草甘膦对转基因抗草甘膦大豆的安全性研究

櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄［５６］ＸｕＨ，ＣａｉＺＣ，ＪｉａＺＪ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｅｃｔｏｆｌａｎｄｍａｎａｇｅｍｅｎｔｉｎｗｉｎｔｅｒｃｒｏｐｓｅａｓｏｎｏｎＣＨ４ｅｍｉｓｓｉｏｎｄｕｒｉｎｇｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｆｌｏｏｄｅｄａｎｄｒｉｃｅ－ｇｒｏｗｉｎｇｐｅｒｉｏｄ［Ｊ］．ＮｕｔｒｉｅｎｔＣｙｃｌｉｎｇｉｎＡｇｒｏｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ，２０００，５８（１／２／３）：３２７－３３２．［５７］熊正琴，邢光熹，鹤田治雄，等．豆科绿肥和化肥氮对双季稻稻田氧化亚氮排放贡献的研究［Ｊ］．土壤学报，２００３，４０（５）：７０４－７１０．　［５８］徐昌旭，谢志坚，曹卫东，等．翻压绿肥后不同施肥方法对水稻养分吸收及产量的影响［Ｊ］．中国土壤与肥料，２０１１（３）：３５－３９．　［５９］黄　晶，高菊生，刘淑军，等．冬种紫云英对水稻产量及其养分吸收的影响［Ｊ］．中国土壤与肥料，２０１３（１）：８８－９２．［６０］徐昌旭，谢志坚，许政良，等．等量紫云英条件下化肥用量对早稻养分吸收和干物质积累的影响［Ｊ］．江西农业学报，２０１０，２２（１０）：１３－１４，２３．［６１］郭晓彦，宋晓华，刘春增，等．紫云英翻压量和化肥用量对水稻生长、产量及经济效益的影响［Ｊ］．山地农业生物学报，２０１４，３３（５）：７－１２．［６２］高菊生，曹卫东，董春华，等．长期稻－稻－绿肥轮作对水稻产量的影响［Ｊ］．中国水稻科学，２０１０，２４（６）：６７２－６７６．［６３］曾庆利，龚春华，徐永士，等．紫云英不同翻压量对水稻产量和产值的影响［Ｊ］．湖南农业科学，２００９（６）：７６－７７，８８．［６４］谢志坚，徐昌旭，许政良，等．翻压等量紫云英条件下不同化肥用量对土壤养分有效性及水稻产量的影响［Ｊ］．中国土壤与肥料，２０１１（４）：７９－８２．［６５］李双来，李登荣，胡　诚，等．减施化肥条件下翻压不同量紫云英对双季稻生长和产量的影响［Ｊ］．中国土壤与肥料，２０１２（１）：６９－７３．［６６］卢　萍，杨林章，单玉华，等．绿肥和秸秆还田对稻田土壤供氮能力及产量的影响［Ｊ］．土壤通报，２００７，３８（１）：３９－４２．陈银竹，丁　伟，刘胜男，等．草甘膦对转基因抗草甘膦大豆的安全性研究［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（１６）：５６－５９．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．１６．０１３草甘膦对转基因抗草甘膦大豆的安全性研究陈银竹１，丁　伟１，刘胜男１，ＭｕｈａｍｍａｄＳｈａｈｉｄｋｈａｎ１，２（１．东北农业大学农学院，黑龙江哈尔滨１５００００；２．白沙瓦农业大学，巴基斯坦白沙瓦１５９９１０７） 摘要：采用草甘膦种子和茎叶处理研究转基因抗草甘膦大豆的安全性，为减少草甘膦用量和转基因抗草甘膦大豆的安全应用提供理论依据。

以转基因抗草甘膦大豆为试材，采用田间随机区组设计方法，测定转基因大豆的生理指标和杂草防除效果。

结果表明，５６２．５ｇ．ａ．ｉ．／ｈｍ２草甘膦种子处理和１１２５ｇ．ａ．ｉ．／ｈｍ２草甘膦茎叶处理后，除莽草酸含量不受影响，转基因大豆的株高、鲜质量、干质量、叶绿素含量以及光合速率各项生理指标均在施药初期受到抑制，茎叶处理后２８ｄ、种子处理播种后６１ｄ时各生理指标均可恢复正常；草甘膦茎叶处理对杂草具有显著的防除效果，草甘膦施用后７ｄ，杂草防效为９４．６７％，２８ｄ，杂草防效为７２．３３％，且对大豆安全。

草甘膦种子和茎叶处理对转基因抗草甘膦大豆均具有较好的安全性，且茎叶处理能有效控制杂草。

关键词：草甘膦；转基因抗草甘膦大豆；安全性；杂草防除效果；生理生化 中图分类号：Ｓ４５１．２２＋４ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１８）１６－００５６－０４收稿日期：２０１７－０３－０７基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项（编号：２０１５ＺＸ０８０１１－００３）；黑龙江省留学归国人员基金（编号：ＬＣ２０１１Ｃ０１）。

作者简介：陈银竹（１９９２—），男，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，主要从事杂草生物学与转基因作物安全评价研究。

Ｅ－ｍａｉｌ：９４００８１８２２＠ｑｑ．ｃｏｍ。

通信作者：丁　伟，博士，教授，研究方向为农药生态安全与转基因作物安全评价。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｉｎｇｗｅｉ＠ｎｅａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。

近年来，基因工程技术发展势头迅猛，种植业中以转基因抗草甘膦大豆的发展最为迅速。

而大豆为我国重要的粮食作物，杂草防除一直是大豆种植过程中的重点问题。

化学除草是大豆田防除杂草的重要手段，近几年大豆田化学除草面积已达其播种面积的９０％以上［１］。

转基因抗草甘膦大豆的出现便为人们提供了一种能有效控制杂草的新途径，不仅大大降低了除草成本和劳动强度，并且有效延缓了大豆田抗性杂草的出现，除草剂药害的发生也明显降低，已成为美洲地区大豆田杂草防除的重要方法之一。

草甘膦由美国孟山都公司研制开发，目前是世界上除草剂使用量最大的品种之一［２］。

草甘膦通过抑制莽草酸途径中的５－烯醇式丙酮莽草酸－３－磷酸合成酶（ＥＰＳＰＳ），使微生物和植物不能合成生存必需的芳香族氨基酸而导致死亡［３－４］。

其特点是杀草谱广、传导性好、残效低，在转基因抗草甘膦大豆整个生育期都可以使用。

国内外普遍将草甘膦应用于茎叶处理，而对应用草甘膦进行种子处理的安全性和杂草防除效果鲜有研究。

本试验通过草甘膦种子处理和茎叶处理研究草甘膦的安全性，为减少草甘膦的用量和我国当前自主研发的转基因抗草甘膦大豆的安全应用提供理论依据。

已有的研究表明，一定浓度的草甘膦会造成转基因大豆叶片的叶绿素含量降低、叶绿体结构变化和光合速率下降，叶绿素恢复过程需要２周左右，莽草酸含量几乎没有变化［５－１１］。

Ｂｅｌｌａｏｕｉ等研究表明，草甘膦会影响转基因抗草甘膦大豆的碳代谢和氮代谢［１２］。

种子用草甘膦溶液浸泡后播于土壤中，敏感的大豆种子浸泡４ｈ后不能发芽，而转基因种—６５—江苏农业科学　２０１８年第４６卷第１６期子均能顺利发芽生长［１３－１４］。

草甘膦茎叶处理能有效控制杂草，但喷施超过推荐剂量１．２３～２．４６ｋｇａ．ｉ．／ｈｍ２会降低成熟期的单株粒数和单株产量［１５］。

美国研究证明，在田间无草的条件下，抗草甘膦大豆平均减产５％～１０％，但由于杂草防效提高，最终抗草甘膦大豆产量增加［１６］。

本研究通过对草甘膦种子处理和茎叶处理来研究转基因抗草甘膦大豆的安全性，期望降低草甘膦用量的同时获得理想的田间杂草防除效果，从而为草甘膦的合理应用及我国自主研发转基因大豆在生产中的安全应用提供基础数据。

１　材料与方法１．１　试验材料与设计供试大豆为转基因抗草甘膦大豆呼交０６－６９８，供试除草剂为４１％草甘膦异丙胺盐水剂（美国孟山都公司）。

试验于２０１５年于５—１０月在东北农业大学转基因试验地进行。

采用随机区组试验设计，４１％草甘膦异丙胺盐水剂设４个处理水平，每个处理４次重复（表１）。

茎叶处理在大豆第１张复叶完全展开后施药（此时为种子处理后３３ｄ），出苗后按照常规方式进行田间管理，在茎叶处理后７、１４、２１、２８ｄ（ＤＡＴ）记录各处理内杂草数，同时取样测定大豆生理指标，连续４次取样完毕后对各处理内杂草进行称质量。

表１　草甘膦用量处理草甘膦有效剂量和处理方法１０２１１２．５ｇａ．ｉ．／ｈｍ２，种子处理３５６２．５ｇａ．ｉ．／ｈｍ２，种子处理４１１２５．０ｇａ．ｉ．／ｈｍ２，茎叶处理１．２　测定指标与方法１．２．１　除草效果的计算　草甘膦茎叶处理后７ｄ和草甘膦种子处理播种后４０ｄ，每隔７ｄ监测各处理杂草数量，计算杂草株防效及鲜质量防效。

计算公式如下：株防效＝对照杂草株数－处理杂草株数对照杂草株数×１００％；鲜质量防效＝对照杂草鲜质量－处理杂草鲜质量对照杂草鲜质量×１００％。

１．２．２　生理指标的测定　草甘膦茎叶处理后７ｄ和种子处理播种后４０ｄ，取样测定各处理单株大豆株高、鲜质量、干质量、叶绿素含量、光合速率和莽草酸含量。

参照丁伟等提出的分光光度比色法测定大豆叶绿素含量［１７］。

量取５ｍＬ二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）加入到干净的血清瓶中，称质量，将大豆叶片新鲜组织加入血清瓶中，再称质量，放入暗室浸提。

浸提２４ｈ后，移取１ｍＬ浸提液加入到５ｍＬ的ＤＭＳＯ中混匀。

在波长６４５、６６３ｎｍ下用空白做对照测定吸光度，计算叶绿素含量：叶绿素含量（ｍｇ／ｇ）＝（２０．２Ｄ１＋８．０２Ｄ２）×Ｖ１×Ｋｍ×１０３。

式中：Ｄ１为６４５ｎｍ处吸光度；Ｄ２为６６３ｎｍ处吸光度；Ｖ１为样品提取液总体积（ｍＬ）；Ｋ为样品显色稀释倍数；ｍ为样品质量（ｇ）。

光合速率采用美国ＬＩ－６４００ＸＴ便携式光合速率测定仪测定。

Ｌｉ－６４００ＸＴ叶室ＣＯ２浓度设定为４００μｍｏｌ／ｍｏｌ，温度为２２．５℃，空气相对湿度为４０％～５０％。

选择晴天０９：００—１１：００，测定各处理大豆的光合速率。

莽草酸含量的测定参照Ｃｒｏｍａｒｔｉｅ等的方法［１８］，通过分光光度计进行测定。

取样放于冰盒中带回进行测定。

测定时，取０．１ｇ样品剪成碎片放入小瓶中，然后加０．２５ｍｏｌ／ＬＨＣｌ溶液到２ｍＬ，浸泡９０ｍｉｎ，期间每隔３０ｍｉｎ晃动１次。

向试管中加２ｍＬ氧化剂溶液（０．２５％高碘酸溶液与０．２５％偏高碘酸钾溶液配制而成），然后加入０．５ｍＬ培养后的待测液，室温下反应６０ｍｉｎ，再加入２ｍＬ的显色溶液（０．６ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ和０．２２ｍｏｌ／ＬＮａ２ＳＯ３溶液配制而成），在３８０ｎｍ下测定吸光度，每个样品重复３次。

标准曲线的制作：加已知量的莽草酸到未喷药前的提取液中，以每２５μＬ提取液中所含的莽草酸量（ｍｇ）为横坐标，以吸光度为纵坐标，作标准曲线。

结果计算：从标准曲线上查得对应的每毫升提取液含莽草酸的微克数，计算公式为莽草酸含量（μｇ／ｇ）＝ＣＶｍ。

式中：Ｃ为提取液莽草酸含量（μｇ／ｍＬ）；Ｖ为提取液的总体积（ｍＬ）；ｍ为样品质量（ｇ）。

１．３　数据统计分析将试验所得的数据通过Ｅｘｃｅｌ进行整理，并采用ＤＰＳ７．０５数据统计软件对试验数据进行５％差异显著水平检测分析。

２　结果与分析２．１　草甘膦对转基因大豆的杂草防除效果应用草甘膦处理过的转基因大豆杂草防除效果明显，并且不同剂量处理间差异显著。

根据施药组与未施药组的杂草数，可以计算出３组草甘膦处理的株防效与鲜质量防效，由于茎叶处理为大豆三叶期施药，药后７ｄ开始调查，因此茎叶处理的防除效果最为明显。

在２组种子处理中，草甘膦剂量为５６２．５ｇａ．ｉ．／ｈｍ２的处理组防除效果较好，从种子处理后４０ｄ开始的株防效为７３．２５％，直至三叶期后２８ｄ，其株防效仍在５０％以上，并且整个测定周期与１１２．５ｇａ．ｉ．／ｈｍ２的低剂量种子处理相比均存在显著差异（表２）。