土壤中微生物的分离与纯化 (2)

微生物学实验报告

实验名称:土壤中微生物的分离与纯化

课程名称环境微生物学实验

学院环境科学与工程学院

专业班级２011级环境科学(１)班

学号 3１1１007３64

姓名刘迪鸿

联系方式

201３年１2

月１０日

实验报告

土壤中微生物的分离与纯化

刘迪鸿

(广东工业大学11级环科(１)班)

摘要:各种微生物生长所需条件存在差异,根据需要配制不同的培养基可以得到只含目标菌株的纯培养。

关键词:选择培养基,分离,纯化

一、实验目的与要求

1.明确培养基的配制原理,并通过对微生物培养基的配制,掌握配制培养基的一般方法与步骤。

2.掌握根据需要选取不同的环境以找到目标菌株的基本方法,学习分离纯化微生物的基本操作技术,进一步熟练与掌握微生物无菌操作技术,掌握微生物培养方法以及接种方法。

二、实验方案

1.实验原理

培养基就是人工的将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质,用以培养或分离各种微生物,因此,培养基质应当有微生物所能利用的营养成分(包括碳源,氮源,能源,无机盐,生长因素。)与水,根据微生物的种类与实验目的地不同,培养基也有不同的种类与配置。

在土壤,水,空气及动、植物体中,不同种类的微生物绝大多数都就是混杂生活在一起,当我们希望获得某一种微生物时,就必须从混杂的微生物类群中分理它,以得到只含有这一种微生物的纯培养,这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。

为了获得某种微生物的纯培养,一般就是根据该微生物对营养,酸碱度,氧等条件的要求不同,而供给它适宜的培养条件,或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长而抑制其她菌生长的环境,从而淘汰其她一些不需要的微生物,再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离纯化微生物,直至得到纯菌株。

2.实验材料

1)培养基与试剂

牛肉膏蛋白胨培养基配方:牛肉膏２、0g,蛋白胨４、0g,氢氧化钠２、０g,琼脂6~8g,水４0０mL。

高氏一号培养基配方:可溶性淀粉4ｇ,硝酸钾０.４g,磷酸氢二钾0.２g,硫酸镁0.2g,氯化钠0、2g,硫酸亚铁０、004g,琼脂６~8g,水40０mL 。

马铃薯蔗糖培养基配方:马铃薯80g,蔗糖８ｇ,琼脂６~８g,水4０0mL 。 马铃薯葡萄糖培养基配方:马铃薯８０g,葡萄糖８g,琼脂6～8g,水4０0mL 。

2) 仪器以及其她用品

高压灭菌彩。高压灭菌锅,超净工作台,培养皿,移液器,250毫升锥形瓶2５０毫升烧杯。均玻璃珠,接种环,就金丹,显微镜,称量纸等。

3. 实验方法

1) 实验流程图

2) 实验步骤

A. 土壤取样

广工正门对面山坡,即取即用。

B.

培养基的配制

C. 灭菌

将配制好的培养基,用报纸包扎好的培养皿,用橡胶塞封好的盛有９m Ｌ无菌水的试管,枪头盒装有４5ｍL 蒸馏水与玻璃珠的锥形瓶,玻璃珠放到高压灭菌锅进行高温蒸汽灭菌。

D. 微生物的分离

a)倒平板将牛肉膏蛋白胨培养基,高氏一号琼脂培养基,马铃薯蔗糖琼

脂培养基,马铃薯葡萄糖琼脂培养基融化。待冷却至55℃至60℃时,在

高氏一号培养基中加入１mL的０、5%重铬酸钾,在马铃薯蔗糖培养基中

加入1ｍL的1％的链霉素,然后分别倒平板。

b)制备土壤稀释液称取土样５ｇ,放入盛有4５mＬ无菌水并带有玻璃珠

的烧瓶中。震荡摇晃约二十分钟,使土样与水充分混合,将菌分散,配制

成10-1土壤溶液,用一支１mL无菌吸管从中吸取１mL土壤悬液注入盛有

无菌水的试管中,吹吸三次,使充分混匀,然后再用一支无菌吸管从此试

管中吸取1mL土壤悬液注入另一盛有９mL无菌水的试管中,以此类推制

成10-２,1０－3,10-４,１０-5,1０-6各种稀释度的土壤溶液。

c)分离微生物

操作步骤:

◆分离细菌

i.涂布将牛肉膏蛋白胨两个平板底面分别用记号笔写上10-５与10-６

两种稀释度,然后用两支１mL无菌吸管分别由10-5与１０-6两管土壤稀

释液中各吸取２00uL对号放入已写好稀释度的平板中,加入八个灭菌的

玻璃珠轻轻晃动,涂布均匀,然后将玻璃珠倒出。

ii.培养倒置于３7℃温室中培养１～２天

◆分离放线菌

i.涂布将高氏一号两个平板底面分别用记号笔写上10-３与10-4两种

稀释度,然后用两支１mL无菌吸管分别由10-35与１0-4两管土壤稀释液中

各吸取2０0uL对号放入已写好稀释度的平板中,加入八个灭菌的玻璃珠

轻轻晃动,涂布均匀,然后将玻璃珠倒出。

ii.培养倒置于３７℃温室中培养3～5天

◆分离酵母菌与霉菌(如图1)

i.涂布各取两个葡萄糖与蔗糖平板底面各自用记号笔写上葡10－4、葡

10-5与蔗１０-4与蔗10-５两种稀释度,然后用1ｍＬ无菌吸管分别由１0-4

与10-５两管土壤稀释液中各吸取200uL对号放入已写好稀释度的平板中,

加入八个灭菌的玻璃珠轻轻晃动,涂布均匀,然后将玻璃珠倒出。

ii.培养倒置于3７℃温室中培养3~５天

E.挑菌

划线分离使用接种环从待纯化的菌落中蘸取少量菌种,细菌接种在牛肉膏蛋白胨培养基上面,霉菌与酵母菌接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基与马铃薯蔗糖琼脂培养基上、放线菌接种在高氏一号培养基上进行划线分离、

F.保存菌种

图1、分离微生物流程示意图

三、实验结果

在您所实验的四种培养基平板上,长出的菌落分属于那个类群?简述它们的菌落形态特征,并将菌落形态特征填入表1。

答:高氏一号培养基上的菌落分属于放线菌,其菌落形态特征菌落背面有同心圆形纹路,菌落较小。

马铃薯葡萄糖培养基与马铃薯蔗糖培养基上的菌落就是霉菌与酵母菌,其菌落形态特征:

酵母菌:菌落为淡黄色,光滑,半透明,比细菌菌落大。

霉菌:菌落大型,肉眼可见许多毛状物。

牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落为细菌,其菌落形态为较小的圆形菌落,颗粒状。