第六节 单链内切核酸酶

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Bal 31核酸酶的应用：
Bal 31核酸酶降解DNA需要Ca2+的存在，在 反应的不同阶段加入螯合剂—EGTA（乙二醇双β －氨基乙醚四乙酸）可使反应终止。
（1）用于确定DNA片段的限制酶图谱
使用Bal 31核酸酶降解待测DNA，在不同
反应时间取出反应物，用EGTA溶液中止反应。然
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（2）可用于在克隆前通过可控方式去除双链DNA 末端不需要的序列。处理后的DNA末端，可用T4 噬菌体DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶 ⅠKlenow片段补平，再加入合成接头，插入适 当载体。用此方法，还可以在DNA上生成一系列 终点确定的缺失突变体。
（3）用于确定DNA分子的二级结构
程度、RNA分子定位、确定内含子的位置、内含 子和外显子剪切位点的定位、转录起始位点与终 止位点的测定中，S1核酸酶都是十分有效的工具。
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S1核酸酶的活性可被PO43-、5'核苷、核苷 三磷酸、枸橼酸盐和EDTA抑制。然而，其在低 溶度的变性剂（如SDS、尿素甲酰胺）存在的条 件下稳定。
后，各样品用相应限制性内切核酸酶消化后，可
看到酶切片段按一定的顺序消失。
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限制酶图谱就是一系列限制酶的特异识别序列在DNA链上 的出现频率和它们之间的相对位置。它实际上就是限制酶的 特异切点在DNA上的定位，表现出一些部位的线性序列， 它是DNA分子结构特异性的反映，所以限制酶图谱又称 DNA的物理图谱。
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三、脱氧核糖核酸酶Ⅰ
脱氧核糖核酸酶Ⅰ简称DNA酶Ⅰ（DNase Ⅰ），是来源于牛胰脏的糖蛋白。它是一种需要 二价阳离子的内切核酸酶，能从嘧啶核苷酸5'端 磷酸基处随机降解单链或双链DNA，生成具有5' 磷酸末端的寡核苷酸。当有Mg2+存在时，能在双 链DNA上随机独立地产生切口；而在Mn2+存在 时，则在双链DNA的大致同一位置上切割，产生 平末端DNA片段。
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脱氧核糖核酸酶Ⅰ的应用：
在分子克隆中，DNA酶Ⅰ主要用于：与大 肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ联合参与切口平移法标记 DNA分子；在Mn2+存在下，随机裂解双链 DNA分子，构建大片段插入的基因文库；用于 DNase Ⅰ足迹法分析DNA结合蛋白在DNA上的 精确结合位点；使用无RNase的DNase Ⅰ去 除转录产物中的模板DNA。
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当底物是双链环形的DNA分子时，Bal 31的单 链特异性内切核酸酶活性，通过对单链缺口或瞬 时单链区的降解作用，将超螺旋的DNA切割成开 环结构，进而成为线性双链DNA分子。 除此以外，Bal 31核酸酶还可起到核糖核酸酶 的作用，催化核糖体和tRNA的降解，但它不具 有双链特异的核酸外切酶活性。
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二、 Bal 31核酸酶 Bal 31核酸酶的特性：
对单链DNA具有特异的内切酶活性，可从3'OH末端迅速降解DNA。 对于线性双链DNA分子，它表现为3'→5'端的 外切酶活性和5'→3'的外切酶活性，可有控制地 从3'末端和5'末端逐个水解除去单核苷酸，产生 缩短了的DNA分子。（注意：Bal 31的3'外切酶 活性约为它的单链特异性内切酶活性的20倍）
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S1核酸酶的特性：
（1）在高离子强度、pH4.2和1mmol/LZn2+存 在的条件下，S1核酸酶可以高特异性地降解单链 DNA和RNA，包括双链分子中的单链区域（如 发卡结构），反应产物为5'单核苷酸。
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（2）调节S1核酸酶的用量，可以切割双链DNA的 单链缺刻，但不能识别单个碱基 对的错配。
（3）当S1核酸酶用量过大时，伴有双链核酸的降 解，但该酶降解单链DNA的速度是降解双链 DNA的75000倍。
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S1核酸酶的应用：
（1）可用于切掉DNA片段的单链突出末端以产生 平末端；
（2）打开双链cDNA合成中的发夹环结构； （3）S1核酸酶作图法在测定杂交核酸分子的杂交
基因工程
第六节 单链内切核酸酶
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小组成员：耿沙沙 赵彦朵 朱新娅 王高伟
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◆ 本节重点： ◆ 1.S1核酸酶的活性和应用。 ◆ 2.Bal31核酸酶的活性和应用。 ◆ 3.脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ)的活性和
应用。
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一、S1核酸酶
S1核酸酶来源于米曲霉菌，是一种含锌的蛋 白质，相对分子质量为32000，相对耐热，由 nucO编码，该基因已被克隆。S1核酸酶是一种 高度单链特异性的内切核酸酶，催化反应需要 Zn2+和酸性条件，最佳pH4.0~4.5。