分子生物学原理--基因工程

• 一个切口：插入型载体。 • 二个切口：置换型载体。
06.02.2021
分子生物学原理
噬菌体载体
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分子生物学原理
目的基因的来源
• 直接从染色体DNA中分离：原核生物 • 人工合成：简单的多肽 • 从mRNA合成cDNA：真核生物 • 基因文库：(gene library）
G文库：用基因组的全部DNA制备。 c文库： 用细胞的全部mRNA制备出全套 cDNA后建库。
限制性内切酶的应用
限制性 内切酶
切载体 切目的基因
要点：避免切断目的基因
相同粘性末端 两者相连
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分子生物学原理
载体和目的基因的连接
• 人工连接器：linker 人工合成的寡核苷酸，安置有限制性内 切酶的识别序列。
• DNA连接酶：可用于连接碱基互补的二 段核酸链。
• 连接方式： 粘端连接方式 尾接法
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重组体的转化
• 转化：重组载体导入宿主后，利用宿主 的酶系统表达的过程。即改变宿主性状 的过程。
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基因工程的表达体系的发展
第一代 第二代 第三代 第四代
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载体
宿主
质粒、噬菌体 细菌
穿梭质粒
酵母
动植物病毒、组织培养细胞 昆虫载体 DNA直接导入 生殖细胞
• 常用的载体有： 质粒、 噬菌体 、 M13 噬菌体 逆转录病毒DNA、昆虫病毒DNA
• 载体与宿主共培育可大量生成，经纯化
后可用于基因工程。
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质粒
• 质粒：plasmid 环形双链DNA，大小约为数千碱基对， 存在于大多数细菌的胞质中。
• 拷贝数：每个细菌能容纳的质粒数目。 • 质粒的性质：
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转位
• 转位：一个或一组基因从一处转到基因 组的另一个位置。
• 这些游动的基因称为转位子(transposon)。
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转 位
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第二节、基因工程
• 基因工程：是用分离纯化或人工合成的 DNA在体外与载体DNA结合，成为重组 DNA，用以转化宿主，筛选出能表达重 组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩
分子生物学原理
整合
• 整合： 噬菌体感染大肠杆菌的第一步
噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的 DNA注入菌体中。 此 DNA可与细菌染 色体重组，成为细菌染色体的一部分。
• 溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。
• 裂解： 噬菌体感染大肠杆菌的第二步
DNA利用菌体的酶系统，复制自身及
外壳蛋白，组装成大量新 噬菌体，并
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第十四章 基因重组与基因工程
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分子生物学原理
基因重组：genomic recombination 重组DNA：recombinant DNA
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分子生物学原理
第一节、自然界的基因重组
• 转化：transformation • 整合：integration • 转导：transduction • 转位：transposition
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分子生物学原理
基因诊断和基因治疗
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分子生物学原理
基因工程产品的开发和应用
• 基因工程疫苗：安全廉价 乙肝疫苗、甲肝疫苗 巨细胞病毒、流行性出血热、轮状病毒、
• 基因工程生产激素类： 胰岛素、生长激素
• 细胞因子： 生长因子、肿瘤坏死因子、造血因子、 干扰素
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增，成为克隆。也叫基因克隆或重组 DNA技术。
• 分子水平上操作，细胞水平上表达。
• 赋予重组DNA以新的生命力。
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基因工程
肿瘤细胞的转移与细胞表面的糖链类型有关， 而后者又与糖基转移酶的表达相关。 已经证实GnT-Ⅴ与转移有关。
肝癌细胞株SMMC7721
转入GnT-Ⅴ基因
分子生物学原理
第五节、聚合酶链反应
• 聚合酶链反应：PCR polymerase chain reaction
• 耐热细菌：DNA聚合酶能耐高温，在 70~80℃有很高的催化力。
• 原理：以目的DNA为模板，快速合成大 量的DNA，用于检测、制备、研究。
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分子生物学原理
第五节、聚合酶链反应
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分子生物学原理
• 转化： 由外来 DNA引 起生物 类型改 变的过 程称为 转化。
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转化
细菌的转化
分子生物学原理
转化
• 病毒癌基因 感染宿主细 胞后，可整 合到宿主染 色体上，从 而使宿主细 胞癌变。
细胞的转化
转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体
内的过程。 06.02.2021
• 变性：
95 ℃、15s
• 引物粘合：
55 ℃、30s
• 引物延伸：
72 ℃、1.5m
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后 共
同 学 习
会 相
互 提 高
有 期
转入反义GnT-Ⅴ基因
观察其迁移、侵袭、粘附等生物学行为
转移 06.02.2021
转移 分子生物学原理
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基因克隆
分 切 接 转 筛
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载体和目的基因
• 载体：vector 在宿主细胞内可独立复制的完整DNA分 子。但必须利用宿主的酶系统，才能有 进一步的基因表达能力。
分子生物学原理
DNA重组体的筛选与鉴定
• 灭活法 筛选重 组体。
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DNA重组体的筛选与鉴定
提取转化细胞DNA
限制性内切酶
琼脂糖凝胶电泳
与原来载体及重组体比较
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DNA重组体的筛选与鉴定
硝酸纤维素滤膜
探针
平板
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菌落
X线底片
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显影
基因工程策略
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第三节、基因工程的应用
• 生命科学研究趋势 • 基因诊断和基因治疗 • 基因工程产品的开发和应用
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生命科学研究趋势
• 基因的结构与功能研究 • 基因表达的调控 • 各种生物大分子之间的识别及结合 • 了解生命的奥秘
Leabharlann Baidu
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限制性内切酶的应用
• Alu I 平端
….AGCT….. ….AG CT... …..TCGA….. ….TC GA...
•BamH I …GGATCC… ...G GATTC… 粘性 ...CCTAGG… …CCTAAG G… 末端
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分子生物学原理
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分子生物学原理
粘 端 连 接
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分子生物学原理
尾 接 法
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重组体的转化
• 基因的转移： 重组体进入宿主细胞的过程，已开发了很多 方法。
• 化学法：CaCl2转移法、碱金属离子转移法 • 物理法：显微注射法、基因枪法、电穿孔法 • 生物学法：逆转录病毒载体、腺病毒载体
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分子生物学原理
从mRNA合成cDNA
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限制性内切酶的应用
• 限制性内切酶可辨认4~6个核苷酸：回文结构
• 回文结构：palindrome DNA双链具有方向相反顺序一致的结构。
• 平端：blunt end 在同一水平上切断两条链。(钝型末端)
• 粘性末端：sticky end 碱基序列被酶以错开几个核苷酸的形式切开。
分子生物学原理
DNA重组体的筛选与鉴定
• 根据重组载体的表型进行筛选： 如质粒的抗药性、营养素的依赖型
• DNA限制酶切图谱分析： 提取经粗选后的宿主DNA，用限制性内 切酶切割后与原来载体比较。
• 利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定： 用目的基因作探针监测宿主DNA是否重
组体。
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易于从一个细菌转移入另一个细菌。 有两三个抗药性基因。 06.0有2.202一1 个限制性内切分子生酶物学切原理口。
• pBR322： 常用的 质粒
质粒
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分子生物学原理
噬菌体载体
• 噬菌体 、 M13 噬菌体 • 易于感染大肠杆菌 • 噬菌体DNA比质粒大，对限制性内切
酶有不止一个切口，需经过改造。
将细菌涨破。 06.02.2021
分子生物学原理
• 溶原 和裂 解可 以相 互转 变。
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整合
分子生物学原理
转导
• 溶原菌中 DNA可以原样地切离出来， 也可以把邻近的宿主DNA在切离时带走 一部分。后者称转导。
• 带有宿主DNA的噬菌体称转导噬菌体。 • 来源于宿主的基因称转导基因。