熊果苷在化妆品中应用的研究进展_房军

文章编号:1000-8020(2009)01-0111-03
·综述·
熊果苷在化妆品中应用的研究进展
房军　杜顺晶综述　金银龙审校
中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所,北京　100021
关键词:熊果苷　生理活性　细胞毒性　致突变　化妆品中图分类号:TQ658 文献标识码:A
作者简介:房军,男,博士研究生,研究方向:环境卫生
熊果苷(Arbutin ),[CAS No .497-76-7]即4-羟基苯基-β-D -吡喃葡萄糖苷,又名熊果甙、熊果素、熊果叶甙、熊果酚甙或杨梅甙,是一种源于杜鹃花科熊果属植物———熊果的叶子中分
离的一种苷类化合物。

熊果苷除具有多种药理作用外[1],还是人黑色素细胞中酪氨酸酶的抑制剂,熊果苷能有效地抑制皮肤中的生物酪氨酸酶(tyrosinase )活性,阻断黑色素的形成,通过自身与酪氨酶直接结合,加速黑色素的分解与排泄,从而减少皮肤色素沉积,祛除色斑和雀斑,是目前国内外常用于美白化妆品中的主要原料,国际上已有多个国家将熊果苷应用到化妆品中。

自20世纪90年代初由日本率先应用于化妆品中作为美白添加剂以来,熊果苷的应用已相当广泛,因其美白作用明显,对熊果苷的合成开发和作用机制的研究得到了快速的发展,但对其毒性的研究还很有限。

近年来,由于熊果苷在人们日常生活中的广泛使用,其安全性引起了普遍关注,国内外对熊果苷的研究也更为深入。

1　熊果苷的理化特性
熊果苷的物理性状为白色针状结晶或粉末,易溶于热水、甲醇、乙醇及丙二醇、丙三醇的水溶液,不溶于乙醚、氯仿、石油醚等,熔点:198～201℃,在酸性条件下不稳定,易被水解。

熊果苷有两种差相异构体,即α及β型,化学名称分别为4-羟基苯-α-D -吡喃葡萄糖苷、4-羟基苯-β-D -吡喃葡萄糖苷。

分子式:C 12H 16O 7,分子量:272.25,分子结构为:
目前,β-熊果苷可以通过植物提取、植物细胞培养和人工合成三种方法来制备。

而α-熊果苷一般只能通过不同的微生物的酶进行糖转移反应,让一分子的葡萄糖和一分子的氢醌(hydroquinone ,HQ 即对苯二酚)[CAS No .123-31-9]结合形成单一的α-熊果苷。

2　熊果苷的生理活性及作用机理
2.1　美白去色素作用
黑素是深色素类物质的一种,能引起皮肤的着色,是在黑
素细胞(Melanin )中由苯丙氨酸或酪氨酸经氧化等一系列生化反应生成的。

酪氨酸酶兼具酪氨酸羟化酶活性(催化酪氨酸※多巴)和多巴氧化酶活性(催化多巴※多巴醌),是黑素细胞
合成黑素的关键因素[2]。

国内外绝大多数学者均报道熊果苷具有美白活性,其美白机理为熊果苷对酪氨酸酶产生竞争性及可逆性抑制,从而阻断多巴及多巴醌的合成,进而抑制黑色素的生成,从而达到美白效果。

但熊果苷不影响酪氨酸酶的表达和合成。

熊果苷细胞毒性很低,不影响人黑色素瘤细胞生长的最高浓度为100mg ml 。

在此浓度下,5天后20%黑色素合成受到抑制,其抑制作用呈剂量依赖性[3,4]。

有学者经研究后得出与上述不同的结论。

如NAKAJIMA 等研究表明,熊果苷在浓度0.5～8mmol L 范围内能够使培养的人黑色素瘤中的色素增加,但这种黑色素的增加不是通过增强酪氨酸酶活性来介导的[5],其机理尚在探讨中。

这种差异可能是与熊果苷使用浓度及试验条件有关,并有待于进一步证实。

α-熊果苷是β-熊果苷的差向异构体,其化学名为4-羟苯基-α-D -吡喃葡萄糖苷。

α-熊果苷能够显著降低黑色素瘤细胞中酪氨酸酶活性,使黑色素降至对照组的40%,而且不影响细胞的生存活性[6],α-熊果苷抑制强度为β-熊果苷的10倍[7]。

2.2　抗氧化作用
董钦等采用体外培养人脐静脉内皮细胞ECV2304观察熊果苷对细胞的保护作用,结果表明熊果苷可以抵御H 2O 2所致ECV2304细胞氧化应激损伤[8]。

3　熊果苷的安全性研究
目前,熊果苷的应用日趋广泛,特别是做为美白护肤化妆
品的原料,几乎垄断了发达国家美白护肤市场。

与此同时,人们对熊果苷的研究也不断深入,对于熊果苷的毒性和副作用也提出了质疑。

有研究表明熊果苷在弱酸性条件下很容易水
解产生D -葡萄糖和HQ [9],从而推测进入人体熊果苷将可能
在胃酸条件下水解生成HQ 。

近年来,HQ 对人体健康影响已得到广泛研究讨论,而熊果苷被吸收后会被还原成HQ ,进而以HQ 形式对机体产生伤害,已经成为熊果苷安全性研究的新思路。

3.1　人群暴露
熊果苷是由植物中提取的天然成分,人们在日常生活中可通过多种途径接触到,经食入,吸入,或皮肤接触摄入熊果苷。

含熊果苷的食品种类很多,包括梨、日本辣椒、发霉的土豆、蜂蜜等。

其次,含熊果苷的熊果属植物叶可制成茶叶、粉末或者胶囊,做为中草药用于治疗尿路感染、肾结石、膀胱炎,或用作利尿剂,应用也很广泛。

而目前,最引人关注的则是以
第38卷　第1期2009年　1月
卫　生　研　究
JOURNAL OF HYGIE NE RESEARCH
Vol .38　No .1Jan .　2009111　
熊果苷为原料的美白护肤化妆品的普遍使用,使得人们接触熊果苷的机会和剂量也大大增加。

除此之外,在熊果苷的合成制备和相关行业中的职业暴露风险也不容忽视。

3.2　熊果苷的吸收、代谢和排泄
目前的研究发现熊果苷主要通过胃肠道吸收,在人体和动物体内的代谢过程可能不同。

JAHDODAR等在对雌性Wistar大鼠进行实验,分别给予纯熊果苷的水溶液和熊果叶中的提取液,分别在16小时和30小时后对大鼠尿液进行薄层色谱法,高效液相色谱法和频谱分析,发现82%和100%熊果苷以原型形式排出,占熊果苷口服总剂量的90.7%[9]。

DEISINGER等研究发现,给健康志愿者富含熊果苷饮食和高水平HQ的饮食,结果发现人体血清中HQ及其衍生物(称总HQ)浓度明显升高,两小时后,达到背景浓度的5倍;尿中总HQ排泄率也显着增加,两三个小时达到背景浓度水平的12倍。

而低HQ饮食,人体血浆和尿液中总HQ水平略有下降[10]。

QUINTUA等在2005年的一项研究中给健康志愿者口服熊果叶(主要成分是熊果苷)的提取物水溶液,可见尿中排泄出对苯二酚葡萄糖苷酸、对苯二酚硫酸盐及对苯二酚。

约超过半数的熊果苷在服用后4小时内主要以对苯二酚葡萄糖苷酸和对苯二酚硫酸盐的形式从尿中排泄出来。

75%的熊果苷在服用后24小时内被排泄出去[11]。

SCHINDLER等给两组健康志愿者口服熊果叶提取物制成薄膜衣片和水溶液,观察发现薄膜衣片组尿中有相当于熊果苷总量64.8%的H Q被排泄出来,水溶液组有66.7%被排泄出来。

两组的主要药动学
参数如下,C
max =1.6893和1.1250mmol ml;T
max
=3.60和
4.40h;薄膜衣片组相对于水溶液组的生物利用度为103.3%。

两组的代谢成分未见差异,均为HQ、对苯二酚葡萄糖苷酸、对苯二酚硫酸盐[12]。

3.3　毒理学研究
3.3.1　熊果苷本体毒性　熊果苷是多种化妆品的美白添加剂,因其美白作用明显,人们对其美白作用的重视超过了对其毒性的关注,目前关于熊果苷的毒理学方面的研究还很有限。

3.3.1.1　细胞毒性　1998年CHAKRABORTY的一项研究观察到,黑色素瘤细胞和正常人黑素细胞暴露于100μg ml (0.367mmol L)熊果苷五天,其增长并没有受到抑制,细胞暴露于300μg ml的(1.10mmol L)熊果苷5天后,48小时内观察到细胞从培养皿上剥脱,提示了其细胞毒性[13]。

国内的不少研究也关注到熊果苷的细胞毒性以及与同类化学物功效及细胞毒性的比较。

宋琦如等研究了熊果苷对皮肤黑素细胞的生物学效应,亦表明β-熊果苷有破坏黑素细胞的增殖功能,抑制细胞的生长,提示细胞毒性不容忽视[14]。

研究还发现,β-熊果苷可损伤培养细胞的细胞膜,因此β-熊果苷的用量与其安全性有一定关系[14]。

现β-熊果苷在化妆品中添加用量约为3%,小于此量对皮肤中酪氨酸酶的催化活性的抑制作用较弱,增白作用不明显,大于此含量能明显抑制或损伤细胞生长,从而产生细胞毒性。

还有很多研究者将熊果苷与几种常用的美白添加剂进行了比较研究,张春香等将熊果苷与VC、VC衍生物、HQ、曲酸进行美白活性及毒性比较,观察对酪氨酸酶活性的体外抑制作用及对细胞毒性等进行研究,结果显示熊果苷可能是其中最为安全有效的[15]。

李玲等研究比较了熊果苷、曲酸衍生物、BL-99和氢醌酯对皮肤黑素细胞的细胞毒作用,结果提示4种美白剂均有明显的细胞毒性,其毒作用从大到小依次为氢醌酯>曲酸衍生物BL-99>熊果苷,并提出熊果苷用量以低于70μg ml为宜[16]。

康琰琰等将熊果苷与另外两种天然活性物对黑色素细胞毒性及美白功效进行比较,结果提示熊果苷具有明显的细胞毒性,与之相比,海藻多糖对黑色素细胞活力几乎无影响;3种药物对细胞内酪氨酸酶活性及黑色素合成均有浓度依赖性的抑制作用,且熊果苷的抑制作用高于海藻多糖[17]。

3.3.1.2　生殖发育毒性　ITAB ASHI的研究采用SD大鼠实验,在雄性和雌性SD大鼠交配前和雌性在怀孕和哺乳期间,每日皮下注射熊果苷,剂量为25、100或400mg kg(0.092、0.367或1.47mmol kg),结果提示生殖发育毒性的最高无效应剂量为每天100mg kg[18]。

3.3.1.3　致突变　1996年MULLER等采用仓鼠V79细胞进行熊果苷的遗传毒性试验,结果发现剂量达到0.01mol L (2.73mg ml)仍未观察到基因突变;而如果经过熊果苷与β-糖苷酶预孵育,剂量≥1mmol L即0.3mg ml,则诱发基因突变效应[19]。

有研究者推测这种突变效应可能与熊果苷被β-糖苷酶酶解产生HQ有关。

据2006年MICHAEL等人的研究报道,熊果苷在人工胃液中是稳定的,而在9名志愿者的粪便匀浆中,2mmol L的熊果苷则发生去糖基化反应,完全转换为HQ[20]。

在此基础上进一步的实验结果显示,熊果苷与粪便匀浆中的人体肠道菌种共培养,细枝真杆菌(Eu bacterium ramulu s)、钻黄肠球菌(Enterococcus cass elifla vus)、吉氏类杆菌(Bacteroides distaso nis)及青春双歧杆菌(Bifido bacterium adoles centis),熊果苷均能发生去糖基化反应,反应速率分别是21.08、16.62、8.43及3.59nmol×min-1×(mg protein)-1。

而,熊果苷与小肠粘膜和结肠粘膜的组织匀浆共培养,反应速率则明显降低,分别是0.50和0.09n mol(min·mg prot)。

M ICHAEL的这项研究中同样选择仓鼠V79细胞进行熊果苷的遗传毒性试验,结果发现本不诱导基因突变的熊果苷在加入细枝真杆菌(E.ramulus)或吉氏类杆菌(B.distasonis)的胞浆后则具有强致突变性,而大肠杆菌的胞浆中未检测到具有活性的β-糖苷酶[20]。

这一系列结果提示除β-糖苷酶外可能还有其它途径使熊果苷分解产生HQ,从而构成潜在的危险。

3.3.2　熊果苷代谢物氢醌的毒性
3.3.2.1　皮肤毒性　氢醌对皮肤具有脱色素作用,外用表现刺激反应,引起皮肤红斑、脱屑、痰痒和刺痛感,皮肤过敏,甚至引起永久性损害。

1988年Eastman Kodak公司对H Q的代谢进行了动物试验的研究,对雌雄F344大鼠进行涂皮染毒,HQ 的剂量为25mg kg或150mg kg,24小时即可观察到大鼠皮肤上出现红斑,引起轻到重度不等的刺激反应。

此外,关于HQ 的皮肤致敏性也有相应报道。

在豚鼠最大值法中采用Albino Dunkin-Hartley豚鼠,在2.0%浓度HQ诱导接触后,0.5%浓度HQ即可引起100%动物致敏,结果显示HQ属于极强的致敏物;在小鼠局部淋巴结试验LLNA的试验结果也显示HQ为阳性致敏物[21]。

3.3.2.2　对免疫系统的影响　据报道,高剂量的HQ对小鼠存在免疫抑制的作用,抑制其脾和骨髓细胞的生长。

EASTMOND和PIROZZI等分别用C57BL6、B6C3F1、DB A2三种小鼠进行实验,结果一致显示HQ对骨髓细胞生长有抑制作用,并可能是(暂时的)一过性的[22,23]。

KING等的研究进一步表明HQ抑制小鼠B淋巴细胞前体的生长和分化[24]。

112 卫 生 研 究第38卷
3.3.2.3　对肝、肾的毒性　实验显示,长期摄人HQ 对大鼠和小鼠产生肝、肾损害,引发肾小管细胞腺瘤和肝细胞腺瘤等表
现,而且HQ 有轻度蓄积作用。

KARI 等选用F344 N 大鼠和B6小鼠,通过灌胃染毒进行2年研究,剂量为25100mg kg 。

结果显示HQ 引起实验动物体重减轻,肝肾重量增加。

HQ 对雄性大鼠肾毒性与其剂量有关,表现出不同程度的肾小管上皮变性和再生,肾小球及间质慢性炎症或纤维化[25]。

3.3.2.4　致突变　据报道,HQ 处理的外周血淋巴细胞染色体可以出现非整倍体、多倍体、染色体缺失、姐妹染色单体交换等效应。

利用FISH 技术发现HQ 致HL60细胞7号和9号染色体非整倍体效应,致人淋巴细胞5号和7号染色体长臂缺失。

在人淋巴细胞中也发现了类似现象,而且发现在骨髓
多能造血干细胞中CD +34细胞较CD -34细胞对HQ 更为敏感,且
在人CD +34CD -19骨髓细胞中,HQ 选择性的致7号染色体和5831
缺失,对8号染色体没有影响[26,27]。

持久性染色体结构和数
量上的异常经常在人类白血病中观察到,HQ 的染色体畸变效应是其引起的骨髓或者血液系统异常的基础。

3.3.2.5　致癌　在一项为期两年的致癌活性测定中,结果显示HQ 灌胃(25、50或100mg kg )在雄性F344大鼠可能诱导肾小管细胞腺瘤,雌性F344大鼠可能诱导单个核细胞白血病,在雌性B6C3F1小鼠可能诱导肝腺瘤或癌,在雄性和雌性小鼠,可能诱导甲状腺滤泡细胞增生[28]。

另外,HQ 在Ames 试验中的结果呈阴性,但在中国仓鼠卵巢(CHO )细胞,HQ 诱导姐妹染色单体的交换(加或不加S9)和染色体畸变(加S9);在小鼠l5178y tk 淋巴瘤细胞的微核试验中,HQ 诱导细胞突变[28]。

综上所述,随着研究的不断深人,熊果苷的性质和功用已被人们了解得越来越多,它也越来越广泛地被应用在医疗和美容行业上,但是对其安全性的研究和评价还很欠缺,在熊果苷的使用上持谨慎态度的同时,熊果苷的毒理学及对人体健康影响的研究也值得引起我们的注意。

参考文献
1　郑晓珂,毕跃峰,冯卫生.卷柏化学成分研究[J ].药学学报,
2004,39(4):266-268.
2　IOZU M I K ,HOGANSON G E ,PENNELLA R .R ole of t yrosinase as the
deter2minant of pigmentation in cultured human melanocytes [J ].J Invest Dermatol ,1993,100(6):806-811.
3　丁国斌,陈璧,汤朝武.熊果苷对体外培养的人黑素细胞的作用[J ].第四军医大学学报,2001,22(20):1486-1488.
4　CHAKR ABOR TY A K ,FUNAENKA Y ,KO MOTO M ,et al .Effect of
arbutin on melanogenic proteins in human melanocytes [J ].Pigment Cell Res ,1998,11(4):206-212.
5　N AKAJIMA M ,SHINODA I ,FUKU WATARI Y ,et al .Arbutin
increas es the pigmentation of cultured human melanocytes through mechanis ms other than the induction of tyros inase activity [J ].Pi gment Cell R es ,1998,11(4):12-17.
6　SUGIMOTO K ,NISHI M UR A T ,N OMURA K ,et al .Inhibitory effects of
alpha -arbutin on mel anin s ynthes is in cultured human melanocytes cells and a three -dimensional human s kin model [J ].Bio Pharm Bull ,2004,27(4):510-514.
7　FU NAYAM A M ,AR AKAWA H ,YA MAMOTO R ,et al .Effects of
alpha and beta arbutin on activity of tyrosinase from mushroom and mouse
melanoma [J ].Bioeci Biotechnol Biochem ,1995,59(1):143-144.
8　董钦,张春晶,周宏博,等.熊果苷拮抗H 2O 2损伤的研究[J ].哈
尔滨医科大学学报,2005,8(2):241.
9　J AHDODAR L .Elimination of arbutin from the organis m [J ].Pharmaz ie ,
1983,38(11):780-781.
10　DEISIN GER P J .Human exposure to nat urally occ urring hydroquinone
[J ].Toxicol Environ Health ,1996,47(1):31-46.
11　QUINTUA J ,K OVAR K A ,LINK ,et al .Urinary excretion of arbutin
metabolites after oral adminis tration of bearberry l eaf extracts [J ].Pl anta Med ,2005,71(2):147-152.
12　SCHINDLER G ,PATZAK U ,BRINK HAU S B ,et al .Urinary excretion
and metabolis m of arbutin after oral administration of Arctostaphyl os uvae urs i extract as film -coated tablets and aqueous s ol ution in healthy humans [J ].J Cl in Pharmacol ,2002,42(8):920-927.
13　CHA KR ABOR TY A K .Effect of arbutin on melanogenic proteins in
human melanocytes [J ].Pi gment Cell Res ,11(4):206-212.
14　宋琦如,李吴萍,沈光祖,等.熊果苷对皮肤黑素细胞的生物学效
应[J ].宁夏医学院学报,2004,26(5):313-316.
15　张春香,尹鸿萍,王昊.几种美白活性物质对酪氨酸酶活性的体
外抑制作用及细胞毒性[J ].中国生化药物杂志,2005,26(2):72-75.
16　李玲,宋伟民,周华.4种美白剂对皮肤黑素细胞的细胞毒作用研
究[J ].宁夏医学院学报,2006,28(2):114-116.
17　康琰琰,王一飞.几种天然活性物对黑色素细胞毒性及美白功效
的比较[J ].日用化学工业,2005,35(6):361-363.
18　ITABA SHI M .Reproductive studies with arbutin in rats by subcutaneous
administration (Jpn .)[J ].Iyakuhin Kenkyu ,1988,19(2):282-297.19　MULLER L ,KASPER P .The mutagenic potential of arbutine ,a
naturall y occurring hydroquinone gl ycoside [J ].Mutat Res ,1996,360(3):291-292.
20　MICHAEL B .Mutagenicity of arbutin in mammalian cells after activation
by human intestinal bacteria [J ].Food and Chemical Toxicol ,2006,44:1940-1947.
21　Cos metic Ingredient Review (CIR ).Addendum to the final report on the
s afety ass ess ment of hydroquinone [J ].J Am College Toxicol ,1994,13(3):167-230.
22　EASTM OND D A .An interaction of benzene metabolites reproduces the
myelotoxicity observed with benzene exposure [J ].Toxicol Appl Pharmacol ,1987,91:85-95.
23　PRRO ZZI S J .Prevention of benzene -induced myelotoxicity and
prostaglandin s ynthesis in bne marrow of mice by inhibitors of prostaglandin H s ynthase [J ].Immuno Pharmacol ,1989,18:39-55.24　KING A G .Hydroquinone inhibits bone marrow pre -B cell maturation in
vitro [J ].Mol Pharmacol ,1987,32:807-812.
25　KARI F W .Toxicity and carcinogenicit y of Hydroquinone in F344 N rats
and B6C3F1mice [J ].Food Chem Toxicol ,1992,30:737-747.26　SMIT H M T .Hydroquinone ,a benzene metatabolite ,in creases the level
of aneuso my of c hromosomes 7and 8in human CD34-positive bl ood progenitor cells [J ].Carcinogenes is ,2000,21(8):1485-1490.27　WAYNE S S .The benzene metabolite ,hydroquinone ,selectively induces
5q31-and -7in human CD34+CD19-bone marrow cells [J ].
Experimental Hematol ,2000,28:169-176.
28　N TP (N ational T oxic ol ogy Program ).T oxicology and carcinogenes is studies of
hydroqui none in F344 N rats and B6C3F1mice [R ].T ech R ep ,1989,366.
收稿日期:2008-10-03
第1期房军,等.熊果苷在化妆品中应用的研究进展
113　。