(整理)限制性内切核酸酶
限制性核酸内切酶(双语)
EcoK: AACN6GTGC EcoB: TGAN8TGCT
Palindromic(回文序列）
EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG
Cutting sites
At least 1000bp away
At or close to recog. seq
24-26 bp away
Type II Recognition sequence characteristics （识别序列特点）——
Restriction endonuclease (origination)
• One component of the bacterial restriction-modification system, a natural defense mechanism of bacteria to against the introduction of foreign DNA into the cell • Restriction endonuclease: recognize a short, symmetrical DNA sequence, and cut DNA backbone in each strand at a specific site within that sequence (kill foreign DNA) • Methylase: methylates C or A of the cellular DNA
blunt ends（平末端）
Enzyme and connection
Commo n enzyme
nomenclature（命名）
EcoRⅠ
属 种 株 序
Escherichia coli RY13株
限制性内切酶
限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。
主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制。
它的作用包含两类,一种是对外的,限制作用,指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用,破坏入侵的外源DNA,使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制。
另一种是对内的，修饰作用，指在特定位置发生甲基化，可免遭自身限制性酶的破坏。
限制性核酸内切酶的发现是在本世纪中期，Arber等人对λ噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄主控制的限制和修饰系统。
实验是：在K株或B株大肠杆菌上生长繁殖的噬菌体λ（K）或λ（B），再次感染原寄主菌体的成斑率为1，而感染新的寄主菌株的成斑率则分别为10-4和4*10-4所以说受到了限制。
在 20 世纪 60 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。
该研究工作在 Me-selson 和 Yuan（1968）纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制性内切酶时达到高峰。
因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。
从而提供了对 DNA 进行可控操作的前景。
但不幸的是，K12 内切酶不具备人们希望的性质。
虽然它确实是结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的（Yuan 等，1980）。
经过大量努力后，终于在1970 年取得了突破，人们发现了在流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）中存在一种酶，其作用更加简单（Kelly & Smith，1970；Smith & W ilcox，1970），即这个酶可以识别双链 DNA 分子中的一个特定靶序列，并在该序列之内切断多聚核苷酸链，从而产生长度和序列一定的分离片段。
突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌（Haemophilus influenzae）菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶（Smith & Wilcox，1970），并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的核苷酸序列（Kelly & Smith，1970）。
限制性内切核酸酶的酶切与鉴定实验原理及步骤、注意事项
实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。
根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。
限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。
一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。
许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。
例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。
5′……GAATTC……3′3′……CTT AAG…… 5′这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由EcoR I产生的其它分子末端相连接。
限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。
根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。
根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。
小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50～100 μl，DNA用量在10～30ug。
本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。
在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。
在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。
二、仪器与试剂1.仪器：水浴锅、离心管、移液器、吸头、电泳设备等。
2.试剂：质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。
限制性核酸内切酶与核酸内切酶、外切酶
限制性核酸内切酶百科名片其3′→5′外切酶活性使双链DNA分子产生出单链区，经过这种修饰的DNA 再配合使用Klenow酶，同时加进带放射性同位素的核苷酸，便可以制备特异性的放射性探针。
核酸内切酶核酸内切酶（endonuclease）在核酸水解酶中，为可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸的酶，与核酸外切酶相对应。
从对底物的特异性来看，可分为DNaseⅠ、DNaseⅡ等仅分解DNA的酶；脾脏RNase、RNaseT1等仅分解RNA的酶。
如链孢霉（Neurospora）的核酸酶就是既分解DNA又分解RNA的酶。
一般来说，大都不具碱基特异性，但也有诸如脾脏RNase、RNaseT1等或限制性内切酶那种能够识别并切断特定的碱基或碱基序列的酶。
[1]寡核苷酸，是一类只有20个以下碱基对的短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸），寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对链接，所以常用来作为探针确定DNA或RNA的结构，经常用于基因芯片、电泳、荧光原位杂交等过程中。
RNA聚合酶科技名词定义中文名称：RNA聚合酶英文名称：RNA polymerase定义1：以一条DNA链或RNA链为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。
所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；酶（二级学科）定义2：以一条DNA链或RNA链为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。
所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞遗传（二级学科）定义3：以DNA或RNA为模板合成RNA的酶。
所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布RNA聚合酶（RNA polymerase）:以一条DNA链或RNA为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。
是催化以DNA为模板（template）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶。
因为在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶。
限制性内切酶酶切及电泳
生物化学与分子生物学教研室
生物化学与分子生物学教研室一、实验目的
生物化学与分子生物学教研室二、实验原理
），并在这个顺序
GAATTC
CTTAAG
EcoRⅠ
NNNNNN5’
pTA2载体后获得的重组载体pTA2-p53进行酶切分析，外源p53基因
( p53基因是人体抑癌基因,失活对肿瘤形成起重要作用。
)
带电质点在电场中向与其相反的电极进行泳动的现象。
的磷酸根残基，在
：在电泳前向凝胶预加核酸染料，电泳过程中染料同DNA结合，电泳后在紫外光照射下，可观察到荧光，从
Eppendorf管封上封口膜于３７℃水浴（金属浴）中酶切(酶切时间需小于2小时，以免产生星号活性）。
DNAmarker；泳道2：
电泳检测示例
反应时间：一般酶切鉴定30分钟就可以了,如果酶减少，
一般要求在最后加酶，且。
限制性内切酶 (1)解析
定义和命名
DNA限制性内切酶： 生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸 酶。它可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA 的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这 样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在 DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。 限制性核酸内切酶的命名；一般是以微生物属名的第一个字母 和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。例 如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性 内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基 顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、 HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。
2.限制与修饰系统的种类 根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制 与修饰系统主要分成三大类。表 2-1 是各种限制与修饰系统的比较。 Ⅱ 型（type Ⅱ）限制与修饰系统所占的比例最大，达 93% 。Ⅱ 型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近 切割 DNA ，产生带 3'- 羟基和 5'- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需 SAM 。识别序列主要为 46bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或 简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。 Ⅱs 型（type Ⅱs）限制与修饰系统，占 5% ，与 Ⅱ 型具有相似 的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为 4-7bp ， 切割位点可能在识别位点一侧的 20bp 范围内。 Ⅱ 型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相 反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在 DNA 链的两 个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成， 分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。 在 Ⅱ 型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链 DNA 中的 一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶 （nicking enzyme）， 如 N.Bst NBI 。
限制性核酸内切酶名词解释
限制性核酸内切酶名词解释限制性核酸内切酶（RestrictionNucleases,RNases）是一类重要的核酸分子分析工具，是由胞壁杆菌和放线菌等微生物中编码的特定核酸酶类别。
它可以特异性的切割DNA和RNA的特定序列，对研究DNA和RNA的结构和功能有着重要的作用。
限制性核酸内切酶的分子结构基本上是由多聚腺苷酸（polypeptide）和双聚腺苷酸（dipeptide）组成的。
此外，它们还包含辅酶（cofactor），例如Mg2+或Ca2+、K+等，并且需要这些辅酶才能激活其具有酶活性。
一个限制性核酸内切酶在一次反应中可以检测出多个DNA序列，而且能够辨识具有同系特征特异性碱基对，尽量减少大量的氧化废物产生。
与其他核酸分子分析工具不同的是，限制性核酸内切酶具有单端可切或双端可切的特性，可以选择性地切割DNA分子的特定序列，其切割后的片段可以进一步用于分子生物学技术，如DNA测序、PCR及DNA杂交等。
例如，细菌DNA内切酶BamHI以TGT^AAT为切割位点，能有效地将DNA分子切断，切割后可以得到二条内切片段，分别以TGT和AAT为3端，以及一条5末端非切片段；而HpaII以C^CGG为切割位点，切割后可以得到二条内切片段，分别以C和CGG为5端，以及一条3末端的非切片段。
此外，限制性核酸内切酶还可用于检测DNA片段的克隆和定位，以及调控基因表达，控制蛋白质翻译等用途，因此，它们在遗传学、分子生物学研究中起着重要的作用。
它们能够解析特定DNA序列，同时保留它们的原始特征，有助于研究者对其进行详细的调查。
在生物技术的应用中，使用限制性核酸内切酶可以改变DNA序列，实现重组DNA的目的，创造各种抗性等目的。
因此，限制性核酸内切酶的重要性不言而喻。
它们是研究 DNARNA 构和功能的重要工具，同时也是实现技术转化的重要基础。
它们可以用于检测DNA片段，改变序列，以及调控基因表达等多种用途，同时也可以做出有意义的蛋白质和重要生物体系。
限制性核酸内切酶的命名和类型3
② Dcm甲基化酶(DNA 引入甲基
CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上 修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自 身遗传物质和外来遗传物质的目的。
（3）限制与修饰系统相关的三个基因
① hsd R: 编码限制性内切酶 这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双 链DNA切断 ② hsd M: 编码限制性甲基化酶 这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化， 即起修饰 DNA的作用。 ③ hsd S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达 作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。
3. 功能
自我保护作用
细菌的限制和修饰系统（R/M体系）
任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制
寄主的限制与修饰现象
phage λ (B) EOP=1
E.O.P 成斑率 efficiency of plating
EOP=10-4（限制作用）
大肠杆菌B
大肠杆菌K
EOP=10-4（限制作用） 修饰的phage λ (K)
工具酶
基因工程的操作，是在分子水平上的
操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，
连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行 人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些 酶称之为“工具酶”。
第一节
限制性核酸内切酶
1、限制-修饰系统
2、限制性核酸内切酶的命名和类型
3、II型限制性核酸内切酶的基本特性
4、影响限制性内切酶活性的因素
实际应用中，R常被省略。
Escherichia
Coli
Ry13
EcoR I
属名 种名 株系 编号
若种名头 2个字母相同则其中一个可用种名的第一和
第三个字母。
限制性内切核酸酶名词解释
限制性内切核酸酶名词解释限制性内切核酸酶(restrictive endoribonuclease)能识别特异的核苷酸序列，它们不与单链的核酸共价结合，而是以共价键切开单链核酸，然后再将切开的片段两两链接起来形成完整的分子。
限制性内切核酸酶分为限制性激酶和限制性内切酶。
限制性内切核酸酶能有效降解RNA或DNA中的碱基、磷酸二酯键、侧链基团等核酸结构，从而阻止了DNA或RNA进入蛋白质或脂类等高分子化合物中，使其失去遗传功能或者发生改变。
它主要作用于核苷酸的3'-OH末端。
限制性内切核酸酶(restrictive endoribonuclease)分为限制性激酶和限制性内切酶。
限制性激酶仅对特定核苷酸序列敏感，而限制性内切酶则可识别并裂解特定核苷酸序列，并且有特异性。
限制性内切核酸酶能有效降解RNA或DNA中的碱基、磷酸二酯键、侧链基团等核酸结构，从而阻止了DNA或RNA进入蛋白质或脂类等高分子化合物中，使其失去遗传功能或者发生改变。
它主要作用于核苷酸的3'-OH末端。
这类酶通常比较稳定，多数不会自动水解底物，即使在无酶情况下也可保持活性。
由于它可被一些长寿命的蛋白质修饰，故认为限制性内切核酸酶具有超活性。
限制性内切核酸酶已经广泛应用于生物化学研究及临床诊断。
1、限制性内切核酸酶识别DNA或RNA的模板链的序列，并且限制性内切酶能够切割双链DNA分子； 2、限制性内切核酸酶与细胞内或细胞外的另一种酶——限制性核酸内切酶结合，对它进行识别和剪切； 3、当产生的酶与目标分子连接时，目标分子便能被释放出来，这就导致了基因表达的调控。
在基因工程中，将目标DNA的片段通过限制性内切酶切割之后，将两端的切口连接起来，这样就可以用连接酶将DNA片段连接起来，合成为双链DNA，进而实现DNA指导蛋白质的表达。
限制性内切核酸酶名词解释：是指能识别核苷酸序列并将其分解成小片段的内切核酸酶。
限制性内切核酸酶的识别序列是由3’端或5’端内含子组成的核苷酸序列。
基因工程操作的各种酶
基因工程操作的各种酶基因工程操作中涉及一系列相互关联的酶促反应。
已经知道有许多重要的核酸酶，如限制性内切核酸酶、外切核酸酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、反转录酶、DNA及RNA的修饰酶等，在基因工程的操作中有着广泛的用途。
1．限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶(restrictionendonuclease)是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的条件下使每一条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3／―OH基团和5／―P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。
至今发现的限制性内切核酸酶有I型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶，它们各具特性。
基因工程中所说的限制性内切核酸酶都是指Ⅱ型酶。
限制性内切核酸酶把目的基因从只有四种碱基A、T、G、C组成的DNA长链(人类D NA长度为3X109个碱基对)中准确地剪切下来。
每一种限制性内切核酸酶的识别位点是固定的，如EcoRI的识别位点是GAATTC及其互补序列CTTAAG。
1968年，沃纳?阿尔伯博士、丹尼尔?内森斯博士和汉密尔?史密斯博士第一次从大肠杆菌中提取出限制性内切核酸酶。
该酶能够在DNA上寻找到特异的“切点”，认准后将DNA 分子的双链交错地切断。
至今人们已经分离提取出400多种限制性内切核酸酶。
目前，人们可以从复杂的生物有机体基因组中，经过限制性内切核酸酶酶切消化等步骤，分离出目的基因。
因其能够特异地切割DNA分子，人们常形象的将其比作“分子剪刀”。
2．DNA连接酶DNA连接酶能够催化具有3／―OH基团和5／―P基团的DNA片段之间形成磷酸二酯键。
在基因克隆中用来连接目的基因与载体。
3．DNA聚合酶DNA聚合酶可以使单核苷酸通过磷酸二酯键加在寡核苷酸的3／―OH端，在基因克隆中用来补平缺口。
尤其是具有耐热性质的DNA聚合酶的分离极大促进了基因等DNA片段的体外合成与扩增技术的发展。
4．反转录酶反转录酶以RNA为模板合成DNA，即cDNA (complementaryDNA，互补DNA)。
什么是限制性内切核酸酶的星号活性
2、什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些因素影向？
3、答：Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。
条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星号活性。
概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(>5％, v／v)；(2)限制性内切核酸酶用量过高(>100U／ugDNA)；(3)低离子强度(<25 mmol／L)；(4)高pH(8.0以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。
4、什么是Western印迹？它与Southern印迹有什么不同答：Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。
它与Southern 的不同在于探针的性质不同，在Western印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。
5、什么是蓝白斑筛选法？答：这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。
主要是在
—半乳糖苷酶的基因片段，携带有lac基因片段lac的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚——D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成浅蓝色的噬菌斑。
外源基因插人lac(或lac基因部分被取代)后，重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力，转入lac-宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚——D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。
第2讲 限制性核酸内切酶
Restriction endonucleases
切割位点
识别位点处。
切开双链DNA。形成粘性末端（cohesine ends） 或平齐末端（blunt ends）。如：
粘性末端（sticky ends，cohesine ends） 含有几个核苷酸单链的末端。
分两种类型：
① 5’端凸出（如EcoR I切点）
由限制性物理图谱可获得如下信息：
①DNA大小； ②零点（环形图谱的起止点）； ③Ori； ④选择标记;
举例
常用的切割方法：单酶切、双酶切和部分酶切。
A
B
4kb
1.5kb 1kb 0.5kb
7kb 6kb 4.5kb 4kb 3kb 2.5kb 2kb 1.5kb 1kb 0.5kb
1kb 1.5kb 0.5kb 4kb
② 3’端凸出（如Pst I切点）1. 完全消化Fra bibliotek切割方式
内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。
1 23
4
12 3
4
2. 不完全消化 / 局部消化 只有有限数量的酶切位点被切开。
1 23
4
1
4
通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶 的用量可达到局部消化的目的。
DNA分子的限制性图谱 （restriction mapping，RM）
A为完全酶切 B为部分酶切
限制性物理图谱即限制性内切核酸酶作图。简单 地说就是DNA分子中限制性内切核酸酶切割位点 的定位，即DNA分子中各种不同限制性内切核酸 酶的酶切位点的线性排列图。
即标明限制酶在DNA分子上的限制性位点的数目、 限制性片段大小及其线性排列的顺序。
RM的表现形式（3种）： ①环形（图） ②线条形（图） ③环行与线条形相结合（图）
限制性内切核酸酶名词解释
限制性内切核酸酶名词解释限制性内切核酸酶是一种能够识别并水解脱氧核苷酸侧链的蛋白质，是除磷酸双酯酶之外一类分子量比较大的酶。
这类酶不受其他限制性内切核酸酶或核酸酶的抑制，对许多蛋白质具有高度特异性。
大部分哺乳动物细胞都含有限制性内切核酸酶。
人的成熟红细胞、精子等也含有少量限制性内切核酸酶。
由于限制性内切核酸酶广泛存在于人体各组织细胞中，而且又可以对其进行高效降解，因此常被用于对细胞的活性研究。
现已知道人类有三种典型的限制性内切核酸酶：一种是位于13号染色体上的脊椎动物细胞核DNA限制性内切核酸酶;另一种是位于22号染色体上的鸟类细胞核DNA限制性内切核酸酶，以及一种位于X染色体上的人类细胞核和线粒体DNA限制性内切核酸酶。
最近，在哺乳动物细胞中发现了一种新的DNA限制性内切核酸酶。
限制性内切核酸酶对哺乳动物的DNA和RNA具有很高的专一性。
它们能识别被连接到碱基末端的核苷酸残基，并使脱氧核苷酸（或核糖核苷酸）沿着被切断的核苷酸末端彼此分开。
限制性内切核酸酶也叫做限制性核酸内切酶，是一类在某些条件下可以将DNA或RNA一分为二的特殊的核酸内切酶。
目前发现的限制性内切核酸酶包括3个亚家族，即头甲型限制性内切核酸酶、尾加型限制性内切核酸酶和未定型限制性内切核酸酶。
虽然还没有明确证据表明限制性内切核酸酶与人类癌症、基因突变、血型以及某些疾病的发生和发展有直接关系，但限制性内切核酸酶作为一类具有重要生理功能的酶，在基因工程技术的应用方面显示出巨大潜力。
与基因重组相比，基因修饰是限制性内切核酸酶作用的另一个重要领域。
因为基因修饰也是细胞中经常发生的事情。
限制性内切核酸酶的活性不仅取决于蛋白质的浓度，还取决于温度、 pH值、离子强度、金属离子、抑制剂、酶和DNA模板等多种因素，当这些因素发生变化时，限制性内切核酸酶的活性也会随之改变。
许多实验表明，不同温度和盐浓度对限制性内切核酸酶活性的影响是非常明显的，限制性内切核酸酶活性也随温度的升高而提高。
限制性内切酶名词解释
限制性内切酶名词解释限制性内切酶又称为限制性内切酶是一种由特定的特定的特定的核酸分子特定的特定位置所识别的酶，它们能够在特定的位置将核酸分子切割成两段，其中一段被称为内切片段，另一段称为外切片段。
限制性内切酶是 DNA变，特别是基因识别和修饰的重要工具，可以将 DNA子切割成两个不同的片段，并且这两个片段可以通过结合的方式来进行重新组合。
限制性内切酶的发现，极大地改变了分子生物学的研究领域，使得科学家们能够更加精确地控制DNA的改变和组装。
限制性内切酶的种类繁多，但它们共有的特点是精确地识别特定DNA片段，并在特定的位置进行限制性切割。
它们曾被广泛应用于全基因组比较、基因调控分析、基因组编辑、克隆方法开发、细胞工程和一些其他的生物科学研究。
限制性内切酶的分解模式是其特有的特征，它们能够在特定的位置精确地分解DNA，使反应具有高度特异性。
它们的作用位置是由特定的DNA序列所决定的，即所谓的“限制性位点”。
它们的分解效率较高，一旦识别了特定的DNA序列，就可以把DNA分解成外切片段和内切片段。
此外，限制性内切酶的精确度也是非常高的，因为它们在DNA分解过程中只在特定的位置进行切割，从而避免了偶然的外切。
另外，限制性内切酶具有一定的灵活性，可以通过增加弱底物吸引力或结合抑制剂来改变它们的功能，以及通过改变活性中心的位点，以改变它们的切割效率。
总之，限制性内切酶因其精确度、分解效率和灵活性而能够大大的改变分子生物学的研究领域。
限制性内切酶在生物领域的应用非常广泛，它们可以用于克隆基因和生物工程，用于分析基因组变异和基因组间水平的比较，和用于细胞工程中细胞表型的改变。
此外，限制性内切酶也被用于生物检测，特别是对病毒感染有重要意义。
比如可以利用限制性内切酶对病毒DNA进行检测，以及其他一些生物标记试剂的检测，以确定特定的细胞和细菌的存在。
另外，限制性内切酶也可以应用于药物开发，用于研究药物潜在的重要靶标，以及如何从DNA中提取药物起始分子。
限制性内切酶小知识
制作人：*** 日 期：*****
简介
限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease):识别并切割 特异的双链DNA序列的一种内 切核酸酶。 [别名] Endodeoxyribonuclease [酶反应] 限制性内切酶能分 裂DNA分子在一限定数目的专 一部位上。它能识别外源DNA 并将其降解。 [单位定义] 在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中， 1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。
2．限制酶识别序列的结构 限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在 DNA 两条链相 对称的位置。 EcoRⅠ 和 HindⅢ 的识别序列和切割位置如下： EcoRⅠ G↓AATTC；HindⅢ A↓AGCTT CTTAA↑G TTCGA↑A 有一些限制酶的识别序列不是对称的，如 AccBSⅠ[CCGCTC（-3/3）] 和 BssSⅠ[CTCGTG（-5/-1）]。识别序列后面括号内的数字表示在 两条链上的切割位置。 AccBSⅠ CCG↓CTC；BssSⅠ C↓TCGTG GGC↑GAG GAGCA↑C 有一些限制酶可识别多种序列，如 AccⅠ 识别的序列是 GT↓MKAC ， 也就是说可识别 4 种序列，其中两种是对称的，另两种是非对称的。 HindⅡ 识别的序列是 GTY↓RAC 。 有一些限制酶识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱 基。如 AlwNⅠ 和 DdeⅠ ，它们的识别序列如下： AlwNⅠ CAGNNNC↓TG；DdeⅠ C↓TNAG GT↑CNNNGAC GANT↑C
限制反应与甲基 化反应
限制作用是否需 用 ATP
分开的反应
No
互斥
Yes
同时竞争
Yes
限制酶识别的序列
限制性核酸内切酶相关知识总结范文限制性核酸内切酶名词解释
限制性核酸内切酶相关知识总结范文限制性核酸内切酶名词解释限制性核酸内切酶是生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
限制性核酸内切酶主要存在于原核生物，它的功能是能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。
由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶(简称限制性内切酶或限制酶)。
它不同于一般的脱氧核糖核酸酶（DNae），限制性核酸内切酶的切点大多很严格，要求专一的核苷酸序列。
限制性核酸内切酶按其性质可分为三大类，即所谓Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型酶，基因工程最常用也是高中生物所指的限制性核酸内切酶即为Ⅱ型酶。
新课标高中生物必修2――遗传与进化模块中“基因工程及其应用”这一节对限制性核酸内切酶作了一定的介绍，但笔者在教学过程中发现部分学生概念有些模糊，做题准确率不高。
因此笔者总结了有关限制性核酸内切酶的知识点，并结合近年来的高考真题，对该酶作一次较为详细的总结。
1.限制性核酸内切酶的相关知识点限制性核酸内切酶识别序列的长度一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基。
一般情况下，不同的限制性核酸内切酶具有不同的识别序列和酶切位点。
但这并非绝对，部分限制性核酸内切酶具有相同的识别序列，但切割的位点不同，如某maI和SmaI都识别六核苷酸CCCGGG，然而它们的酶切位点分别是C↓CCGGG和CCC↓GGG；有些限制性核酸内切酶不但具有相同的识别序列，连酶切位点都一样，如BamHI、BglⅡ、BtI这三种酶，它们的识别序列及切割位点都为G↓GATCC。
不同的限制性核酸内切酶切割双链DNA所形成的末端通常是不同的，有的酶切割后切口是平的，即形成平末端，如AluⅠ和HaeⅢ。
有的切口可带有一个短的单链末端，即黏性末端，如EcoRⅠ和HindⅢ。
有些限制性核酸内切酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，称为同尾酶，如BamHI(G↓GATCC)和BglⅡ(A↓GATCT)，由此产生的DNA片段可借黏性末端相互连接，使DNA重组在操作时具有更大的灵活性。
限制性核酸内切酶
目 录
• 限制性核酸内切酶的概述 • 限制性核酸内切酶的分类 • 限制性核酸内切酶的工作原理 • 限制性核酸内切酶的应用 • 限制性核酸内切酶的未来发展
01
限制性核酸内切酶的概述
定义和特性
定义
限制性核酸内切酶是一类能识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定 部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。
在生物科学领域的应用
基因克隆和DNA重组技 术
限制性核酸内切酶是基因克隆和DNA重组 技术中的关键工具，用于切割和重组DNA 片段。
基因诊断和基因治疗
限制性核酸内切酶可用于检测和纠正基因突变，为 基因诊断和基因治疗提供有效手段。
生物制药和生物技术
限制性核酸内切酶在生物制药和生物技术领 域中用于生产重组蛋白、抗体和治疗性核酸 等生物制品。
双活性酶
02
同时具有切割和磷酸酶活性，如BstAPI。
多活性酶
03
同时具有多种活性，如FokI同时具有切割、磷酸酶和甲基化酶
活性。
03
限制性核酸内切酶的工作原理
识别和切割DNA的过程
识别
限制性核酸内切酶能够识别特定的 DNA序列，通常是4-6个核苷酸组成 的序列。
切割
在识别位点处，限制性核酸内切酶将 DNA链切开，形成两个断开的磷酸二 酯键。
产生黏性末端
限制性核酸内切酶切割DNA后，通常产生具有突出末端的片段，也称为黏性末端 。这种黏性末端可以用于DNA的连接和重组。
04
限制性核酸内切酶的应用
在基因工程中的应用
1 2 3
基因克隆
限制性核酸内切酶能够将DNA分子切割成特定序 列的片段，为基因克隆提供精确的DNA片段。
基因工程中常用的酶
分类与用途
分类
根据识别序列的长度和切割位点的特性，限制性内切核酸酶 可分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型限制性内切核酸酶识别位点较长， 切割位点不规则；Ⅱ型限制性内切核酸酶识别位点较短，切 割位点规则。
用途
限制性内切核酸酶在基因工程中主要用于DNA的克隆、基因 的定位、突变分析等方面。通过限制性内切核酸酶的切割， 可以将DNA片段分离出来，再进行后续的克隆和转化等操作 。
生物制药
在生物制药中，使用DNA 连接酶将药物基因或疫苗 基因插入到载体中，制备 基因药物或基因疫苗。
03
聚合酶
定义与特性
聚合酶
是一种能够催化DNA复制和修复的酶， 通过聚合核苷酸片段，合成新的DNA 链。
特性
聚合酶具有专一性、高效性和耐受性 等特性，能够在特定的模板指导下， 高效地合成DNA链。
分类与用途
分类
根据来源不同，反转录酶可分为天然反转录酶和重组反转录酶。
用途
在基因工程中，反转录酶主要用于将RNA转录为cDNA，以便进行基因克隆、表达和功能研究。
反转录酶的应用案例
基因克隆
通过反转录酶将mRNA转化为 cDNA，再利用限制性内切酶将其 切割成适当大小的片段，进行基 因克隆和测序。
基因工程中常用的酶
• 限制性内切核酸酶 • DNA连接酶 • 聚合酶 • 反转录酶 • 其他常用酶类
01
限制性内切核酸酶
定义与特性
定义
限制性内切核酸酶是一类能够识 别并切割DNA特定序列的酶，是 基因工程中常用的工具酶之一。
特性
限制性内切核酸酶具有高度的特 异性，能够识别并切割DNA中的 特异序列，切割位点通常是DNA 双链中的特定位点。
限制性内切核酸酶的应用案例
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第三章限制性内切核酸酶一、填空题1. 严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被证明是的酶。
基因工程中把那些具有识别的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。
2.年Luria和Human在T偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌的现象。
3.1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶，能够特异性的切割DNA，这个酶后来被命名为，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。
4.通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的。
5.Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小．一般在20~40kDa，通常由——亚基所组成。
它们的作用底物为双链DNA，极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA，或DNA／RNA杂合双链；这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此，Ⅱ类酶既具有专一性，也具有专一性，一般在识别序列内切割。
切割的方式有，产生末端的DNA片段或的DNA片段。
作用时需要——作辅助因子，但不需要和6.完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：和7.Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别个碱基，也有识别多序列的限制性内切核酸酶；根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析，限制性内切核酸酶识别序列具有倾向，即它们在识别序列中含量较高。
8.EcoK是I类限制性内切核酸酶，分子组成是_______ 分子量是300kDa.在这些亚基中，α亚基具有作用；β亚基具有的活性;γ亚基的作用则是，9.个体之间DNA限制性片段长度的差异叫10.限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自，第二、三两个字母取自，第四个字母则用表示。
11.限制性内切核酸酶AcyI识别的序列是5’-GRCGYG-3’，，其中R，Y12.在酶切反应管加完各种反应物后，需要离心2秒钟，其目的是和13.部分酶切可采取的措施有：(1)(2)(3)等。
14.第一个分离的限制性内切核酸酶是；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是15.限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是,它们属于。
16.由于DNA是由4种碱基组成的，所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理沦值应该是·17.SalI和NotI都是哺乳动物中识别序列稀有的酶，在哺乳动物基因组的5kb片段中，找到NotI切点的概率是。
18.部分酶切是指控制反应条件，使得酶在DNA序列上的识别位点只有部分得到切割，它的理论依据是。
19.Ⅰ类限制酶识别DNA的位点和切割的DNA位点是不同的．切割位点的识别结合有两种模型，一种是，另一种是。
20.限制性内切核酸酶通常保存在浓度的甘油溶液中。
二、判断题1.限制与修饰现象是宿主的一种保护体系，它足通过对外源DNA的修饰和对自身DNA的限制实现的。
2.限制性内切核酸酶在DNA中的识别／切割位点的二级／三级结构也影响酶切效率, 一般来说，完全切割质粒或病毒DNA，要比切割线状DNA需要更多的酶，最高的需要20倍，3.如果限制性内切核酸酶的识别位点位于DNA分子的末端，那么接近末端的程度也影响切割，如HpaII和MboI要求识别序列之前至少有一个碱基对存在才能切割。
4.能够产生防御病毒侵染的限制性内切核酸酶的细菌，其本身的基因组中没有被该核酸酶识别的序列。
5.限制性图谱与限制性片段长度多态性(RFLP)图谱的最显著的区别在于前者是一个物理图谱而后者是—个连锁图6.用限制性内切核酸酶HaeⅢ分别切割载体DNA和供体DNA后，可用E.coli DNA连接酶进行连接。
7.已知某—内切核酸酶在一环状DNA上有3个切点，因此，用此酶切割该环状DNA,可得到3个片段。
8.迄今所发现的限制性内切核酸酶既能作用于双链DNA，又能作用于单链DNA。
9.基因工程中使用的Ⅱ类限制性内切核酸酶不仅有内切核酸酶的活性，而且有甲基化酶的活性10.DNA多态性就是限制性片段长度多态性。
11.用限制性内切核酸酶PstI切割质粒pBR322后，再用外切核酸酶ExoⅢ进行系列缺失，可得到一系列大小不同的缺失突变体。
12.甘油会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生改变，是导致—些酶的星活性的主要原因之一，防止的办法是在酶切反应体系中，将甘油的浓度控制在5％以下。
13.具有EcoRⅡ末端的外源片段只能以一个方向插入到EcoRlI末端的载体中。
14.从Esherichia coliK中分离的限制性内切核酸酶命名为EcoK。
15.同一种限制性内切核酸酶切割靶DNA，得到的片段的两个末端都是相同的，16.在限制与修饰系统中，修饰主要是甲基化作用，一旦位点被甲基化了，其他的限制性酶就不能切割了。
17.稀有酶是指那些识别序列很长又不常用的限制性内切核酸酶。
三、选择题(单选或多选)1.关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当。
(a)由作用于同一DNA序列的两种酶构成(b)这—系统中的核酸酶都是n类限制性内切核酸酶(c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰(d)不同的宿主系统具有不同的限制—修饰系统2 .RFLP产生自( )(a)使用不同的限制性内切核酸酶(b)每种类型的染色体有两条(二倍体)(c)染色体中碱基的随机变化(d)Southern印迹(e)不同探针的使用3.Ⅱ型限制性内切核酸酶:( )(a)有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列(b)仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供(c)限制性识别非甲基化的核苷酸序列(d)有外切核酸酶和甲基化酶活性(e)仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供4.Ⅲ型限制性内切核酸酶：( )(a)由两个亚基组成，仅识别半甲基化位点。
甲基化位点相对于限制位点的位置(上游或下游)决定了DNA是被甲基化还是被限制(b)不同亚基的识别位点甲基化和限制活性相互排斥：MS亚基促使甲基化，R亚基促使限制(c)由两个亚基组成，在识别位点附近识别并进行甲基化或限制(d)在错配修复中起关键作用，因为酶结合到DNA上是以结构扭曲为基础而不是序列错误识别(e)是光依赖型酶，是嘧啶二聚体进行“光反应”的关键酶，它们能使胸腺嘧啶二聚体间的共价键断裂5.分析限制性内切核酸酶切割双链DNA所得到的DNA片段的长度有助于物理作图。
这是因为：( )(a)即使只用一种限制酶，因为DNA是线性的，所以也可以迅速确定限制性片段序列(b)内切酶在等距离位点切割DNA，同时对于每个生物体的长度是特异的(c)DNA的线性意味着单限制性酶切片段的长度之和等于DNA的总长,而双酶切产生的重叠片段则产生模糊的图谱(d)这些内切酶的消化活性是物种特异的(e)这—技术同时为核苷酸序列提供了广泛信息6.通过限制性片段分析，可以对等位基因进行精确的分析比较，其原因是：( )(a)限制性内切核酸酶只切割两个变异等位基因中的—个(b)它利用限制性位点作为遗传标记(c)一个特定细胞中等位基因的核苷酸序列不会是相同的(d)它不依赖于变异等位基因产物的功能。
(e)限制性内切核酸酶的切点被限制在DNA的编码区域内7.限制性片段长度多态性(RFLP)是：( )(a)用于遗传的“指纹结构”模式分析的技术(b)二倍体细胞中的两个等位基因限制性图谱的差别(c)物种中的两个个体限制性图谱间的差别(d)两种物种个体间的限制性图谱差别(e)两种酶在单个染色体上限制性图谱的差别8.为了正确地构建一个真核基因组的物理图谱：( )。
(a)必须有可能清晰地分离各个染色体(通过脉冲场凝胶电泳)(b)必须从单倍体细胞(配子)中分离DNA，这样避免了由二倍体细胞中同源染色体的存在而产生的干扰信息(c)必须进行单个染色体分析，这只能在细胞分裂后期进行(d)必须找到对于每个染色体只切割一次的限制酶(e)必须首先分离核DNA和细胞器DNA，然后对它们分别作图9.下面有关限制酶的叙述哪些是正确的?( )(a)限制酶是外切酶而不是内切酶(b)限制酶在特异序列(识别位点)对DNA进行切割(c)同一种限制酶切割DNA时留下的末端序列总是相同的(d)一些限制酶在识别位点内稍有不同的点切割双链DNA，产生黏末端(e)一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链DNA，产生平末端10.因研究入噬菌体的限制与修饰现象的本质而获得诺贝尔奖的科学家是：( )(a)J.Lederberg (b)WArber (c)H.Smith (d)FSanger11.第一个被分离的Ⅱ类酶是：( )(a)EcoK (b)HindⅢ(c)HindⅡ(d)EcoB12.双链DNA中一段自我互补的序列被称为回文序列，这种序列一般具有下列特征：（）(a)有对称轴(b)两条链的5'--3'方向的序列相同(c)是Ⅱ类酶的识别序列(d)可增强基因的表达13 在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制那一项最好？(a)反应时间(b)酶量(c)反应体积(d)酶反应的温度14 在下列试剂中，那—种可以螯合Ca2+离子?( )(a)EDTA (b)柠檬酸钠(c)SDS (d)EGTA15 在下列工具酶中，那一种可以被EGTA抑制活性?( )(a)S1单链核酸酶(b)末端转移酶(c)碱性磷酸酶(d)Bal31核酸酶16 限制性内切核酸酶可以特异性地识别：( )(a)双链DNA的特定碱基对(b)双链DNA的特定碱基序列(c)特定的三联密码(d)以上都正确17 在下列酶中，催化反应不需要A TP的是( )(a)EcoK (b)EcoB (c)T4DNA连接酶(d)BamHI18 下列关于限制性内切核酸酶的表示方法中，正确一项的是((a)Sau 3A I (b)E．coR I (c)hindⅢ(d)Sau 3A 119 限制性内切核酸酶的星号活性是指：( )(a)在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性(b)活性大大提高(c)切割速度大大加快(d)识别序列与原来的完全不同20 下面哪—种不是产生星号活性的主要原因?( )(a)甘油含量过高(b)反应体系中含有有机溶剂(c)含有非Mg2+的二价阳离子(d)酶切反应时酶浓度过低21 DNA被某种酶切割后，电泳得到的电泳带有些扩散，下列原因哪一项不太可能?( )(a)酶失活(b)蛋白质(如BSA)同DNA结合(c)酶切条件不合适(d)有外切核酸酶污染22 关于回文序列，下列各项中，( )是不正确的(a)是限制性内切核酸酶的识别序列(b)是某些蛋白的识别序列(c)是基因的旁侧序列(d)是高度重复序列23 关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当(a)由作用于同—DNA序列的两种酶构成(b)这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶(c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰(d)不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统四、简答题1 现分离到X82噬菌体的一个突变型，它同野生型的噬菌斑相当不同，并已分离到这两种噬菌体的DNA，请设计—个实验，初步鉴定是点突变、插入突变还是缺失突变?2 说明SangerDNA测序法的原理。