液相色谱仪基础知识
最全的液相色谱知识（包括原理,维护,基础操作,处理方法）
最全的液相色谱知识（包括原理,维护,基础操作,处理方法）最全的液相色谱知识（包括原理，维护，基础操作，处理方法）L、基线漂移原因和解决方法1、柱温波动。
（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。
通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。
）解决方法：控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器图2、流动相不均匀。
（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。
）解决方法：使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。
流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。
3、流通池被污染或有气体解决方法：用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。
如有需要，可以用1N的硝酸。
（不要用盐酸）4、检测器出口阻塞。
（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）解决方法：取出阻塞物或换管子。
参考检测器手册更换流通池窗。
5、流动相配比不当或流速变化解决方法：更改配比或流速。
为避免问题可定期检查流动相组成及流速。
6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时解决方法：用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成解决方法：检查流动相的组成。
使用高品质的化学试剂及HPLC 级的溶剂8、样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。
解决方法：使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。
9、使用循环溶剂，但检测器未调整。
解决方法：重新设定基线。
当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。
10、检测器没有设定在最大吸收波长处。
解决方法：将波长调整至最大吸收波长处M、基线噪音（规则的）原因解决方法1、在流动相、检测器或泵中有空气解决方法：流动相脱气。
冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。
2、漏液解决方法：检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。
如有必要，更换泵密封。
液相色谱基础知识
原理： ☼ 原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电 导变化来测定电离物质含量。 导变化来测定电离物质含量。广泛应用于 离子色谱法。 离子色谱法。
☼ 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，
梯度洗脱。 梯度洗脱。 缺点：对温度变化敏感，每升高1℃, ℃,电导率增加 ☼ 缺点：对温度变化敏感，每升高 ℃,电导率增加 2%-2.5%。
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
☼鬼峰的出现
洗脱曲线
☺水/MeOH梯度 ODS ODS柱 1ml/min在 0~10Mins内 MeOH 0~100% 线性变化后 保持15Min
鬼峰
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
在微量分析和梯度洗脱时建议使用HPLC级溶剂和纯化水 级溶剂和纯化水 在微量分析和梯度洗脱时建议使用
0.001~9.999
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
柱塞和密封圈的关系
水 出口单 向阀 密封圈 吸液移动 柱塞杆 送液移动 入口单 向阀 泵头清洗流路 流动相
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
手动进样阀7725i原理
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
☺无在线脱气机应注意：
1 每天脱气 2 如使用氦脱气，对混合好的溶剂脱气时间不能过长。
液相色谱基础知识
梯度形式的选择
洗脱模式：高压梯度
低压梯度 用两台输液泵将两种流动相混合并进入系统 常压下用比例阀将流动相混合，单泵进入系统
☺线性梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成线性变化（增或减） ☺指数梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成指数关系（增或减） ☺折线梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间无规则变化
经典液相色谱知识点总结
经典液相色谱知识点总结液相色谱（Liquid Chromatography, LC）是一种以液相为驱动相，将待测样品在静态相中进行分离的色谱分析方法。
液相色谱在分离生化样品、药物、天然产物等化合物时得到了广泛的应用。
本文将系统总结液相色谱的知识点，包括原理、分类、仪器设备、色谱柱、检测方法等方面的内容。
一、原理液相色谱的原理基于化合物在静态相（色谱柱填料）和流动相（溶剂）之间的分配与分离过程。
待分析的化合物在流动相与静态相之间的分配系数不同，因此当待测样品溶液通过色谱柱时，根据不同化合物在静态相中的分配行为，可以实现化合物的分离。
在液相色谱中，流动相主要由溶剂和缓冲液组成，可以根据需要进行调整。
而静态相则是色谱柱填料，填料的选择对色谱分离效果至关重要。
填料的种类、粒径、表面性质等都会影响到分离效果。
二、分类根据静态相的不同，液相色谱可以分为几种常见的类型：1、反相色谱：静态相是疏水性填料，流动相是亲水性溶剂，被分离物质的极性与填料相反。
反相色谱对极性化合物具有较好的分离效果，因此在分析生化样品、药物等方面得到了广泛的应用。
2、离子交换色谱：静态相是带电离子交换树脂填料，可进行阴离子或阳离子的分离。
离子交换色谱适用于分析离子化合物，如蛋白质、核酸等。
3、尺寸排除色谱：静态相是孔径大小均一的凝胶填料，根据分子大小进行排除分离。
尺寸排除色谱适用于分析大分子化合物，如蛋白质、多糖等。
4、亲和色谱：通过生物亲和分离剂与化合物间的特异性结合实现分离，主要应用于生化分析领域。
5、扩展液相色谱：液相色谱的一种改良方法，通过使用超高性能色谱柱和压力增加装置来提高分辨率。
三、仪器设备液相色谱仪器主要包括流动相输送系统、样品进样装置、色谱柱和检测器等部分。
1、流动相输送系统：用于输送流动相的高性能泵，包括梯度泵和等速泵两种，可实现不同流动相梯度的传送。
2、样品进样装置：通常采用自动进样系统，可实现自动进样、样品预处理等功能。
液相色谱基础
色谱的发明人
俄国科学家：M. S. Tswett 正式命名“色谱”的文献
经典液相色谱
色谱起源
色素 玻璃柱
石油醚 碳酸钙颗粒
二、色谱法的定义和分类
色谱法的定义：
色谱法又称色层法或层析法，是一种利用不 同溶质(样品)与固定相和流动相之间的作用力(分 配、吸附、离子交换等)的差别，当两相做相对移 动时，各溶质在两相间进行多次“平衡”，使各 溶质达到相互分离的方法。
恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相 粘度和柱渗透无关。
恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力 变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵 就能提供恒定的流量。
泵的使用和维护注意事项
①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任 何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀 ，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。
固定相：在色谱分离中固定不动、对样品产生保 留的一相。
流动相：在层析过程中推动固定相上的物质向一 定方向移动的液体或气体。
色谱法的分类 根据流动相的状态将色谱法分成四大类。
表1 色谱法以流动相种类的分类
色谱类型
流动相
主要分析对象
气相色谱法
气体
挥发性有机化合物
液相色谱法
液体
溶于水或有机溶剂的各 种物质
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
速度快——通常分析一个样品在15-30 min。 分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳 分离效果。 柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的 化合物。 样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被 破坏，可以收集单一组分或做制备。
HPLC的仪器配置
数据处理系统
液相基本术语及操作
液相色谱检测1 仪器的基本常识及术语1.1 仪器结构：液相色谱仪主要包括泵、进样器、色谱柱、检测器；1.2 仪器分类：液相色谱仪属于精密仪器中的色谱仪器；按照分为离机制，吸附、分配、离子交换、亲和色谱，体积排阻色谱；按照流动相与固定相的极性，分为正相色谱法和反相色谱法；1.2.2 高效液相色谱法的应用范围：高效液相色谱法适用于高沸点不易挥发、受热不稳定易分解、分子量大的，不同极性的有机化合物，生物活性物质和多种天然产物，合成的和天然的高分子化合物等。
1.3 仪器检定：液相色谱仪检定周期为1年，在两次检定间期内进行一次期间核查，也可以根据情况增加核查次数；1.4 维护保养：对于液相维护方式主要是周维护和日维护，其中周维护包括联机系统及中工作站软件维护、数据库整理备份、检测器自检、维护单向阀、溶剂砂芯滤头、进样器、电机泵检查维护、溶剂瓶清洗等；日维护包括环境温度、环境湿度、色谱柱温度、压力流速、进样口是否洁净、进液处的砂芯过滤头是否洁净、流动相交换时是否有沉淀；1.5色谱法的常用基本术语基线：在色谱操作条件下,没有被测组分通过鉴定器时,记录器所记录的检测器噪声随时间变化图线称为基线.死时间,保留时间及校正保留时间:从进样到惰性气体峰出现极大值的时间称为死时间,以td表示.从进样到出现色谱峰最高值所需的时间称保留时间,以tr表示.保留时间与死时间之差称校正保留时间.以Vd表示.死体积,保留体积与校正保留体积:死时间与载气平均流速的乘积称为死体积,以Vd表示,载气平均流速以Fc表示,Vd=tdxFc.保留时间与载气平均流速的乘积称保留体积,以Vr表示,Vr=trxFc峰面积：流出曲线(色谱峰)与基线构成之面积称峰面积,用A表示.拖尾因子：是反映峰对称性的指标，计算公式：拖尾因子 T＝W0.05h/2d1（其中W0.05h为5%峰高处的峰宽，d1为峰顶点至峰前沿之间的距离）。
峰高与半峰宽:由色谱峰的浓度极大点向时间座标引垂线与基线相交点间的高度称为峰高,一般以h表示.色谱峰高一半处的宽为半峰宽,一般以 x1/2表示；1.7 色谱检测的特性（1）灵敏度高；（2）线性范围宽；（3）分离度与柱效、选择因子、容量因子、分析时间的关系：（4）分离度与柱效的平方根成正比，选择因子一定时，增加柱效；（5）分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化：一般通过改变固定相和流动相的性质和组成或降低柱温，可增大选择因子；（6）增大选择因子的最有效方法是选择合适的固定液。
液相培训内容
L600系列液相色谱仪培训内容一、基本原理色谱技术是利用待测组分与流动相、固定相之间的作用（分配系数）不同，从而实现分离的过程。
先解释2个名词：1、流动相：顾名思义是在整个系统中处于流动状态的流体。
流动相是液体的叫液相（就是我们今天要学习的这一款仪器），起到运输样品和参与组分分离的作用。
流动相是气体的叫气相，只起运输样品的作用。
2、固定相：是静止不动的一相，装填或涂布于色谱柱内，参与组分分离。
“分离”是色谱区别于光谱仪器最大的特点和作用，一般的光谱仪器只能通过波长等特性从混合物中去选择待测物，一般一次只能检测一种物质；而色谱能够将复杂的混合物逐一分离成单一组分，逐个检测，可以实现多种组分的同时分析，比如我们熟悉的色素，苏丹红1、2、3、4，就可以一针进样同时检测。
二、仪器结构及各部分的使用要点液相色谱一般由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统构成。
下面我们按照这个组成的顺序逐一讲解每一部分的使用要点。
1、输液系统输液系统顾名思义就是用来输送流动相的部分，它包含了“输”和“液”两部分，“输”的部分就是指高压输液泵，它就像我们人体的心脏一样，是一切动力的源头，没有它液体不可能流动。
“液”就是指流动相了，它就像我们人体的血液一样，在泵给与的动力下，运送到整个系统。
下面分别讲解这两部分的使用方法和注意事项。
（1）流动相a、流动相类型：我们一般使用的流动相有三种类型，第一种是纯的有机溶剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等，其中甲醇是最常用的，通常用它来冲洗平衡系统，C18柱在工作完后需要保存在纯甲醇中。
第二种是检测样品用的流动相，根据标准或方法来配置，通常含有缓冲盐。
第三种是10%-20%的甲醇水溶液（比例并不需要非常的准确），它是用于纯有机溶剂与含有缓冲盐的流动相之间的过渡冲洗液，因为缓冲盐溶于水但不溶于有机溶剂，如果不过渡直接更换，就会使缓冲盐在有机溶剂中析出成结晶盐，造成系统的堵塞，尤其是色谱柱，这是不可逆的损坏。
最全的液相色谱知识 整理
最全的液相色谱知识（包括原理，维护，基础操作，处理方法）流动相a、流动相对样品具有一定的溶解能力b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
c、流动相的黏度要尽量小d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。
1.流动相必须用HPLC级的试剂.2.流动相过滤后要用超声波脱气.脱气后应该恢复到湿温后使用.3.长时间不使用仪器,应该将柱子取下用堵头封好保存.4.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器.流动相对样品有适当的溶解度，但不与样品发生化学反应，也不与固定液互溶；流动相的纯度要高（至少分析纯）、粘度要小，以免带进杂质和组分在流动相中扩散系数下降；流动相应与所用检测器相匹配，不应对组分检测产生干扰作用。
对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。
当选用最佳流速时，分析时间可能延长。
可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。
因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染。
种被污染的溶剂如用于HPLC 系统，可能造成柱效降低。
贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。
磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存。
如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前应重新滤过。
容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。
因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子无此现象。
一、为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性请按照以下注意事项操作：1、防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。
液相色谱知识总结
• :电源电压为220±10V，频率为
50±0.5Hz·最佳配置稳压器(2kw以上)
• 最佳 试验室有专线，同一线路上不可有大
旳用电机械干扰
• 电源为三相电源，接地必须良好(此条非常
主要)，泵，检测器，工作站，电
• 脑接在同一种合格旳接线板上 (温分每台
仪器带一专用接线板)
示差折光检测器
• 示差折光检测器是根据不同物质具有不同折射率
来进行组分检测旳。但凡具有与流动相折射率不 同旳组分，均能够使用这种 检测器。假如流动相 选择合适，能够检测全部旳样品组分。示差折光 检测器旳优点是通用性强，操作简便；缺陷是敏 捷度低，最小检出限约为10-7g/ml，不能做痕量 分析。另外，因为洗脱液构成旳变化会使折射率 变化很大，所以，这种检测器也不合用于梯度洗 脱。
常见问题及处理
• 1 压力 • 2 基线不稳 • 3 谱图重现性不好 • 4 凝胶负峰旳产生
液相色谱知识总结
液相色谱旳工作原理
• 高效液相色谱（high performance liquid
chromatography ）是色谱法旳一种分 支， 分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中旳各组分经过固定相时，因为与 固定相(stationary phase)发生作用（吸附、 分配、离子吸引、排阻、亲和）旳大小、 强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从 而先后从固定相中流出。
荧光检测器
• 在其他条件一定旳情况下，荧光强度与物质旳浓度成正比。
许多有机化合物具有天然荧光活性，另外，有些化合物能 够利用柱后反应法或柱前反应法加入荧光化试剂，使其转 化为具有荧光活性旳衍生物。在紫外光激发下，荧光活性 物质产生荧光，由光电倍增管转变为电信号。荧光检测器 是一种选择性检测器，它适合于稠环芳烃、氨基酸、胺类、 维生素、蛋白质等荧光物质旳测定。这种检测器敏捷度非 常高，检出限达10-12—10-13g/ml，比紫外检测器高2—3 个数量级，适合于痕量分析。而且能够用于梯度洗脱。其 缺陷是合用范围有一定旳不足。
(干货)液相色谱基础知识大全
一、基本原理高效液相色谱（HPLC）法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。
高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。
在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。
高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。
二、高效液相色谱分析原理（1）、高效液相色谱分析的流程：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。
被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。
废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。
这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。
（2）、高效液相色谱的分离过程：同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。
分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。
分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。
组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。
若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。
其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。
液相色谱基本知识
液相色谱基本知识一、液相色谱原理液相色谱是一种基于不同物质在固定相和流动相之间的分配平衡原理的分离技术。
当流动相流经固定相时，不同物质在固定相中的保留时间不同，从而实现分离。
通过选择合适的固定相和流动相，以及调整流动相的速度，可以实现对不同物质的分离和纯化。
二、液相色谱种类根据固定相的不同，液相色谱可以分为硅胶柱色谱、氧化铝柱色谱、活性炭柱色谱等多种类型。
根据流动相的不同，液相色谱可以分为正相色谱和反相色谱。
正相色谱中，固定相的极性大于流动相的极性；反相色谱中，固定相的极性小于流动相的极性。
三、液相色谱操作步骤1. 样品准备：将待分离的样品进行适当处理，以便于后续的分离和纯化。
2. 装柱：将固定相装入色谱柱中，确保固定相填充均匀。
3. 平衡：在流动相中平衡色谱柱，使固定相和流动相充分接触。
4. 进样：将待分离的样品加入色谱柱，开始分离过程。
5. 洗脱：使用流动相洗脱样品中的各组分，并收集洗脱液。
6. 检测：对收集到的洗脱液进行检测，确定各组分的含量和纯度。
四、液相色谱应用领域液相色谱在多个领域有着广泛的应用，如医药、生物、环保、食品等。
在医药领域，液相色谱可用于药物的分离和纯化；在生物领域，液相色谱可用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化；在环保领域，液相色谱可用于污染物的分离和检测；在食品领域，液相色谱可用于食品添加剂、农药残留等的检测。
五、液相色谱优缺点1. 优点：液相色谱具有分离效果好、分离速度快、适用范围广等优点。
同时，液相色谱还可以与质谱等检测手段联用，提高检测灵敏度和准确性。
2. 缺点：液相色谱需要使用有机溶剂作为流动相，可能对环境和人体健康造成一定影响。
此外，液相色谱的设备成本较高，操作复杂度也相对较高。
六、液相色谱仪器设备液相色谱常用的仪器设备包括高效液相色谱仪、紫外可见分光光度计、质谱仪等。
其中，高效液相色谱仪是实现液相色谱分离的核心设备，它包括泵、进样器、色谱柱、检测器等部分。
液相色谱基础
检测器
二极管阵列检测器（SPD－M10AVP）
二十一世纪标准紫外检测器
色谱定性依据：
保留时间 常规紫外检测器
峰纯度
二极管阵列检测器
检测器
二极管阵列检测器的优点：
1）采集三维谱图 2）峰纯度检验 3）光谱库检索 4）可以发现单波长检测时未测到的峰
气泡 气泡对测定的影响：
1）柱流量不准 2）检测器基线波动 脱气注意点： 1）每天脱气(无在线脱气器时） 2）混合溶剂脱气时间不能过长
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输液泵
送液方式： 恒流控制 恒压控制
VP系列输液泵：LC-10ADvp泵和LC-10ATvp泵 D泵：并联微体积往复式泵 T泵：串联式往复泵
岛津VP系列输液泵
反相液相色谱 流动相极性大于固定相极性 样品的保留顺序是非极性组分保留值大，极性组分先流出。 正相液相色谱 流动相极性小于固定相极性
溶剂前处理
过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。
溶剂前处理
脱气 目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的
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目的
单元
流速范围 特性和应用
分析
LC-10ADVP
0.001-9.999 超低脉动，适于 半微量LC 和 LC-MS
LC-10ATVP 0.001-9.999 非凡的耐用性， 适于常量分析
*所有单元都既可做高压梯度又可做低压梯度
进样器
自动进样器 手动进样器 原理：（六通阀） 注入方式： 1）全量注入 2）部分注入
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手动进样器的原理图
HPLC(液相色谱)常识及疑难详解(附实际操作图解)
1 液相色谱基础知识1.1 液相色谱名词术语Mobile phase：流动相，在色谱柱中存在着相对运动的两相，一相为固定相，一相为流动相。
流动相是指在色谱过程中载带样品（组分）向前移动的那一相。
Stationary phase：固定相，柱色谱或平板色谱中既起分离作用又不移动的那一相。
Gradient elution: 梯度洗脱,一个分析周期中，按一定程序不断改变流动相的浓度配比, 使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。
Detection wavelength：检测波长，retention time：保留时间，被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间Peak:峰Peak Base：峰基线，经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴Peak Height：峰高，色谱峰顶点至峰底的距离。
Peak Width：峰宽，色谱峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点间的距离Peak Width at Half Height：半峰高宽Peak Area：峰面积Tailing Peak: 后沿较前沿平缓的不对称峰Leading Peak:前沿较后沿平缓的不对称峰Ghost Peak: 假峰，并非由试样所产生的峰Baseline Drift:基线漂移Baseline Noise:基线噪音Band Broadening:组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象. 1.2 流动相1.2.1 流动相类型正相液相色谱流动相：一般正相色谱固定相极性大于流动相极性，采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等），极性小的组分先出柱。
反相液相色谱流动相：一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
最全的液相色谱知识 整理要点
最全的液相色谱知识（包括原理，维护，基础操作，处理方法）流动相a、流动相对样品具有一定的溶解能力b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
c、流动相的黏度要尽量小d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。
1.流动相必须用HPLC级的试剂.2.流动相过滤后要用超声波脱气.脱气后应该恢复到湿温后使用.3.长时间不使用仪器,应该将柱子取下用堵头封好保存.4.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器.流动相对样品有适当的溶解度，但不与样品发生化学反应，也不与固定液互溶；流动相的纯度要高（至少分析纯）、粘度要小，以免带进杂质和组分在流动相中扩散系数下降；流动相应与所用检测器相匹配，不应对组分检测产生干扰作用。
对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。
当选用最佳流速时，分析时间可能延长。
可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。
因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染。
种被污染的溶剂如用于HPLC 系统，可能造成柱效降低。
贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。
磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存。
如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前应重新滤过。
容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。
因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子无此现象。
一、为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性请按照以下注意事项操作：1、防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。
液相色谱基础知识
梯度洗脱形式： 梯度洗脱形式：
线性梯度：在梯度洗脱时，流动相强度的变化和时间成线性比例 指数梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈指数关系 折线梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈跳跃关系
梯度洗脱形式的选择
液相色谱基础知识
梯度洗脱： 梯度洗脱：
优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和 提高分离精度，提高检测器的灵敏度
液相色谱基础知识
液相色谱基础知识
液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法 液相色谱：
适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的 适用于高沸点、大分子、 分析 流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用
气相色谱： 气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法
适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析 适用于沸点较低、 流动相只起运载样品分子的能力
注意事项： 注意事项：
溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差 梯度混合的溶剂互溶性要好 梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器 （如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动 相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）
样 品
1.
处
理
使用适宜的流动相溶解样品 在溶剂选择的时候，应注意以下原则： -- 减少溶剂峰，尤其是不可使用组分峰靠近溶剂峰 的流动相 -- 保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统 中尤其在色谱柱中产生沉淀
溶 剂 等 级
分析纯级(实线）和 HPLC 级溶剂（虚线）的吸光度比较
甲醇
乙睛
正己烷
General Maintenance and Troubleshooting
溶 剂 等 级
缓冲液的使用
使用前必须过滤 以免造成腐蚀、 使用后一定要对柱子进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨损及 阻塞:首先用纯水冲洗 首先用纯水冲洗30-60min（0.1-0.5ml/min），再用 ），再用 阻塞 首先用纯水冲洗 （ ）， 甲醇冲洗30min(0.1-0.5ml/min) 甲醇冲洗 易受到细菌和霉菌的影响
液相色谱法基本知识
第一节 概 述
等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。 ③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利
于色谱分离条件的选择。 （3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质在液
相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在 气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而 且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺 乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际 应用中，这两种色谱技术是互相补充的。
组分的差速迁移，从而实现分离。分配系数（K）或分配比
（k）小的组分，保留值小，先流出柱。然而与气相色谱法 不同的是，流动相的种类对分配系数有较大的影响。
21
第四节 液—固色谱法
（4）应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时，溶 剂要不吸收紫外光。
（5）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜 等。
在液-固色谱中，选择流动相的基本原则是 极性大的试 样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。
为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多种 不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分的分配比k值 范围很广则使用梯度洗脱。
3
第一节 概 述
的70 ~ 80%。 （2）液相色谱能完成难度较高的分离工作
因为： ①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡
过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相 互作用。而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样 品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同 比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选 择性。 ②液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱。
8
第二节 高效液相色谱仪
液相色谱基础知识
紫外可见检测器
紫外可见检测器
原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 定量基础：Lambert-Beer定律，A＝KCL 优点：1）对温度和流速变化不敏感
2）可用于梯度分析 缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质
紫外可见检测器
光栅
l
样品池
Ein
Eout
光电管
D2 / W 灯
Ein
Ein
参比池
返回
流动相注意点
离子对试剂的使用 具有缓冲盐流动相的使用 分析结束及开
始 流动相平衡 加快平衡时间 异丙醇的使用
LC检测器
紫外可见检测器（UV/VIS） 二极管阵列检测器（PDA） 示差检测器（RID） 电导检测器（CDD） 荧光检测器（RF） 电化学检测器（L-ECD） 质谱检测器（MS） 蒸发光散射检测器（ELSD）
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流路中形成气泡引起的问题
改变保留时间和峰面积
流动相中形成气泡对液流的不良影响 泵中形成气泡使液流波动
峰变形
柱中气泡形成和累积使流动相绕流
尖峰或锯齿状噪声
检测池中气泡形成和累积产生基线噪声
输液泵
输液泵类型： 注射泵 柱塞往复泵 隔膜泵
输液泵控制方式：
恒流控制 恒压控制
柱塞往复泵
马达和凸轮
液相色谱基础知识
一、色谱起源
石油醚
色素
碳酸钙颗粒
色谱
组分
HPLC的分离类型
正相色谱 (NP-HPLC) 反相色谱 (RP-HPLC) 反相离子对色谱 (RPIC) 离子交换色谱 (IEC) 空间排阻色谱 (SEC) 手性化合物分离模式(Chiral separation
mode)
液相色谱基础知识
第一部分原理和分类一、色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。
又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLC)。
也称现代液相色谱。
二、色谱法分类按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。
气相色谱法适用于分离挥发性化合物。
GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。
液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。
LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。
此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。
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四、液相色谱工作原理
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五、液相色谱用途及应用领域
制药：从药物研制到开发、制造和QA/QC，为药物制造提供支持。 石油化工：液相色谱应用包括添加剂化验、精细和专用化学分析以及使
用带有有机溶剂或水性溶剂的大小排查色谱检定聚合物。 蛋白质：识别、隔离和净化细胞和体液中的蛋白质。 环境：分析包括非挥发性杀虫剂、除草剂、多核芳香碳氢化合物及不适
三、液相色谱基本构造
4、蒸发光散射检测器（ELSD） 流动相
是利用样品组分雾化和蒸发形成 固体微粒后对光的散射现象来 检测色谱流出组分的方法（可 检测任何挥发性低于流动相的 样品。碳水化合物，类脂化合 物，表面活性剂，聚合物，药 物，氨基酸和天然产物。）
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雾化
载气 D0
蒸发
散射
两相中有一相是固定的,叫作固定相,有一 相是流动的,称为流动相流动相又叫洗脱剂， 溶剂。
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一、色谱基础知识
色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而 进行分离的技术。
流动相：携带样品流过整个系统的流体。 固定相：静止不动的一相，色谱柱。 色谱是一种分离技术。 色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离 和定量。
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三、液相色谱基本构造
主要组成部分如下： 1. 进样系统 2. 输液系统 3. 分离系统 4. 检测系统 5. 数据处理系统
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三、液相色谱基本构造
1.进样系统： 自动进样系统（是否带温控） 手动进样系统
核心部件： 六通阀
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三、液相色谱基本构造
三、液相色谱基本构造
2.输液系统 流路—单泵、双泵、三元泵、四元泵、
多泵 压力—低压、中压、高压、超高压 控制方式—恒流、恒压 流动相—等度、梯度 混合方式—低压、高压 流量—分析泵、半制备泵、制备泵 材质—金属泵、非金属泵（peek)
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三、液相色谱基本构造
泵系统为输液系统中最为核心部分，也是 整个液相色谱系统中最为核心的部分。
关于泵系统中等度、梯度、高压、低压、 二元、四元将做主要介绍。
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三、液相色谱基本构造
等度分析：针对单一样品、或者简单 样品采用等度分析。示意图如下
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三、液相色谱基本构造
梯度分析：对于复杂样品，一般采用梯度分析，且 必须是二元以上的泵系统。示意图如下：
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新员工培训（液相色谱基础知识）
上海仪先仪器有限公司 仪先国际贸易有限公司 上海力晶科学仪器有限公司
陆加金 2013年9月
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内容提要
一、色谱基础知识 二、液相色谱概述 三、液相色谱基本构造 四、液相色谱基本工作原理 五、液相色谱的用途及应用领域
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一、色谱基础知识
D
光源
光电倍增管
蒸发光散射检测原理
三、液相色谱基本构造
ELSD的原理:
检测器的 响应值仅与光束 中溶质颗粒的大 小和数量有关。 而与溶质的化学 性质无关。
溶剂的蒸发
雾化
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检测
三、液相色谱基本构造
5、其他检测器
Refractive index detectors（RI，示差检测器） Mass spectrometric detectors（Ms，质谱检测器） CAD detectors（CAD，电喷雾检测器） Electrochemical detecrors（ECD，电化学检测器）
液相色谱常规分析的柱温在20-60度。 不同温度对样品的保留时间有很大的影响。 柱温箱的优点： 分析结果重现性好 提高柱效 降低柱压 保证检测稳定性
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三、液相色谱基本构造
4.检测系统 灵敏度分级 ppm级 per parts of million ppb级 per parts of billion ppt级 per parts of trillion 如：浓度及浓度换算单位 1ppm即：mg/L 1ppb即：ug/L 1ppt即：ng/L
色谱法最早是由俄国植物 学家茨维特在1906年研究用碳 酸钙分离植物色素时发现的， 色谱法(Chromatography)因之 得名。
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一、色谱基础知识
色谱法是利用混合物中各组份在不同的两 相中溶解,分配,吸附等化学作用性能的差异, 当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复 多次受到上述各作用力而达到相互分离。
1ppm=1000ppb;1ppb=1000ppt
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三、液相色谱基本构造
1、紫外-可见光检测器（UV）
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三、液相色谱基本构造
2、二极管阵列检测器（DAD）
用光电二极管取代了是传统 的光电倍增管，在一次色谱操作 中可同时获得多波长的吸光度， 并且可以采用现代微机技术Байду номын сангаас各 组份的保留时间、吸收波长和吸 光度汇合一起，绘制三维谱图， 提供既定量又定性的色谱信息。
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3、荧光检测器（FLD）
高灵敏度：10-12～10-13g/mL; 高选择性：对多环芳烃，维 生素B、黄曲霉素、卟啉类化合 物、农药、药物、氨基酸、甾 类化合物等有响应对温度和流 动相的流速变化不敏感 所需试样少，适合恒量分析
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三、液相色谱基本构造
3.分离系统 3.1色谱柱 色谱柱是HPLC分离系统的关键！ 色谱柱分类：可根据柱管、类型、规格大小、填料、分离类型进行分类。 色谱柱标签的识别：
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三、液相色谱基本构造
3.2 柱温箱 柱温箱的作用：
控温系统大多数并不是HPLC的必须备件，凝胶系统一般是要求控温的， 采用示差检测最好配置控温箱，离子色谱也同样。有些仪器除了加热的 控温系统外，还自带低温冰箱。
������
适用于高沸点、大分子、强极性和热稳
定性差的化合物的分析。������
流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重 作用。
气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法。
适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物 的分析。
流动相只起运载样品分子的能力。
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二、液相色谱概述
高效液相色谱 -HPLC (High Performance Liquid Chromatography ) -是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能
三、液相色谱基本构造
高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入。 低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用
高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。（混合前高压与混合 后高压）
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三、液相色谱基本构造
二元梯度---需2个泵-----高压梯度 四元梯度----需比例阀一个泵--低压梯度
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一、色谱基础知识
按流动相的物态分: 气相色谱(Gas Chromatography, GC) 用气体作为流动相(又叫载气) 液相色谱(Liquid Chromatography, LC) 用液体作为流动相(又叫洗脱剂)
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二、液相色谱概述
液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法。
分离手段: ������ 高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测
器… -广泛应用于各个领域: ������ 医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业… -无论在技术上,理论上,还是在应用上仍有较大的发展
空间
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二、液相色谱概述
超高效液相色谱 –UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography ) –是区别于HPLC的液相色谱新领域 –基于小颗粒填料和LC原理的一种创新技术 –实现超高分离度、灵敏度、分析速度
合气相色谱的其它化合物。 食品安全：食品安全分析包括检测农产品和食品中的添加剂、残留物、
杂质和毒素。 法律医学：用于药物筛选和毒理学研究法医分析。 国土安全：检测、识别、确认生物和化学战争制剂及有毒的工业化合物
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六通阀原理示意图 取样时，流动相
直接进柱，进样口与定 量管连接，样品充满定 量管后，多余样品从6 流出。
进样时，泵将流动 相压入定量管，将样品 全部进入色谱柱分析。
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三、液相色谱基本构造
进样前，进样，进样后3个过程示意图
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三、液相色谱基本构造
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