基因表达载体的构建_1741860651.
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构建基因表达载体的流程
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②载体选择与准备：根据表达系统（细菌、酵母、哺乳动物细胞等）和目的蛋白特性，选择合适的表达载体，如pET系列（原核）、pYES2（酵母）、pcDNA3.1（哺乳动物）。
载体需预先线性化或具有特定限制酶切位点。
③酶切与连接：使用限制性内切酶对目的基因片段和载体分别进行酶切，以产生相匹配的黏性末端或平末端。
之后，通过T4 DNA连接酶将目的基因片段连接到载体上。
④转化与筛选：将连接产物转入相应的宿主细胞（如大肠杆菌DH5α），通过热激、电击等方法促进细胞吸收DNA。
随后在含有抗生素的选择培养基上培养，筛选出含重组载体的阳性克隆。
⑤验证与测序：挑取阳性克隆，通过PCR、酶切分析或直接测序等方法验证目的基因是否正确插入载体，以及阅读框是否正确。
⑥表达验证：将验证后的重组载体转入最终的表达宿主细胞中，诱导表达目标蛋白，通过SDS-PAGE、Western Blot等方法检测蛋白的表达效率及特性。
1.2-2基因表达载体的构建(共15张PPT)【优秀课件】
1.2-2基因表达载体的构建(共15张PPT )【优 秀课件 】
1.日本那些再现曲水宴的表演，有着 不少“中 国元素”，但是 由于现 代年轻 人对古 代中国 文化了 解甚少 ，并不 知道哪 些元素 来自中 国。 2.本着保证校车安全的原则，公安机 关将会 同教育 行政等 部门对 校车驾 驶人进 行逐一 审查， 坚决清 退不符 合安全 规定的 校车驾 驶人。 3.山寨文化是一种平民文化、草根文 化，自 然有其 存在的 意义和 价值， 但山寨 产品的 泛滥则 是中国 知识产 权意识 不足的 揭露与 讽刺。
谢谢观赏 4.神舟7号宇宙飞船载着三位航天英雄胜利返回地球，这艘宇宙飞船是我们国家自行研制的，每一个中国人不能不为之骄傲。 5.这家工厂虽然规模不大，但曾两次 荣获省 科学大 会奖， 三次被 授予省 优质产 品称号 ，产品 远销全 国各地 和东南 亚地区 。 6.杭州湾跨海大桥是一座由我国自行 建造、 自行设 计、自 行管理 、自行 投资的 特大型 交通基 础设施 ，是我 国跨海 大桥建 设史上 的一个 重要里 程碑。 7、为防止东南亚地区发生的禽流感 传入我 国，国 家质检 总局和 农业部 今天联 合发出 通知， 自即日 暂行禁 止进口 来自疫 区的禽 类及其 产品。
基因工程的基本操作程序P8
目的基因的获取 方法
目的基因的获取可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工 的方法合成。1.从基因中获取2.利用PCR
技术扩增目 的基因
3.化学方法直
接人工合成
第二步：基因表达载体的构建（核心步骤）
1.基因表达载体构建的
使目的基因在受体细胞中 稳定存在 ，并且可以遗传给下一代 使目的基因能够___表_达____和 发挥作用 。
1.下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是（ C ）
1.日本那些再现曲水宴的表演，有着 不少“中 国元素”，但是 由于现 代年轻 人对古 代中国 文化了 解甚少 ，并不 知道哪 些元素 来自中 国。 2.本着保证校车安全的原则，公安机 关将会 同教育 行政等 部门对 校车驾 驶人进 行逐一 审查， 坚决清 退不符 合安全 规定的 校车驾 驶人。 3.山寨文化是一种平民文化、草根文 化，自 然有其 存在的 意义和 价值， 但山寨 产品的 泛滥则 是中国 知识产 权意识 不足的 揭露与 讽刺。
谢谢观赏 4.神舟7号宇宙飞船载着三位航天英雄胜利返回地球，这艘宇宙飞船是我们国家自行研制的，每一个中国人不能不为之骄傲。 5.这家工厂虽然规模不大，但曾两次 荣获省 科学大 会奖， 三次被 授予省 优质产 品称号 ，产品 远销全 国各地 和东南 亚地区 。 6.杭州湾跨海大桥是一座由我国自行 建造、 自行设 计、自 行管理 、自行 投资的 特大型 交通基 础设施 ，是我 国跨海 大桥建 设史上 的一个 重要里 程碑。 7、为防止东南亚地区发生的禽流感 传入我 国，国 家质检 总局和 农业部 今天联 合发出 通知， 自即日 暂行禁 止进口 来自疫 区的禽 类及其 产品。
基因工程的基本操作程序P8
目的基因的获取 方法
目的基因的获取可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工 的方法合成。1.从基因中获取2.利用PCR
技术扩增目 的基因
3.化学方法直
接人工合成
第二步：基因表达载体的构建（核心步骤）
1.基因表达载体构建的
使目的基因在受体细胞中 稳定存在 ，并且可以遗传给下一代 使目的基因能够___表_达____和 发挥作用 。
1.下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是（ C ）
基因表达载体构建优秀课件
（一 ）基因表达载体的构建
1 基因工程操作中，构建基因表达载体之目的 是什么？
确保目的基因在受体细胞中稳定存在、 复制、遗传和表达，使其发挥作用。
2 请你定义：基因表达载体构建之含义？
将目的基因、启动子和终止子科学按装 在经修饰和改造完备的载体之上。
3 基因表达载体之基本组成是什么？
（1）结构基因——即提取的目的基因核苷酸序列，负责 编码目标蛋白质。
农杆菌
农杆菌转化法示意图
农杆菌
T—DNA Ti质粒
EcoRI酶
核—DNA 目 标
目标细胞
DNA 重组
侵染 转化 转基因植物
三 将目的基因导入受体细胞
基因导入受体细胞的标志是什么？
1目的基因与载体在受体细胞共同复制、遗 传和表达。或目的基因插入细胞染色体上DNA分 子之中，随同受体细胞DNA分子复制、遗传和表 达。
2 实际上外源目的基因变成了受体细胞的一部 分，这种现象叫做转化。
2 目的基因导入受体细胞遵循的基本原理是什么？ 通常借鉴细菌或病毒侵染细胞和寄生之途径。
基因表达载体构建优秀课件
4 从苏云金芽孢杆菌细胞DNA分子中提取得到 Bt毒蛋白基因能否直接进入普通棉细胞中？ 如果把目的基因人工注射到普通棉细胞中， 那么该基因在棉细胞中会稳定存在，复制和表 达吗？
5 假如你是一个基因工程操作者，若使目的基因 进入棉细胞，并能在棉细胞中遗传和表达，你 应当采取什么办法？你能说出其中的理由吗 ？
（3）依据目的基因表达的特点和位置，用限制 酶切割受体细胞相应终止子与目的基因连 接起来，成为一个整体。
（5）将目的 基因 插入质 粒切口处，用 E•coli DNA连接酶把基因与质粒缝合起来，成功 创建一个重组DNA分子。
人教高中生物选修基因工程的基本操作程序(基因表达载体的构建)PPTPPT优质公开课
巩固例题
某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，
Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamH I酶切后，与用BamH I酶切获得的目的基因混合，加入DNA连
接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠
受体细胞
（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有______________________________（答出两点即可）。 而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。 （2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因 的细胞是不能区分的，其原因是______________；并且______________和______________的细胞也是不能区分的， 其原因是_____________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落， 还需使用含有_____________的固体培养基。 （3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于_____________
4.过程
质粒
重组DNA （基因表达载 体、重组限质制粒酶）
目的基因
DNA连接酶
基因表达载体的构建过程就是目的基因与运载体 的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。
P11 基因表达载体的构建----基因工程的核心
注意：
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片 段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分 结构。 ②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基 因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
基因表达载体的构建
02
转化后，目的基因需要在宿主 细胞中复制和表达，这一过程 需要适当的诱导剂和调控元件 。
03
表达产物可以是目的基因的蛋 白质产物，也可以是RNA产物 ，具体取决于目的基因的性质 和实验需求。
表达产物的检测
01 表达产物的检测可以通过免疫学方法、生物化学 方法、分子生物学方法等多种手段进行。
02 检测的目的包括确定目的基因是否成功表达、表 达产物的性质和含量等。
基因表达载体的构建
• 基因表达载体概述 • 基因表达载体构建流程 • 克隆基因的表达 • 基因表达载体的应用与展望
01
基因表达载体概述
基因表达载体的定义
基因表达载体是用于将目的基因导入 细胞并使其表达的载体，通常由质粒 或病毒等构成。
它能够将目的基因带到细胞内，并在 细胞内复制和扩增，从而使目的基因 在细胞内得到表达。
THANKS
感谢观看
01
宿主细胞应具备繁殖快速、容易培养、容易转染等 特性，以便于基因表达产物的生产。
02
宿主细胞应具备低免疫原性，以减少免疫反应对基 因表达产物的影响。
03
宿主细胞应具备对表达产物的加工和分泌能力，以 便于表达产物的纯化和收集。
转化与表达
01
转化是将目的基因导入宿主细 胞中的过程，常用的方法有电 穿孔法、显微注射法、脂质体 法等。
02
基因表达载体构建流程
选择克隆位点
确定目的基因的长度和结构
01
根据基因序列，选择合适的克隆位点，确保目的基因的完整性
和功能性。
考虑载体的大小和性质
02
根据实验需求，选择适合的载体，确保载体能够容纳目的基因
并具有所需的特性。
确定克隆位点的位置
湖南省长沙市长郡中学高中生物 专题一 课题2 基因工程
分
测
子
转录检测
②表达检测
——分子杂交
检 测
翻译检测
法
——抗原抗体杂交
鉴定
抗虫鉴定
鉴定 抗病鉴定
活性鉴定等
抗虫鉴定
鉴定 抗病鉴定
活性鉴定等
个体水平的鉴定
1.（多选）一个基因表达载体的构建 应包括 A. 目的基因 B. 启动子 C. 终止子 D. 标记基因
1.（多选）一个基因表达载体的构建 应包括 A. 目的基因 B. 启动子 C. 终止子 D. 标记基因
将目的基因导 入微生物细胞
三、将目的基因导入受体细胞
转化—— 目的基因进入受__体__细__胞___内，并 且在受体细胞内维持__稳__定___和
___表__达___的过程
Байду номын сангаас
农杆菌转化法
将目的基因导 入植物细胞
基因枪法
方法 将目的基因导 入动物细胞
将目的基因导 入微生物细胞
三、将目的基因导入受体细胞
1.基因表达载体的组成：
1.基因表达载体的组成：
a.目的基因 b. 启动子 c. 终止子 d. 标记基因
二、基因表达载体的构建
2.过程:
二、基因表达载体的构建
2.过程:质粒
DNA分子
二、基因表达载体的构建
2.过程:质粒
DNA分子
同一种 限制酶处理
二、基因表达载体的构建
2.过程:质粒
DNA分子
三、将目的基因导入受体细胞
转化—— 目的基因进入受__体__细__胞___内，并 且在受体细胞内维持__稳__定___和 ___表__达___的过程
方法
三、将目的基因导入受体细胞
基因表达载体的构建
㈠ 有效转录及其调控元件
• 1. RNA聚合酶 • 2. 启动子及其转录作用的启动（启动子的概念、分类） • 3.转录作用的终止 • 4. 转录的弱化作用
㈡ 正确转译
• 1.起始密码子（intiqtion codon,initiator） • 2.核糖体结合位点（RBS，又称SD序列）
㈢ 原核表达载体的构建
二、基因表达的基本条件
• 1. 外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。其遗传密码不得缺失、遗漏、或 错位及错码。否则会导致编码错误的蛋白质分子，特别是目的基因序列内部应不含两端 酶切位点的识别序列。
• 2. 插入的外源基因必须放在原核的启动子控制之下，也就是使原核的RNA聚合酶能够 识别插入的基因。
基因表达载体的构建
第一节 基因表达的概述和基本条件
• 一、基因表达的基本概念 • 二、基因表达的基本条件 • 三、真核基因在原核细胞中表达及调控
第二节 在大肠杆菌中影响外源基因表达的因素
• 一、启动子结构对表达效率的影响 • 二、表达载体的选择 • 三、外源基因（cDNA）中密码子的作用 • 四、mRNA的一级结构与基因表达 • 五、mRNA的二级结构对翻译起始的影响 • 六、mRNA稳定性的影响 • 七、转录终止区对外源基因表达效率的影响 • 八、转录后的若干因素与基因表达的关系 • 九、宿主选择对表达的影响 • 十、培养条件的控制对表达效率的影响
乳糖启动子（Lac）
• 无乳糖时，调节基因（I）产生阻遏蛋白与操纵基因结合，阻止RNA聚合酶结合进而阻 止转录；有乳糖时，乳糖能与阻遏蛋白结合，使其变构解离而行使转录功能。如图6-2
• 而LacZ基因可由IPTG（异丙基硫代- β-D-半乳糖）诱导转录。 Lac启动子改建 如图6-3、 6-4(a) (b)