免疫荧光技术操作步骤培训讲学

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免疫荧光技术操作步骤

直接免疫荧光法测抗原

基本原理

将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高,非特异性荧光染色少,相对使用标记抗体用量偏大。

试剂与仪器

磷酸盐缓冲盐水(PBS):0.01mol/L,pH7.4

荧光标记的抗体溶液:以0.01mol/L,pH7.4 的PBS 进行稀释

缓冲甘油:分析纯无荧光的甘油9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制

搪瓷桶三只(内有0.01mol/L,pH7.4 的PBS 1500ml)

有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫)

荧光显微镜

玻片架

滤纸

37℃温箱等。

实验步骤

1. 滴加0.01mol/L,pH7.4 的PBS于待检标本片上,10min后弃去,使标本保持一定湿度。

2. 滴加适当稀释的荧光标记(饱和浓度可以用滴度发或公式法算出)的抗体溶液,使其完全覆盖标本,置于有盖搪瓷盒内,保温30min 定时间(参考:30min)。

3. 取出玻片,置玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4 的PBS 冲洗后,再按顺序过0.01mol/L,

pH7.4 的PBS 三缸浸泡,每缸3-5 min,不时振荡。

4. 取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆盖。

5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度,一般可用“+”表示:

(-)无荧光;(±)极弱的可疑荧光;(+)荧光较弱,但清楚可见;(++)荧光明亮;(+++

--++++)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上,而各种对照显示为(±)

或(-),即可判定为阳性。

注意事项

1. 对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有一定的浓度,一般稀释在1:20-100 之

间,要自行摸索最佳梯度,建立最好的稀释比例,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,

影响结果的观察。

2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化,染色时间可以从10 min 到数

小时,一般30 min 已足够。染色温度多采用室温(25℃左右),高于37℃可加强染色效果,

但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2℃的低温,延长染色时间。低温染

色过夜较37℃30 min 效果好的多。

3. 为了保证荧光染色的正确性,首次试验时需设置下述对照,以排除某些非特异性荧光染

色的干扰。

(1)标本自发荧光对照:标本加1-2 滴0.01mol/L,pH7.4 的PBS。

(2)特异性对照(抑制试验):标本加未标记的特异性抗体,再加荧光标记的特异性抗

体。

如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,待检标本呈强荧光,则为特异性阳性染色。4. 一般标本在高压灯下照射超过3min,就有荧光减弱现象,经荧光染色的标本最好在当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。

网络转载:《我把你藏在心里最深处》by 顾西爵

《最美遇见你》中周谨程的故事短篇第一章周锦程打电话来时,我刚下课。我在一所大学教英文。我去办公室把书本放下,跟同事们聊了会天,到楼下时周锦程的车刚好到。。我过去拉开车门坐上副驾驶座。旁边的人一如既往的西装革履,成熟精干。他朝我笑笑,发动了车子。这個将近四十岁的男人,手段和修为已经成精。十几年前我猜不透他的想法,现在则更是。这次,是两個月没有约见面了吧?不知道他这两個月在忙什么?我已经不再去猜测,我甚至觉得,他不来,我反而轻松很多。。我是他母亲那边远方亲戚家的孩子,我十四岁的时候,双亲因意外事故去世,是他收养了我。他当时也才二十四岁,大学刚毕业,刚分配到单位,但论辈分我要叫他一声叔叔。起初我的确叫他叔叔,这個唯一肯收养我的长辈。直到我十五岁时来月经,他替我去买了卫生巾,教我怎么用那些东西。我沾血的床单他拿去浸在了水里,搓洗干净。。从那时候开始,我不知道为什么,不再叫他叔叔。。我十六岁上高中。考上的是市里排名第一的重点中学。他带我去外面吃了饭庆祝,席间我跟他说,高中我打算住校。我算是问他意见,如果他不同意,那么我就走读。但他向来不会为这种事情浪费心思,抿了一口茶,点头说随你。

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