃下酶解7h ,三氯醋酸沉淀去蛋白,加入4倍体积的95 %乙醇沉淀多糖时,黏多糖提取率可达21 %以上,产品纯度约84. 53 %。

余新威等对赤魟软骨血管生成抑制因子的分离纯化进行研究[4]，通过正交实验确定了赤魟软骨组织抽提的最佳条件,抽提产率可达0.84%。丙酮分级沉淀对抽提产物进行粗分离,25～35%的丙酮分级产物的CAM血管生成抑制率达85%。优化离子交换层析、凝胶过滤、反相层析的条件,可进一步有效的获得高纯度的赤魟软骨血管生成抑制因子-I(DCAIF-I)。SDS-PAGE-考马斯亮蓝染色显示为一条带,分子量为62kDa。活性验证结果表明,DCAIF-I对胶原酶具有一定的抑制活性,抑制率为36.3% ,对CAM血管生成的抑制活性具有一定的剂量依赖关系。

相对赤魟尾刺来说，赤魟软骨的获得更加方便、经济。然而，笔者查阅大量的资料库却发现，目前国内对于方便易得的赤魟软骨一向关注甚少，有关赤魟软骨抗氧化肽研究的论文少之又少。

赤魟软骨是一种营养价值很高的蛋白质源。杨萍等对赤魟肌肉营养成分进行了细致的分析[5],发现赤魟肌肉的一般营养成分如下: 水分78.5%，粗蛋白20.5%,粗脂肪1.23%,总糖0.79%, 非蛋白氮含量为1072mg/100g ,占总氮的32.5%。可见，赤魟软骨中的蛋白质含量非常高。

抗氧化性多肽是生物活性肽的一种，通过减少氧自由基、羟自由基从而达到抗衰老的功能[6]。焦驼文等综述了酶解蛋白制备抗氧化多肽的研究现状[7]，认为酶水解法制备的抗氧化多肽具有螯合金属离子，能捕捉自由基，具有明显的抗氧化作用。

目前用于水产蛋白资源酶解利用的蛋白酶种类很多，根据其来源可分为植物，动物和微生物来源三类。来自植物的蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶等，其中以木瓜蛋白酶在水产蛋白资源酶解中应用最为广泛[8]。

因此,采用现代高科技手段研究赤魟软骨的抗氧化作用具有广阔的应用前景。本实验拟就木瓜蛋白酶酶解赤魟软骨蛋白制备抗氧化肽的工艺参数进行优化, 分离得到活性较高的抗氧化组分, 为魟鱼软骨抗氧化肽的开发提供了基础数据。

二、研究的基本内容，拟解决的主要问题：

本实验研究的基本内容是从赤魟软骨中提取出蛋白质，测定其提取率，并对提取物进行抗氧化活性测定，并通过改进的鸡胚绒毛尿囊膜技术对其软骨粗提蛋白、纯化

蛋白进行体外活性实验。比较30%和60%饱和浓度硫酸铵溶液提取的蛋白质在不同浓度下的清除DPPH自由基和羟自由基的能力，以及其还原力。其次通过比较得出抗氧化活性能力最强的实验组；羟自由基清除率、DPPH清除率与还原力三者之间相关性；以及赤魟软骨蛋白抗氧化活性的最灵敏的检测方法。

此实验中拟解决的主要问题是设计出合理的实验步骤，充分利用现有的实验仪器和实验条件，使能够在最大限度地提取蛋白质的同时，不破坏蛋白质的性质，保证实验顺利进行，并最终得到有效的实验数据。

三、研究步骤、方法及措施：

选择舟山资源丰富的赤魟为研究对象，取其软骨运用硫酸铵沉淀法和现代的分离技术（透析技术），通过溶解，沉淀，离心，测定等步骤，进行赤魟软骨蛋白质的制备和体外活性评价。课题组老师和实验室人员长期进行海洋动物的研究与开发，熟悉实验流程，对于动物蛋白的提取具有丰富的经验，同时实验室具有提取和抗氧化测试的条件，因此可以保证实验的顺利进行。

四、参考文献

[1]伍汉霖.中国有毒及药用鱼类新志[M].北京:中国农业出版社,2002:265.

[2]肖湘,王文刚,杨上才等.对赤魟肝脏活性蛋白体外抗氧化作用[J].食品科学,2009,30(1): 116-118

[3]罗红宇,高鹏,宋茹.赤魟软骨黏多糖的制备[J].中国海洋药物杂志,2008,24(4):14-17

[4]余新威,钱晓,王捷舒等.赤魟软骨血管生成抑制因子的分离纯化[J].海洋学报,30(1): 113-118

[5]杨萍,章超桦.赤魟肌肉的营养成分及鱼松保健食品的试制[J].水产科学,2002,21(3):8

[6]吴继卫,何海伦,路敬涛等.海洋生物蛋白的酶解及酶解产物的抗氧化活性[J].海洋科学,2005,29(3):76-80

[7]焦驼文,孔繁东,祖国仁等.酶解蛋白制备抗氧化多肽的研究现状与展望[J].中国酿

造,2007,3:5-7

[8]王龙,叶克难.水产蛋白资源的酶解利用研究现状与展望[J].食品科学,2006,27(12): 807-812

[9]罗红宇,余新威.赤魟生物活性物质的研究现状[J].中国海洋药物杂志,2007,26(1):54-57

[10]邱春江,陈慧.木瓜蛋白酶水解文蛤蛋白制备小分子肽及其抗氧化研究[J].食品科技,2008,3:180-182